Análisis de todo el genoma con chip para identificar objetivos específicos para cada isoforma Gene

El objetivo general del siguiente experimento es identificar objetivos genómicos de KDM cinco a Jared uno, un RBB dos histonas desmetilasa. Esto se logra mediante la preparación de cromatina reticulada que se sonica para producir fragmentos de ADN del tamaño adecuado como segundo paso. Los fragmentos de ADN unidos a RBB dos se precipitan inmunológicamente con anticuerpos RBB dos.

A continuación, el ADN genómico recuperado se amplifica mediante PCR para su secuenciación. Por último, las lecturas cortas secuenciadas de Illumina se alinean de forma única con el genoma humano, y los picos significativos se identifican y anotan en los genes más cercanos. Con el fin de identificar dos genes diana de Rrb, se obtienen resultados que muestran funciones moleculares asociadas con Rrb B, dos genes diana basados en la identificación de dos regiones enriquecidas de Rbbb en todo el genoma.

Hola, soy Mike. Ella del laboratorio de la Dra. Elizabeth Bencía en el Departamento de Bioquímica y Genética Molecular de la Universidad de Illinois en Chicago. Y yo soy ala del laboratorio de genómica biomédica dirigido por el Dr.NGA en el Parque de Investigación Biomédica BARCEL Universidad PO P fea.

Y yo soy Danielle Dal. Y yo soy William Richter. Ambos también estamos en el Laboratorio de Habilidades de Benevolencia.

Hoy te vamos a mostrar un procedimiento para la cromatina, la inmunoprecipitación y la secuenciación. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar el sitio de unión de su dermatólogo. Así que comencemos.

Para comenzar este procedimiento, cultive aproximadamente de 10 a la octava celda. Para cada inmunoprecipitación o ip. En este caso, linfoma osteolítico difuso.

Se utilizan células U 9 37 y se inducen para la diferenciación monocítica con TPA durante 96 horas después del crecimiento celular en solución de formaldehído directamente al medio hasta una concentración final del 1%Luego agite brevemente el matraz y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, aspire el medio y enjuague las células con 15 mililitros de PBS helado. Repita este lavado una vez.

A continuación, agregue seis mililitros de tampón de lisis uno a cada uno de los matraces en hielo. A continuación, meca los matraces durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Finalmente, recoja las células con un raspador de células y transfiéralas a tubos cónicos de 15 mililitros.

En este punto, las células se pueden almacenar a menos 80 grados centígrados. Si las células estaban congeladas, deshazte de ellas. Una vez descongelado, gire las células hacia abajo y deseche el snat.

A continuación, vuelva a suspender las células en seis mililitros de tampón de lisis dos, meca los tubos suavemente a temperatura ambiente durante 10 minutos. Repita la centrifugación y vuelva a suspender las células en 2,5 mililitros de tampón de lisis tres. A continuación, prepare la suspensión para la sonicación colocándola en un vaso de precipitados con agua helada con la micropunta de un sonier Branson 450 ajustada a una amplitud de entre el 50 y el 60%.

Sonicar la solución para una ráfaga constante de 32 y enfriar en hielo. Durante un minuto, repita estos pulsos de 10 a 15 veces, luego pipetee el contenido del tubo hacia arriba y hacia abajo y transfiéralo a un nuevo tubo. Continúe pulsando y enfriando la solución.

Cinco veces más después de la sonicación, añadir un 10%Triton X 100 a una décima parte del volumen de la solución. A continuación, transfiera los lisados a tubos de centrífuga de 1,5 mililitros y centrifuga los residuos en una microcentrífuga antes de la cromatina, la inmunoprecipitación o el chip. Guarde 50 microlitros del lisado celular como muestra de entrada.

A continuación, se combinó el lisado celular aclarado con perlas de dyna unidas al anticuerpo que se había preparado previamente como se describe en el protocolo escrito. Agite la mezcla además de la muestra de entrada de 50 microlitros a cuatro grados centígrados durante la noche. Lave las cuentas con un mililitro de tampón de lavado.

A continuación, utilice un soporte magnético para recoger las cuentas y retirar el sobrenadante. Repita este lavado de seis a ocho veces. Realizar un lavado final con un mililitro de TE más 50 milimolares de cloruro sódico.

Gire las perlas en una microcentrífuga después de la centrifugación, aspire cualquier tampón TE residual. A continuación, añada 100 microlitros de tampón elu a las muestras. Inmediatamente después.

Incubar las muestras a 65 grados centígrados durante 10 a 15 minutos. Rasca los tubos contra un tubo de 1,5 mililitros cada dos minutos para mantener las cuentas en suspensión. Recoja las perlas mediante centrifugación y el soporte magnético y transfiera el SNAT a un tubo de PCR.

A continuación, recupere la muestra de entrada guardada anteriormente y añada tres volúmenes del tampón de elución. Finalmente, coloque el IP y las muestras de entrada en el termociclador durante la noche a 65 grados Celsius. Para revertir los enlaces cruzados al día siguiente, agregue un volumen de tampón TE a las muestras.

A continuación, añada los ARN A hasta una concentración final de 0,2 microgramos por microlitro. Incubar las muestras en el termociclador durante una o dos horas a 37 grados centígrados. Después de la incubación, agregue proteinasa K hasta una concentración final de 0,2 microgramos por microlitro.

