Mediada por CRISPR pérdida de función análisis en gránulo cerebeloso células usando en el útero electroporación basado en la transferencia de genes

El objetivo general de este enfoque de transferencia de genes in vivo basado en la electroporación es evaluar el papel de los genes de interés en la diferenciación de las células granulosas cerebelosas mediante análisis de pérdida de función mediados por CRISPR. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en las neurociencias del desarrollo y las neurooncologías, como la identificación de las moléculas importantes para el desarrollo cerebeloso normal y la formación de tumores cerebrales. El procedimiento de electroporación en el útero será demostrado por la Dra. Lena Herbst, post-doc del laboratorio del profesor Peter Lichter, y luego la siguiente inmunohistoquímica será realizada por el Dr. Weijun Feng, post-doc del laboratorio del Dr. Haikun Di.

La principal ventaja de este método es que se intenta eliminar de manera factible genes de interés en las células cerebelosas, utilizando las tecnologías CRISPR-cas9, en lugar de la generación de la combinación de animales knock-out. Aunque este método puede dar información sobre las funciones de los genes durante el desarrollo cerebeloso normal, también se puede aplicar a otros sistemas, como el desarrollo de otras regiones físicas del cerebro y el modelado de tumores cerebrales. Comience cargando un capilar de vidrio de borosilicato en un extractor de micropipetas y tirando para crear una punta fina.

Etiquete la punta capilar con tinta negra para una mejor visualización durante la inyección y dibuje una escala en el vidrio. Trabajando bajo un microscopio estereoscópico, use una regla y pinzas de aguja afiladas para recortar la punta a una longitud de aproximadamente seis milímetros y crear un borde biselado afilado. Filtre una solución madre verde rápida al 1% a través de un filtro de punto cero de 22 micras para eliminar las partículas de tinte de la solución.

Mezcle los plásmidos de ARN de una sola guía en partes iguales con el plásmido indicador de luciferasa hasta una concentración final de al menos un microgramo por mililitro para cada plásmido. Coloree la solución de plásmido con verde rápido a una concentración final de 0.5%Después de anestesiar a un ratón CD-1 embarazada con isoflurano, coloque al ratón boca arriba sobre una almohadilla térmica y administre analgésico. Aplique ungüento para los ojos para prevenir la sequedad ocular durante la cirugía.

Fije la lente con cinta adhesiva y esterilice el abdomen con un desinfectante. Cubra el ratón con una gasa, dejando solo expuesta el área quirúrgica. Después de hacer una incisión en la piel de unos dos centímetros de longitud, localice la línea alba y utilice unas tijeras de tejido de punta roma para hacer una segunda incisión ligeramente más pequeña a través del peritoneo.

Humedecer la cavidad abdominal abierta con PBS estéril precalentado. A continuación, utilice unas pinzas de anillo para extraer con cuidado los cuernos uterinos de la cavidad abdominal. Agarre la pared uterina en el espacio entre los sacos vitelinos de dos embriones vecinos y tire suavemente.

Evite cualquier presión sobre el embrión mientras tira de él a través de la incisión. Una vez que se hayan extraído los cuernos uterinos, aspire aproximadamente de 10 a 15 microlitros de solución plásmida coloreada con el capilar de vidrio preparado. Evite las burbujas de aire durante este proceso.

Sostenga suavemente el embrión con pinzas de anillo y ubique el área del cuello. Penetra lentamente en el cerebro posterior dorsal con la punta del capilar de vidrio y pasa al cuarto ventrículo. Inyecte aproximadamente un microlitro de la mezcla de plásmidos.

Confirme que el ADN teñido no se ha filtrado del cerebro y es visible como una estructura en forma de diamante. Aquí es muy importante llenar toda la región del cuarto ventrículo con solución de plásmido, para entregar ADN también a la parte distal del primordio cerebeloso. Al mismo tiempo, asegúrese de no causar ningún sangrado durante ese proceso.

Coloque pinzas de platino, equipadas con placas de electrodos de cinco milímetros de diámetro lateralmente sobre la cabeza del embrión, con el polo negativo cubriendo la oreja y el polo positivo colocado en el primordio cerebeloso sobre la pared uterina, y aplique pulsos cuadrados eléctricos. Cuando todos los embriones hayan sido electroporados, coloque cuidadosamente los cuernos uterinos de nuevo en la cavidad abdominal y llénelos con PBS estéril. Deje que los cuernos uterinos se deslicen a una posición natural.

Apague la anestesia y coloque al animal boca abajo en una jaula nueva para que se recupere. Antes de la criosección, fije el cerebelo durante la noche en cinco mililitros de 4% de PFA en PBS por cerebro, a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, transfiera el cerebelo fijo a diez mililitros de sacarosa al 30% en PBS por cerebro, e incube durante la noche a cuatro grados centígrados.

Al día siguiente, después de que el tejido se haya hundido hasta el fondo del tubo, retire los sesos de la sacarosa y absorba la solución de sacarosa restante con un trozo de papel de filtro de celulosa. A continuación, sumerja cada cerebelo en un compuesto de temperatura de corte óptima en un molde de plástico desechable y congele en hielo seco. Corte el bloque criogénico en secciones de 10 micras de grosor, usando un criostato, y mantenga las secciones a menos 80 grados Celsius hasta su uso.

Cuando esté listo para proceder a la inmunotinción, primero seque los portaobjetos a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego lávelos dos veces durante 10 minutos cada vez en PBS. Encierre las secciones en un círculo con un bolígrafo bloqueador de líquidos e incube las secciones en una solución de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente. Agregue anticuerpos primarios contra las moléculas de interés en la solución de bloqueo e incube durante la noche a cuatro grados centígrados.

Lave los portaobjetos con 0.1%Triton que contiene PBS tres veces durante 10 minutos cada uno. A continuación, añada el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos diluido en una solución bloqueante que contenga DAPI, e incube las secciones durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Lave los portaobjetos en PBS-T tres veces durante 10 minutos cada vez, luego monte los portaobjetos y manténgalos a cuatro grados centígrados hasta la obtención de imágenes.

Las células hek293T que expresan de forma estable streptococcus pyogenes cas9 se transfectaron con plásmidos que expresan y se dirigen al sgRNA. La expresión de GFP en células vivas se monitorizó utilizando un generador de imágenes de células fluorescentes 48 horas después de la transfección. Esta imagen muestra una secuencia de sgRNA afectada basada en la expresión de GFP.

Esta imagen muestra la falta de expresión de GFP como resultado de una secuencia de sgRNA no efectiva. Estas imágenes muestran la inmunotinción de GFP, Ki67 y p27 en cerebela de un ratón knock-in p7-rosa26-LSL-cas9 con casete de parada floxado y secuencias bicistrónicas de cas9 y EGFP posteriores, que se sometió a electroporación en E13.5 con un plásmido Cre que expresa sgRNA de control. La sección está contrateñida con DAPI.

Obsérvese las células que expresan GFP en la capa de células granulosas externas marcadas con Ki67. Una vez dominada, esta cirugía se puede realizar en menos de 30 minutos por ratón. Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular el embrión con mucho cuidado, utilizar siempre capilares de punta afilada y colocar los electrodos en el ángulo preciso para asegurar la entrega de los impulsos eléctricos al techo del cuarto ventrículo.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las ciencias médicas exploraran los factores causales de los trastornos neurológicos, incluidos los tumores cerebrales en el cerebelo del ratón.