Name: Análisis de todo el genoma con chip para identificar objetivos específicos para cada isoforma Gene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Aprende a identificar objetivos genómicos de la histona demetilasa KDM5A/JARID1A/RBP2 mediante ChIP-Seq. Este método permite analizar interacciones proteína-ADN y estudiar regulación epigenética en células humanas.

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Este trabajo fue apoyado por 115 347-RSG-08-271-01-GMC de ACS, y por CA138631 subvención de los NIH.

El protocolo fue adaptado originalmente de B. Ren, 2001. Que representa una ligera modificación del protocolo de Odom et al. 5, que se puede encontrar en <a href="http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads">http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads</a> 1. Pre-bloque y la unión del anticuerpo a perlas magnéticas (En caso de llevarse a cabo la noche antes de que el siguiente paso) <ol><li> Lavado de 100 L de Dynabeads proteína G (por IP, se combinan para múltiples IPs) en 1 ml de agua dulce BSA / PBS solución (50 mg de BSA en 10 ml de PBS-Esta solución tendrá una duración de una semana). </li><li> Recoge las cuentas con un soporte magnético y repetir el procedimiento de lavado dos veces más. </li><li> A continuación, agregar 10 mg de anticuerpos frente a 250 l de la suspensión de cuentas en PBS / BSA solución (por IP) e incubar durante la noche sobre una plataforma giratoria a 4 ° C. </li><li> Al terminar, lavar las cuentas tres veces en 1 ml de la solución de PBS / BSA y luego volver a suspender en 10 l de la solución de PBS / BSA (por IP). </li></ol> 2. Células de entrecruzamiento <ol><li> Para iniciar este procedimiento, creciendo aproximadamente 10 8 células por inmunoprecipitación, o IP. Aquí, difusa histiocitos U937 linfoma se utilizan y se indujo la diferenciación de monocitos con TPA durante 96 horas. </li><li> Siguiendo el crecimiento celular, agregar una solución de formaldehído directamente a los medios de comunicación a una concentración final de 1%. Luego, haga girar la breve frascos y les permitan permanecer a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, aspirar los medios de comunicación y aclarar las células con 15 ml de helado de PBS. Repetir este lavado una vez. </li><li> A continuación, añadir 6 mL de tampón de lisis 1 (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% de glicerol, 0,5% NP-40, 0,25% de Triton X-100, que contiene inhibidores de la proteasa) para cada uno de los frascos en el hielo. Entonces, el rock los frascos durante 20 minutos a 4 ° C. </li><li> Por último, la cosecha de las células utilizando un rascador de células y transferirlos a tubos cónicos de 15 ml. En este punto, las células pueden ser almacenadas a -80 ° C. </li></ol> 3. Sonicación celular <ol><li> Si las células fueron congeladas, a descongelarse. Una vez descongelado, girar las células hacia abajo a 3.000 rpm durante 10 minutos a 4 ° C y descartar el sobrenadante. A continuación, volver a suspender las células en 6 ml de tampón de lisis 2 (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, que contienen inhibidores de la proteasa). Roca de los tubos suavemente a temperatura ambiente durante 10 minutos. </li><li> Repetir la centrifugación y se resuspenden las células en 2,5 ml de tampón de lisis 3 (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,1% de desoxicolato de sodio, 0,5% de N-lauroylsarcosine, que contienen inhibidores de la proteasa) . </li><li> A continuación, preparar la suspensión de ultrasonidos, colocándolo en un vaso de agua helada con la micropunta de un Sonifier Branson 450 establece que entre el 50 y el 60% de la amplitud. </li><li> Sonicar la solución para un estallido constante de 30 segundos y enfriar en hielo durante 1 minuto. Repita estos pulsos de 10 a 15 veces. Luego, pipeta el contenido del tubo de arriba a abajo y transferirlos a un nuevo tubo. Siguen el pulso y enfriar la solución de un adicional de 5 veces. </li><li> Después de sonicación, añadir 10% de Triton X-100 a 1 / 10 del volumen de la solución. La transferencia de los lisados ​​a tubos de 1,5 ml de centrífuga, y el giro de los escombros en una microcentrífuga. Luego transferir el lisado celular a un tubo nuevo. </li></ol> 4. Inmunoprecipitación de cromatina <ol><li> Antes de la inmunoprecipitación de la cromatina, o chip, ahorrar un 50 l del lisado celular como la muestra de entrada. Luego, combine el lisado celular aclarado con Dynabeads pre-unida al anticuerpo que han sido previamente preparado como se describió anteriormente. Roca de la mezcla, además de la muestra de entrada de 50 l, a 4 ° C durante la noche. </li><li> Lavar las perlas con 1 mL del tampón de lavado (50 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 0,5 M LiCl, 1 mM EDTA, 0,7% desoxicolato de sodio, 1% NP-40). Luego, utilice un soporte magnético para recoger las cuentas y eliminar el sobrenadante. Repita este lavado de 6 a 8 veces. </li><li> Realizar un lavado final con 1 ml de TE-plus-50 mM de NaCl (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA). Girar las bolas en una microcentrífuga a 3.000 rpm durante 2 minutos a 4 ° C. Después del centrifugado, aspirar cualquier residuo de buffer TE. </li><li> A continuación, añadir 100 ml de tampón de elución (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% SDS) a las muestras. Inmediatamente