Name: Inyección intraperitoneal en adultos de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Aprende la inyección intraperitoneal en adultos de Danio rerio utilizando anestesia con agua fría y microjeringa. Este método permite estudiar la homeostasis de glucosa en investigaciones metabólicas.

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Este estudio fue apoyado por la Juvenile Diabetes Research Foundation conceder 5-2007-97 (a VEP), por el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales subvenciones R01DK064973 (a VEP), R01DK48494 (a LHP), T32DK07074 (apoyo SCE), K01DK083552 (a MDK), y por P60DK20595 a la Universidad de Chicago Investigación de la Diabetes y el Centro de Formación. El contenido es responsabilidad exclusiva de sus autores y no representan necesariamente la opinión oficial de la NIDDK oa los NIH.

1. Los preparativos pre-inyección <ol><li> Rápidamente el pescado por lo menos 24 horas antes de la inyección. Esto vaciará el bulbo intestinal (estómago) contenido. El protocolo de ayuno básica es la transferencia de los peces, a su densidad normal, a un tanque limpio, y luego abstenerse de ingerir alimentos. A más largo plazo que requiere el ayuno condiciones más rigurosas (por ejemplo, para los estudios de glucosa en la sangre), ver las consideraciones adicionales en la discusión. </li><li> Prepare una solución de sal de Cortland (Perry et al., 1984). Para un volumen de 100 ml, disolver el siguiente en agua destilada: 725 mg de NaCl (124,1 mM) 38 mg de KCl (5,1 mM) 41 mg Na 2 HPO 4 (2,9 mM) 24 mg MgSO4 ∙ 7H 2 O (1,9 mM) 16 mg de CaCl 2 ∙ 2 H 2 O (1,4 mM) 100 mg NaHCO3 (11,9 mm) 4 g polivinilpirrolidona (PVP) (4%) 1,000 unidades USP de heparina Filtro, esterilizar y almacenar a 4 ° C. </li><li> Preparar el microscopio. <ul><li> Cubra la base del microscopio con una envoltura de plástico para su protección en caso de derrames. </li><li> Coloque una toalla de papel encima de la envoltura de plástico. La mesa de operaciones se sentará en la parte superior de la toalla de papel. </li><li> Pre-ajustar el enfoque al ver la mesa de operaciones y centrarse en la esponja. </li></ul> Consejo: Ponga el dedo en la parte superior de la esponja y se centran en eso. Así se eliminarán o minimizar aún más el ajuste focal, una vez que el pescado esté en la mesa de operaciones. </li><li> Que pesar los peces. <ul><li> Llene un vaso de 500 ml aproximadamente 1 / lleno de peces de agua instalación 3. </li><li> Tarar la balanza. </li><li> Recoger los peces con una red. Mecha exceso de agua lejos de la red y los peces con una breve taponando la red en toallas de papel. La transferencia de los peces en el vaso. </li><li> Que pesar los peces. </li><li> La transferencia de los peces a un tanque limpio. </li><li> La transferencia de cada pez pesado a su propio tanque de la etiqueta. </li><li> Calcular el volumen de inyección para cada pez basado en el peso de pescado. </li></ul></li><li> Prepare la jeringa y equipos relacionados con la inyección. Para la inyección, se recomienda una aguja 35G de acero biselado y una microjeringa de 10 l NanoFil. Prepare la jeringa y el tubo NanoFil Silflex siguiendo las instrucciones del fabricante. Es importante eliminar las burbujas de la jeringa y el tubo. Después de llenar la jeringa y el tubo, coloque la jeringa de la bomba, y el programa del volumen de inyección para el primer pez. </li><li> Prepare la mesa de operaciones. <ul><li> Cortar una esponja suave (como # L800-D, Jaece Industrias), de modo que es de aproximadamente 20 mm de altura. En la cara plana, hacer un corte que es de 10-15 mm de profundidad. Este corte es el canal que llevará a cabo la pesca de la inyección. </li><li> Establecer la esponja en un 60 mm placa de Petri. </li><li> Ajuste la placa de Petri con una esponja en una tapa de dimensiones adecuadas pipeta caja de punta. La tapa tiene que ser lo suficientemente grande como para contener el agua para ayudar a mantener la temperatura de la esponja, pero deben ser poco profundos como para no ponerse en el camino. Nosotros utilizamos una tapa de una caja de punta P200 que es de 11,4 cm de largo x 7,7 cm x 1,5 cm W D. </li></ul> Estos tres elementos reunidos (esponja en placa de Petri en la tapa de la caja) constituyen la mesa de operaciones. </li><li> Prepare la anestesia. <ul><li> Hacer uso de cubos de hielo picado a partir de peces de agua las instalaciones. </li></ul> Consejo: Con típicas bandejas de cubitos de hielo, que se llevará a tres bandejas para anestesiar a los peces 10-12. <ul><li> Llenar un cubo de hielo limpio con el hielo picado. </li><li> Ponga la mesa de operaciones en un recipiente más grande, como un contenedor de 2,4 litros de almacenamiento Rubbermaid alimentos. </li><li> Vierta un poco de agua instalación (caliente) en el recipiente exterior y la mesa de operaciones. Mantenga una reserva de agua caliente instalaciones cercanas. </li><li> Ponga un termómetro en el recipiente exterior. </li></ul></li></ol> 2. Anestesia, de inyección y recuperación <ol><li> Coloque el recipiente de anestesia exterior y una mesa quirúrgica junto al microscopio. Tiene el cubo de cubitos de hielo cerca. </li><li> Llevar la temperatura de agua a 17 ° C mediante la adición de trozos de hielo. Importante: No se vaya por debajo de 17 ° C para este paso. </li><li> Utilice una red para la transferencia de los peces en el recipiente exterior. </li><li> Poco a poco agregue cubos de hielo en el contenedor para bajar la temperatura a 12 ° C, en el transcurso de varios minutos. </li><li> Monitorear el comportamiento de los peces: A los 17 ° C o ligeramente más baja, los peces normalmente se extenderá sus aletas pectorales en posición horizontal, jadear y tener movimientos rápidos opérculo. A medida que la temperatura baja, los peces nadan más lentamente y, finalmente, dejar de nadar. A medida que el plano quirúrgico de anestesia se acercó, jadeando se detendrá y los movimientos lentos opérculo. El pescado está listo para la inyección cuando no reacciona a los que se manejan. Para la mayoría de los peces, 12 ° C es suficiente. Los peces más grandes pueden requerir más frío water. </li><li> A medida que la temperatura deseada (~ 12 ° C o inferior), pulse sobre la esponja para saturar. </li><li> Mantenga sus dedos en el agua fría suficiente para que no se caliente el pescado y llevarlo a cabo de la anestesia durante la manipulación. </li><li> Con los dedos fríos, con cuidado de transferencia de los peces al canal de la esponja. Coloque el pescado en el abdomen y las agallas en el comedero. </li><li> Rápidamente la transferencia de la mesa de operaciones de la platina del microscopio. </li><li> Trabajando rápidamente, cuidadosamente inserte la aguja en la línea media entre las aletas pélvicas. La aguja debe apuntar hacia craneal y se inserta cerca de la cintura pélvica que en el ano. Usted debe ser capaz de sentir cuando la aguja se encuentra profundamente a la pared del cuerpo. Inyectar el volumen adecuado y retirar la aguja. </li><li> Después de la inyección, inmediatamente la transferencia de los peces de nuevo a su agua caliente (~ 28,5 ° C) el tanque de recuperación por la liberación de los peces de la esponja en el agua del tanque. Consejo: Si los peces no comienzan a nadar inmediatamente, contribuir a su recuperación girando suavemente el agua hacia las branquias. </li><li> Compruebe la aguja. En ocasiones una escala puede estar unido y debe ser removido antes de la próxima inyección. </li><li> Las inyecciones siguientes, el uso de agua caliente para instalaciones de llevar la cámara de anestesia temperatura del agua de nuevo hasta 17 ° C antes de introducir el pescado que viene. </li></ol> 3. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2126/2126fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Los resultados representativos después de la inyección intraperitoneal de 0,5 mg / g de glucosa o de un vehículo. Peces se mantuvieron en ayunas durante 72 horas antes de la inyección. El eje X muestra el tiempo, después de la inyección. Media ± SEM.