A continuación, incubar las muestras en el termociclador a 55 grados centígrados durante dos horas. A continuación, extraiga las muestras una vez con un volumen de fenol. Extraiga las muestras por segunda vez con un volumen de alcohol isoamílico de fenilcloroformo.

Finalmente, extraiga las muestras una vez más con un volumen de alcohol isoamílico de cloroformo. A continuación, añada 30 microgramos de glucógeno a cada muestra. Además, agregue cloruro de sodio a una concentración final de 0,2 molar y dos volúmenes de etanol a las muestras.

Incubarlos durante 30 minutos a menos 80 grados centígrados. Después de la incubación, gire las muestras y decante el snat. Lavar los pellets con 500 microlitros de etanol al 75%, luego secar los pellets y volver a suspenderlos en 40 microlitros de agua.

Para comprobar el tamaño de los fragmentos de ADN producidos por el procedimiento de sonicación, cargue cinco microgramos de la muestra de entrada purificada en un agrogel al 1,8% y ejecute el gel. El procedimiento de sonicación debe producir fragmentos en el rango de 150 a 350 pares de bases. Sin embargo, si los fragmentos no se encuentran en este rango, el procedimiento de sonicación debe ajustarse variando el número de ráfagas y la amplitud antes de la amplificación del ADN genómico.

Verifique el tamaño, la concentración y el enriquecimiento de las muestras como se describe en el protocolo escrito. Para comenzar la amplificación del ADN genómico, obtenga 34 microlitros de la muestra IP y 200 nanogramos de la muestra de entrada. Realice y repare la adición y ligadura de adaptadores a fragmentos de ADN utilizando un kit de preparación de muestras de ADN genómico de Illumina como se describe en el protocolo escrito.

Purifique el ADN utilizando un kit de purificación de PCR mini lut y luego elulúyalo en un tampón EB que haya sido precalentado a 50 grados Celsius. Utilice 23 microlitros y 46 microlitros para las muestras de IP y ADN de entrada, respectivamente. Realice la reacción PCR utilizando 23 microlitros de ADN con adaptadores de 25 microlitros de fusión, ADN polimerasa del kit.

Un microlitro de 20 micromolares suela PCR uno y un microlitro de 20 micromolares. Por lo tanto, la PCR dos ejecuta la reacción de PCR como se describe en el protocolo escrito después de la amplificación de PCR. Purifique el ADN con el kit de purificación de PCR de mini bucle Qiagen.

Precalentar 15 microlitros de tampón EB a 50 grados centígrados y diluir el ADN, diluir 0,5 microlitros de la muestra uno a cuatro y realizar una lectura de NanoDrop para purificar los productos amplificados. Prepare un gel de AGROS al 1.8% de 50 mililitros con agua de grado HPLC, agregue TAE y bromuro después de que el agros se haya derretido. Luego vierta el gel, cargue el gel.

Después de agregar cuatro microlitros de tampón de carga a las muestras de entrada e IP, haga funcionar el gel a 120 voltios durante 45 minutos. Analice el gel después de ejecutarlo. Esto debería revelar que se producen fragmentos en el rango entre 150 y 350 pares de bases.

Representan fragmentos de ADN genómico de entre 50 y 250 pares de bases de longitud. Y un adaptador extirpa la región de gel que contiene el material en el rango de 150 a 350 pares de bases con un bisturí. Tenga cuidado de evitar extirpar la banda del adaptador del adaptador, que funciona con aproximadamente 120 pares de bases.

Recupere el ADN usando un kit de extracción rápida de gel para kayak según las instrucciones del fabricante. Seque la muestra hasta exactamente 11 microlitros en una velocidad de retroceso sin calor. Extraiga un microlitro de la muestra y mida la concentración de ADN con un espectrofotómetro NanoDrop.

Por último, identifique los productos génicos enriquecidos utilizando el analizador de genomas Illumina y analice los sitios de unión y los genes diana tal y como se describe en el protocolo escrito. Las coordenadas genómicas de la proteína de unión RB enriquecida identificada dos o de las regiones de unión RBP dos se presentan en un formato cromosómico. Las ocupaciones de los genes del conjunto en los cromosomas se pueden visualizar como VAR negros.

Aquí se muestran las ocupaciones del cromosoma 10 rbp, dos regiones de unión se muestran como líneas verticales. El panel central muestra todas las dos regiones de unión de isoformas rbp en el cromosoma 10, y el panel inferior muestra las dos regiones de unión de isoformas grandes de rbp. Esta información proporciona una visión general de la superposición y la ocupación específica de las dos isoformas de RBP en el cromosoma 10.

Aquí se muestra un mapa de calor con la tasa de falsos descubrimientos o la ontología génica significativamente enriquecida corregida por FDR o las categorías de función molecular go entre los genes unidos por rbp. Dos colores hacia el rojo indican una alta significación estadística. El amarillo indica una significación estadística baja y el gris indica que no hay significación estadística.

El análisis de enriquecimiento muestra la superposición y las funciones moleculares específicas de la isoforma de R BP, dos genes diana. Acabamos de mostrarle cómo identificar los sitios de unión de factores de transcripción durante este procedimiento. Es importante producir fragmentos de ADN del rango de tamaño y rendimiento adecuados.

Esto se puede lograr siguiendo nuestras pautas durante el paso de SONICACIÓN. Así que eso es todo. Buena suerte con tus experimentos y gracias por mirar.