después, incubar las muestras a 65 ° C durante 10 a 15 minutos. Cero de los tubos contra un soporte de tubos de 1,5 ml cada 2 minutos para mantener las cuentas en la suspensión. </li><li> Recoge las cuentas usando la centrifugación y el soporte magnético, y la transferencia del sobrenadante a un tubo de PCR. A continuación, recuperar la muestra de entrada guardada anteriormente y agregar 3 volúmenes de tampón de elución. </li><li> Por último, coloque las muestras de IP y de entrada en el termociclador durante la noche a 65 ° C arevertir las relaciones cruzadas. </li><li> Al día siguiente, agregue un volumen de buffer TE a las muestras. A continuación, añadir RNasa A a una concentración final de 0,2 mg / mL. Incubar las muestras en el termociclador durante 1 a 2 horas a 37 ° C. </li><li> Después de la incubación, añadir proteinasa K a una concentración final de 0,2 mg / mL. A continuación, se incuban las muestras en el termociclador a 55 ° C durante 2 horas. </li><li> A continuación, el extracto de las muestras una vez con un volumen de fenol. Extraer las muestras por segunda vez con un volumen de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico. Finalmente, el extracto de las muestras una vez más, con un volumen de cloroformo: alcohol isoamílico. </li><li> A continuación, añadir 30 g de glucógeno a cada muestra. Además, añade NaCl a una concentración final de 0,2 volúmenes molares y dos de etanol a las muestras. Incubar por 30 minutos a -80 ° C. Después de la incubación, girar las muestras y recoger el sobrenadante. Lavar los pellets con 500 l de etanol al 75%. A continuación, los pellets seco y volver a suspender en 40 ml de agua. </li><li> Para comprobar el tamaño de los fragmentos de ADN producidos por el procedimiento de ultrasonidos, la carga de 5 mg de la muestra de entrada purificado en un 1,8% en gel de agarosa y ejecutar el gel. El procedimiento de ultrasonidos que producen fragmentos en el rango de 150-350 pares de bases. Sin embargo, si los fragmentos no están en este rango, el procedimiento de ultrasonidos debe ser ajustada por la variación del número de explosiones y la amplitud. </li><li> Para comprobar la solidez y la especificidad del chip, el enriquecimiento de las regiones controlan el enlace mediante la realización de los genes específicos de PCR con 1 l de las muestras de IP y una serie de diluciones de la muestra de entrada. Dos o tres "consolidados" las regiones y una región de control independiente deben ser seleccionados con el fin de probar la calidad de las muestras de IP y de entrada. </li></ol> 5. Amplificación de ADN genómico <ol><li> A partir de 34 l de la muestra IP o 200 ng de la muestra de entrada, realizar la reparación final, 'A' además de la cola y la ligadura de los adaptadores a los fragmentos de ADN utilizando ADN genómico preparación de muestras Kit <a href="http://www.illumina.com/systems/genome_analyzer.ilmn">http://www.illumina.com/systems/ genome_analyzer.ilmn</a> (Illumina, Inc., San Diego, CA). </li><li> Purificar el ADN utilizando un kit de PCR Purificación MinElute y luego eluir en tampón EB (10 mM Tris Cl, pH 8,5) que ha sido previamente calentada a 50 ° C. Por ejemplo, utilice 23 ly 46 l para la elución final de la IP y las muestras de ADN de entrada, respectivamente. </li><li> Que la reacción de PCR utilizando 23 L de ADN con los adaptadores, y 25 de la polimerasa de ADN l Phusion del kit, 1 l de 20 mM Sol_PCR_1, y 1 l de 20 mM Sol_PCR_2. Ejecutar la reacción de PCR de la siguiente manera: 1) 30 segundos a 98 ° C, 2) 10 segundos a 98 ° C, 3) 30 segundos a 65 ° C, 4) 30 segundos a 72 ° C, repitiendo los pasos pasos 2-4 18 veces y luego 5 minutos a 72 ° C, finalmente, mantenimiento a 4 ° C. </li><li> Después de la amplificación por PCR, purificar el ADN con el kit de QIAGEN MinElute Purificación de PCR. Pre-caliente 15 l de tampón EB a 50 ° C y eluir el ADN. Diluir 0,5 l de la muestra 1:4 y realizar una lectura Nanodrop. </li></ol> 6. Gel de purificación de los productos amplificados <ol><li> Para purificar los productos amplificados, preparar un gel de agarosa al 1,8% de 50 ml con agua grado HPLC. Añadir TAE y bromuro de etidio después de la agarosa se haya derretido. Luego, vierta el gel. Cargar el gel después de añadir 4 l de tampón de carga a la entrada y las muestras de IP. A continuación, ejecute el gel a 120 voltios durante 45 minutos. </li><li> Analizar el gel después de que se ha ejecutado. El gel debe revelar que los fragmentos en el rango entre 150 y 350 pares de bases se producen. Que representan fragmentos de ADN genómico de entre 50 y 250 pares de bases de longitud y un adaptador. </li><li> Impuestos Especiales de la región del gel que contiene el material en el rango de 150 350 pares de bases con un bisturí. Tenga cuidado para evitar la escisión de la banda adaptador adaptador, que se cifra en unas 120 pares de bases. Recuperar el ADN utilizando un kit de extracción de gel QIAquick las instrucciones del fabricante. En concreto, el uso de una columna del kit de extracción QIAquick Gel para una rebanada de gel de 400 mg o menos. Para comenzar el proceso de extracción, agregar 3 volúmenes de buffer QG a un volumen de gel. Añadir 1 volumen de isopropanol y la carga de la mezcla en la columna. Use 0,5 ml de QG para lavar la columna, seguido por el procedimiento estándar descrito en el juego de manual. Use H 2 O pre-calentado a 50 ° C para eluir el ADN. Incubar la columna con 30 l de H 2 O durante 5 minutos a 37 ° C antes de girar hacia abajo. </li><li> Secar la muestra hasta 11 l, precisamente en un Speedvac sin calor. Quitar una L de la muestra y medir la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro Nanodrop. </li><li> Por último, identificar los productos enriquecidos con el gen del genoma Illumina AnalyzerIIe como se describe en <a href="http://genesdev.cshlp.org/content/suppl/2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf">http://genesdev.cshlp.org/content/suppl</a>/ 2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf 6. </li></ol> 7. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. El objetivo general de la siguiente experimento consiste en identificar los objetivos de la genómica KDM5A/JARID1A/RBP2 desmetilasa histonas. (P1) Esto se logra mediante la preparación de enlaces cruzados de la cromatina que se somete a sonicación para producir fragmentos de ADN de tamaño apropiado. (P2) En un segundo paso, RBP2 fragmentos de ADN están obligados immunoprecipitated con RBP2 anticuerpos. (P3) A continuación, los fragmentos de ADN recuperado se reparan en los extremos y los adaptadores se ligan a los extremos de ADN genómico para preparar las bibliotecas de ADN genómico para el análisis de las células de flujo en la estación de racimo Illumina. Las bibliotecas de ADN amplificado por PCR utilizando bajo número de ciclos. (P4) Por último, Illumina secuencia corta lee son los únicos alineados con el genoma humano, los picos que se detecten y anotadas, en el más genes a fin de identificar RBP2 regiones enriquecidas. (P5) Los resultados se obtienen que muestran las funciones moleculares asociados con RBP2 genes diana sobre la base de todo el genoma de identificación de RBP2 regiones enriquecidas. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Comprobar los resultados de la cromatina sonicación Para comprobar el tamaño de los fragmentos de ADN producidos por el procedimiento de ultrasonidos, 5 g (1 / 10) de la muestra de entrada purificada fue cargado en un 1,8% en gel de agarosa. Como era de esperar, nuestro proceso de sonicación produjo fragmentos en el rango de 150-350 pb. Sin embargo, si los fragmentos no están en este rango, el procedimiento de ultrasonidos debe ajustarse en consecuencia, variando el número de explosiones y la amplitud. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Purificación en gel de los productos amplificados. Los productos de PCR se ejecutan en un gel para eliminar los adaptadores y seleccione un tamaño de gama de plantillas para la generación de plataformas de cluster. Este gel muestra que los fragmentos en el rango entre 150 y 350 pares de bases se produjeron. Que representan fragmentos de ADN genómico de entre 50 y 250 pares de bases de longitud y un adaptador. Estamos sujetos a impuestos especiales de la región seleccionada de gel con un bisturí. Se debe tener cuidado para evitar que la banda adaptador adaptador, que se cifra en unas 120 pares de bases. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Isoforma de anticuerpos específicos permite distinguir entre las isoformas de grandes y pequeños de RBP2. RBP2 estructura de la proteína se presenta en el punto de vista del dominio. RBP2 contiene varios dominios: el catalizador histona desmetilación JmjC dominio y asociados JmjN de dominio, un dominio de ÁRIDAS capaz de secuencia específica de unión al ADN, un dedo de zinc C5HC2 que potencialmente pueden interactuar con el ADN o las proteínas, y varios dominios PHD. Los dos anticuerpos anti-RBP2 que permiten distinguir entre RBP2 isoformas se obtuvieron en contra de la RBP2 fragmentos indicado por líneas gruesas. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5a.jpg" alt="Figura 5a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5a"> Figura 5a. Resumen de RBP2 regiones de unión a lo largo de los cromosomas y los genes con Ensembl. Coordenadas de Genómica identifica enriquecida RBP2 (todas las isoformas y la isoforma de gran tamaño) se presentan regiones de unión de cromosomas sabio. Occupances de genes Ensembl (versión 54; hg18) en los cromosomas (el cromosoma 10, en esta imagen) se presentan como barras de color negro (arriba). Cada región está representada RBP2 vinculante como una línea vertical, en el panel central muestra todas las isoformas RBP2 regiones de unión en el cromosoma 10, y el panel inferior muestra RBP2 regiones isoforma vinculante grandes. El centro y los paneles inferiores con un resúmen de la superposición y la ocupación específica de RBP2 isoformas en el cromosoma 10. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5b.jpg" alt="Figura 5b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5b"> Figura 5b. El análisis de enriquecimiento funcional de los genes diana RBP2. Heatmap mostrando FDR corregida de forma significativa (valor de p ≤ 0,05) enriquecido GO categorías de función molecular entre los genes vinculados (más genes de la región de unión RBP2) por RBP2 (isoformas de todos y de gran tamaño). Colores hacia el rojo indican significación estadística alta, color amarillo indica significación estadística baja, y el gris indica que no hay significación estadística. El análisis de enriquecimiento muestra la superposición de funciones específicas y la isoforma molecular de los genes diana RBP2.

<ol><li>Wang, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+malignancies+caused+by+dysregulation+of+a+chromatin-binding+PHD+finger%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic malignancies caused by dysregulation of a chromatin-binding PHD finger.</a> Nature. 459 (7248), (2009).</li>
<li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+pRB+to+the+PHD+protein+RBP2+promotes+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Binding of pRB to the PHD protein RBP2 promotes cellular differentiation.</a> Mol Cell. 18 (6), 623-623 (2005).</li>
<li>Lopez-Bigas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+the+H3K4+histone+demethylase+RBP2+reveals+a+transcriptional+program+controlling+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of the H3K4 histone demethylase RBP2 reveals a transcriptional program controlling differentiation.</a> Mol Cell. 31 (4), 520-520 (2008).</li>
<li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K4+demethylases+are+essential+in+development+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone H3K4 demethylases are essential in development and differentiation.</a> Biochem Cell Biol. 85 (4), 435-435 (2007).</li>
<li>Odom, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303 (5662), 1378-1378 (2004).</li>
<li>Guenther, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+chromatin+at+genes+encoding+stem+cell+regulators+in+human+mixed-lineage+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Aberrant chromatin at genes encoding stem cell regulators in human mixed-lineage leukemia.</a> Genes Dev. 22 (24), 3403-3403 (2008).</li>
</ol>

Las diferencias funcionales entre las isoformas RBP2 no se han determinado. Hemos utilizado un enfoque integral para identificar las regiones genómicas obligado por RBP2 isoformas y definir las categorías funcionales que estas regiones representan. Esto se logró por chip-Seq análisis, seguidas de análisis bioinformático de la secuencia obtenida se lee. RBP2 modifica metilado residuos de lisina en las colas de las histonas. Hemos encontrado que RBP2 isoforma grande que contiene el módulo de reconocimiento de las histonas metiladas isoforma pequeña lisina y RBP2 que carecen de este módulo se unen a las diferentes regiones en el genoma humano (Figura 5). Es importante destacar que la isoforma específica de las regiones y las regiones con áreas pertenecen a los genes con diferentes funciones moleculares (Figura 5). Por ejemplo, &quot;la cromatina vinculante&quot; y &quot;factor de transcripción vinculante&quot; se pueden atribuir a los objetivos del gen de la isoforma RBP2 pequeño, pero no de la isoforma RBP2 grandes (Figura 5). Al comparar los genes reales conjuntos generados para todas las isoformas y RBP2 isoforma de gran tamaño (datos no mostrados), también puede definir si la isoforma grande es contratado específicamente a ciertos genes.

Secuencias de ADN de 2006 Illumina, Inc. Todos los derechos reservados. <ul><li> Sol_PCR_1 Secuencia 5&#39;-AAT GAT ACG GCG CAC CAC GAG ATC TAC CTT ACT TCC CAC GAC CTA GCT CTT CCG ATC T-3 &#39; </li><li> Sol_PCR_2 Secuencia 5&#39;-CAA GGC GCA GAA GAC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T-3 &#39; </li></ul>

análisis de todo el genoma con chip para identificar objetivos específicos para cada isoforma gene

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

El reclutamiento de factores de transcripción y epigenéticas de sus objetivos es un paso clave en su regulación. Un lugar destacado en la contratación son los dominios de la proteína que se unen a determinadas modificaciones de las histonas. Un dominio, es la planta de homeodominio (PHD), que se encuentra en varias proteínas de unión a la cromatina. El factor de RBP2 epigenética tiene múltiples dominios PHD, sin embargo, tienen funciones diferentes (Figura 4). En particular, el C-terminal de dominio PHD, que se encuentra en una fusión RBP2 oncogénico en la leucemia humana, se une a trimetiladas lisina 4 de la histona H3 (H3K4me3) 1. La transcripción que corresponde a la isoforma RBP2 que contiene el PHD C-terminal se acumula durante la diferenciación de promonocítica, el linfoma de origen, las células U937 en monocitos 2. De acuerdo con ambos conjuntos de datos de todo el genoma análisis mostró que en las células U937 diferenciadas, la proteína RBP2 se localiza en regiones genómicas altamente enriquecido para H3K4me3 3. Localización de RBP2 de sus objetivos se correlaciona con una disminución en H3K4me3, debido a la actividad RBP2 desmetilasa histonas y una disminución en la actividad transcripcional. Por el contrario, otros dos doctorados de RBP2 son incapaces de unirse H3K4me3. Cabe destacar que el dominio C-terminal de la PHD RBP2 está ausente en los más pequeños RBP2 isoforma 4. Es concebible que la isoforma pequeña RBP2, que carece de la interacción con H3K4me3, difiere de la isoforma más grande en la localización genómica. La diferencia en la localización genómica de RBP2 isoformas puede dar cuenta de la diversidad observada en RBP2 función. En concreto, RBP2 es un jugador fundamental en la diferenciación celular mediada por la proteína retinoblastoma (pRB). De acuerdo con estos datos, el análisis anterior, todo el genoma, sin distinción entre las isoformas, se identificaron dos grupos distintos de RBP2 genes diana: 1) los genes vinculados por RBP2 de una manera que es independiente de la diferenciación, 2) los genes vinculados por RBP2 en una diferenciación manera dependiente. Para identificar las diferencias en la localización entre las isoformas se realizó en todo el genoma análisis de la ubicación por chip-Seq. El uso de anticuerpos que detectan tanto RBP2 isoformas se han localizado todos los RBP2 objetivos. Además tenemos los anticuerpos que se unen sólo grandes y pequeños no RBP2 isoforma (Figura 4). Después de identificar los objetivos de la isoforma grandes, uno se puede quitar de todos los RBP2 objetivos para revelar los objetivos de la isoforma pequeña. Estos datos muestran la contribución de la cromatina, la interacción de dominio en el reclutamiento de proteínas para sus sitios de unión en el genoma.

Aquí estamos presentando una inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) Procedimiento para el análisis de localización en todo el genoma de las isoformas de la proteína que se diferencian en un dominio de unión a las histonas. Estamos aplicando a CHIP-Seq análisis para identificar los objetivos de la histona desmetilasa KDM5A/JARID1A/RBP2.

Análisis de todo el genoma con chip para identificar objetivos específicos para cada isoforma Gene

El reclutamiento de factores transcripcionales y epigenéticos hacia sus dianas es un paso fundamental en su regulación. Entre los elementos que destacan en el reclutamiento se encuentran los...

El objetivo general del siguiente experimento es identificar los blancos genómicos de KDM cinco a Jared uno, una histona desmetilasa RBB dos. Esto se logra mediante la preparación de cromatina reticulada que se sonicada para producir fragmentos de ADN del tamaño adecuado como segundo paso. Los fragmentos de ADN unidos a RBB dos se inmunoprecipitan con anticuerpos contra RBB dos.A continuación, el ADN genómico recuperado se amplifica mediante PCR para su secuenciación. Finalmente, las lecturas cortas secuenciadas por Illumina se alinean de manera única al genoma humano, y se identifican picos significativos que se anotan a los genes más cercanos. Con el fin de identificar los dos genes diana de Rbbb, se obtienen resultados que muestran funciones moleculares asociadas con los genes diana de Rrb B dos, basándose en la identificación a nivel del genoma completo de regiones enriquecidas para Rbbb dos.Hola, soy Mike. Ella del laboratorio de la Dra. Elizabeth Bencia en el Departamento de Bioquímica y Genética Molecular de la Universidad de Illinois en Chicago. Y soy ala del laboratorio de genómica biomédica dirigido por la Dra. NGA en el Parque de Investigación Biomédica BARCEL de la Universidad PO P fea.Y yo soy Danielle Dal. Y yo soy William Richter. Ambos también estamos en el Laboratorio de Habilidades de Benevolencia.Hoy les mostraremos un procedimiento para la inmunoprecipitación y secuenciación de cromatina. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar el sitio de unión de su dermatólogo. Así que comencemos.Para comenzar este procedimiento, cultive aproximadamente 10 a la octava potencia de células por cada inmunoprecipitación o IP. Aquí, linfoma osteolítico difuso.Se utilizan células U 937 y se inducen para la diferenciación monocítica con TPA durante 96 horas tras el crecimiento celular. Añada directamente solución de formaldehído al medio hasta alcanzar una concentración final de 1 %. A continuación, agite brevemente el frasco y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego aspire el medio y enjuague las células con 15 mililitros de PBS frío con hielo. Repita este lavado una vez.A continuación, agregue seis mililitros del tampón de lisis uno a cada uno de los frascos sobre hielo. Luego, agite suavemente los frascos durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Finalmente, recoja las células utilizando un raspador celular y transfiéralas a tubos cónicos de 15 mililitros.En este momento, las células pueden almacenarse a menos 80 grados Celsius. Si las células fueron congeladas, déselas. Una vez descongeladas, centrifugue las células y deseche el sobrenadante.Luego, resuspenda las células en seis mililitros de tampón de lisis dos y agite suavemente los tubos a temperatura ambiente durante 10 minutos. Repita la centrifugación y resuspenda las células en 2,5 mililitros de tampón de lisis tres. A continuación, prepare la suspensión para la sonicación colocándola en un vaso con agua helada, utilizando la micropunta de un sonificador Branson 450 ajustado a una amplitud entre 50 y 60 %.Sonicar la solución durante una ráfaga constante de 32 segundos y enfriar en hielo. Durante un minuto, repetir estos pulsos de 10 a 15 veces, luego pipetear el contenido del tubo hacia arriba y hacia abajo y transferirlo a un tubo nuevo. Continuar pulsando y enfriando la solución.Cinco veces adicionales tras la sonicación, añada Triton X-100 al 10 % a un décimo del volumen de la solución. Luego transfiera los lisados a tubos de centrífuga de 1,5 mililitros y centrifugue para eliminar los residuos en una microcentrífuga antes de la inmunoprecipitación de cromatina o el análisis por chip. Guarde 50 microlitros del lisado celular como la muestra de entrada.Luego, combinar el lisado celular clarificado con perlas Dyna unidas a anticuerpo que se habían preparado previamente según se describe en el protocolo escrito. Agitar la mezcla junto con la muestra de entrada de 50 microlitros a cuatro grados Celsius durante la noche. Lavar las perlas con un mililitro de tampón de lavado.Luego, use un soporte magnético para recoger las perlas y elimine el sobrenadante. Repita este lavado de seis a ocho veces. Realice un lavado final con un mililitro de TE más 50 milimolares de cloruro de sodio.Centrifugar las perlas en una microcentrífuga tras la centrifugación y aspirar cualquier tampón TE residual. A continuación, añadir 100 microlitros de tampón de elución a las muestras. Inmediatamente después.Incube las muestras a 65 grados Celsius durante 10 a 15 minutos. Raspe los tubos contra un soporte para tubos de 1,5 mililitros cada dos minutos para mantener las perlas en suspensión. Recopile las perlas mediante centrifugación y el soporte magnético y transfiera el SNAT a un tubo de PCR.Luego, recupere la muestra de entrada previamente guardada y agregue tres volúmenes del tampón de elución. Finalmente, coloque las muestras de IP y de entrada en el termociclador durante la noche a 65 grados Celsius. Al día siguiente, para revertir los enlaces cruzados, agregue un volumen de tampón TE a las muestras.Luego, agregue ARN A hasta una concentración final de 0,2 microgramos por microlitro. Incube las muestras en el ciclador térmico durante una a dos horas a 37 grados Celsius. Tras la incubación, agregue proteinasa K hasta una concentración final de 0,2 microgramos por microlitro.A continuación, incubar las muestras en el termociclador a 55 grados Celsius durante dos horas. Luego, extraer las muestras una vez con un volumen de fenol. Extraer las muestras una segunda vez con un volumen de fenol cloroformo alcohol isoamílico.Finalmente, extraiga las muestras una vez más con un volumen de cloroformo-isoamil alcohol. Luego, agregue 30 microgramos de glicógeno a cada muestra. Además, agregue cloruro de sodio hasta una concentración final de 0,2 molar y dos volúmenes de etanol a las muestras.Incubar durante 30 minutos a menos 80 grados Celsius. Después de la incubación, centrifugar las muestras y decantar el sobrenadante. Lavar los pellet con 500 microlitros de etanol al 75%, luego secar los pellet y resuspenderlos en 40 microlitros de agua.Para verificar el tamaño de los fragmentos de ADN producidos por el procedimiento de SONICACIÓN, cargue cinco microgramos de la muestra de entrada purificada en un gel de agarosa al 1,8 % y corra el gel. El procedimiento de sonicación debe producir fragmentos en un rango de 150 a 350 pares de bases. Sin embargo, si los fragmentos no se encuentran dentro de este rango, el procedimiento de sonicación debe ajustarse variando el número de ráfagas y la amplitud antes de la amplificación del ADN genómico.Verifique el tamaño, la concentración y el enriquecimiento de las muestras según se describe en el protocolo escrito. Para iniciar la amplificación del ADN genómico, obtenga 34 microlitros de la muestra de IP y 200 nanogramos de la muestra de entrada. Realice y repare la adición de cola y la ligación de adaptadores a los fragmentos de ADN utilizando un kit de preparación de muestras de ADN genómico de Illumina según se describe en el protocolo escrito.Purifique el ADN utilizando un kit de purificación de PCR en mini columna y luego elúyalo en tampón EB que se ha precalentado a 50 grados Celsius. Utilice 23 microlitros y 46 microlitros para las muestras de ADN de IP y de entrada, respectivamente. Realice la reacción de PCR usando 23 microlitros de ADN con los adaptadores, 25 microlitros de fusión y la ADN polimerasa del kit.Un microlitro de PCR único de 20 micromolar y un microlitro de PCR dos de 20 micromolar. Realice la reacción de PCR según se describe en el protocolo escrito. Tras la amplificación por PCR, purifique el ADN con el kit de purificación de PCR Qiagen mini loop.Caliente previamente 15 microlitros del tampón EB a 50 grados Celsius y diluya el ADN diluyendo 0,5 microlitros de la muestra de uno a cuatro y realice una lectura en NanoDrop para purificar los productos amplificados. Prepare un gel de AGAROSA al 1,8 % de 50 mililitros utilizando agua grado HPLC, añada TAE y bromuro después de que la agarosa haya fundido. A continuación, vierta el gel y cargue el gel.Después de agregar cuatro microlitros de tampón de carga a las muestras de entrada y de inmunoprecipitación, ejecute el gel a 120 voltios durante 45 minutos. Analice el gel después de su electroforesis. Esto debería revelar que se producen fragmentos en el rango entre 150 y 350 pares de bases.Representan fragmentos de ADN genómico de entre 50 y 250 pares de bases de longitud. Y con un escalpelo, excíndase la región del gel que contiene el material en el rango de 150 a 350 pares de bases. Téngase cuidado en evitar excindir la banda del adaptador, que migra a aproximadamente 120 pares de bases.Recupere el ADN utilizando un kit rápido de extracción de geles kayak siguiendo las instrucciones del fabricante. Seque la muestra hasta exactamente 11 microlitros en un concentrador de vacío sin calor. Retire un microlitro de la muestra y mida la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro NanoDrop.Finalmente, identifique los productos génicos enriquecidos utilizando el analizador genómico Illumina y analice los sitios de unión y los genes diana según se describe en el protocolo escrito. Las coordenadas genómicas de las regiones enriquecidas identificadas de unión a la proteína RB o unión a RBP dos se presentan en un formato organizado por cromosoma. Las ocupaciones de los genes del conjunto en los cromosomas pueden visualizarse como VAR negros.Aquí se muestran las ocupaciones del cromosoma 10; dos regiones de unión de rbp dos se indican como líneas verticales. El panel central muestra todas las regiones de unión de los isoformos de rbp dos en el cromosoma 10, y el panel inferior muestra las regiones de unión del isoformo grande de rbp dos. Esta información proporciona una visión general de la ocupación superpuesta y específica de los isoformos de RBP dos en el cromosoma 10.Aquí se muestra un mapa de calor con las categorías de función molecular de la ontología genética (go) significativamente enriquecidas, corregidas por la tasa de falsos descubrimientos o FDR, entre los genes unidos por rbp. Dos tonos hacia el rojo indican alta significancia estadística. El amarillo indica baja significancia estadística, y el gris indica ausencia de significancia estadística.El análisis de enriquecimiento muestra las funciones moleculares superpuestas y específicas de isoformas de los genes diana del R BP dos. Acabamos de mostrarle cómo identificar los sitios de unión de factores de transcripción durante este procedimiento. Es importante producir fragmentos de ADN dentro del rango de tamaño y rendimiento adecuados.Esto puede lograrse siguiendo nuestras pautas durante el paso de SONECACIÓN. Eso es todo. Buena suerte con sus experimentos y gracias por vernos.

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Investigación

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Biología

Nuestro punto de cambio bayesiano (BCP) algoritmo se basa en los avances del estado de la técnica de modelado en los puntos de cambio a través de modelos ocultos de Markov y los aplica a la cromatina immunoprecipitation secuenciación (ChIPseq) el análisis de datos. BCP funciona bien en ambos tipos de datos amplios y punteada, pero sobresale en la identificación precisa de las islas robustas, reproducibles de enriquecimiento histona difusa.

Un bayesiano novela Cambio de punto Algoritmo para el Genoma en todo el análisis de diversos tipos de datos ChIPseq

En este video, demostramos la técnica de inmunoprecipitación de cromatina para identificar sitios de unión a proteínas en regiones específicas del ADN genómico de células precursoras de oligodendrocitos a través de la inmunoprecipitación selectiva de fragmentos de cromatina unidos a proteínas. Este método ayuda a estudiar la interacción de varias proteínas reguladoras, incluidos los factores de transcripción implicados en la regulación génica.

Inmunoprecipitación de cromatina para identificar sitios de unión a proteínas diana en el ADN genómico

La combinación de inmunoprecipitación de la cromatina y la secuenciación de ultra-alto rendimiento (chip-ss) puede identificar y mapear las interacciones proteína-ADN en un tejido o línea celular dada. Contorno es cómo generar una plantilla de chip de alta calidad para la posterior secuenciación, utilizando la experiencia con el factor de transcripción TCF7L2 como un ejemplo.

Generación de Plantilla ADN Immunoprecipitation cromatina alta calidad para la secuenciación de alto rendimiento (chip-ss)

Un protocolo se describe que utiliza ensayos Infinium de Illumina para llevar a cabo la genotipificación a gran escala. Estos ensayos pueden determinar el genotipo de forma fiable a millones de SNPs a través de cientos de muestras de ADN individuales en tres días. Una vez generada, estos genotipos se pueden utilizar para comprobar las asociaciones con una variedad de diferentes enfermedades o fenotipos.

Ensayo Infinium para aplicaciones a gran escala de genotipado de SNP

Este artículo de vídeo describe un método de microarrays basado en vitro para determinar los objetivos de genes y sitios de unión para dos reguladores de respuesta del sistema de componentes.

Purificado de ADN afinidad Chip (DAP-chip) Método para determinar los objetivos de genes para bacteriana Dos Sistemas Regulatorios componentes

La identificación de moléculas asociadas con regiones genómicas específicas de interés es necesaria para comprender los mecanismos de regulación de las funciones de estas regiones. Este protocolo describe los procedimientos para realizar la inmunoprecipitación de cromatina mediada por moléculas de unión al ADN (enChIP) para la identificación de proteínas y ARN asociados con una región genómica específica.

El aislamiento de regiones genómicas específicas e identificación de moléculas asociadas por enChIP

Factores epigenéticos pueden interactuar con programas genéticos que modulan la expresión génica y regulan la función de la célula de B. Mediante la combinación de la estimulación in vitro de células B, qRT-PCR y alto rendimiento microARN-secuencia y secuencia de ARNm enfoques, podemos analizar la modulación epigenética de miRNA y expresión genética en las células de B.

Genoma-ancha análisis de inhibidor de HDAC mediada por modulación de microRNAs y mRNAs en células B inducida por recombinación del ADN someterse a interruptor de clase y diferenciación de células plasmáticas

Este protocolo describe el uso combinatorio de ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq y perfiles para las líneas celulares y células primarias del ribosoma. Permite el seguimiento de cambios en el factor de transcripción vinculante, novo de transcripción, procesamiento de RNA, rotación y traducción con el tiempo y viendo el curso general de los acontecimientos en las células activadas o cambiantes.

Análisis en tiempo real del Factor de transcripción vinculante, transcripción, traducción y rotación para mostrar los eventos globales durante la activación celular

El manuscrito describe un ensayo PCR digital basado en el chip para detectar una variante rara de transcripción CDH1 (CDH1a) en congelado normal y los tejidos del tumor obtenidos de pacientes con cáncer gástrico.

Detección de una variante rara transcripción de CDH1 en tejidos de cáncer gástrico congelado por PCR Digital basado en el Chip

Presentamos un protocolo para identificar las implicaciones funcionales de las variantes no codificacionales identificadas por los estudios de asociación del genoma (GWAS) utilizando interacciones tridimensionales de cromatina.

Mapeo de variantes de la enfermedad de Alzheimer a sus genes objetivo mediante el análisis computacional de la configuración de la cromatina

Este artículo describe un protocolo ChIP-Seq semiautomatizado y microescalado de regiones de ADN asociadas con una modificación específica de histonas (H3K27ac) utilizando una plataforma de manejo de líquidos ChIP, seguida de la preparación de la biblioteca mediante tagmentación. El procedimiento incluye la evaluación de control con fines de calidad y cantidad y puede adoptarse para otras modificaciones de histonas o factores de transcripción.

Un procedimiento ChIP-Seq semiautomatizado para estudios epigenéticos a gran escala

Aprende a identificar objetivos genómicos de la histona demetilasa KDM5A/JARID1A/RBP2 mediante ChIP-Seq. Este método permite analizar interacciones proteína-ADN y estudiar regulación epigenética en células humanas.

Análisis de todo el genoma con chip para identificar objetivos específicos para cada isoforma Gene

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