<ol><li>Perry, S. F., Davie, P. S., Daxboeck, C., Ellis, A. G., Smith, D. G. Perfusion methods for the study of gill physiology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPerry%2C+SF+%22Fish+Physiology+Volume+X%3A+Gills%2C+Part+B%3A+Ion+and+Water%22">Fish Physiology Volume X: Gills, Part B: Ion and Water</a>. Hoar, W. S., Randall, D. J. , Academic Press, Inc. Orlando. 325-388 (1984).</li>
<li>Brown, L. A. Anesthesia and restraint. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrown%2C+LA+%22Fish+Medicine%22">Fish Medicine</a>. Stoskopf, M. K. , Saunders Company. Philadelphia. 79-90 (1993).</li>
<li>Eames, S. C., Philipson, L., Prince, V. E., Kinkel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+sugar+measurement+in+zebrafish+reveals+dynamics+of+glucose+homeostastis%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostastis.</a> Zebrafish. 7, 205-213 (2010).</li>
<li>Chavin, W., Young, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+in+the+determination+of+normal+serum+glucose+levels+of+goldfish+Carassius+auratus+L%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol%22%5BJournal%5D)">Factors in the determination of normal serum glucose levels of goldfish Carassius auratus L.</a> Comp Biochem Physiol. 33, 629-653 (1970).</li>
<li>Groff, J. M., Zinkl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematology+and+clinical+chemistry+of+cyprinid+fish.+Common+carp+and+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Exot+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Hematology and clinical chemistry of cyprinid fish. Common carp and goldfish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 2, 741-776 (1999).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. Oxford. 7-37 (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , University of Oregon Press. Eugene. (1995).</li>
<li>Iwama, G. K., Ackerman, P. A. Anaesthetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIwama%2C+GK+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+of+Fishes%2C+Volume+3%3A+Analytical+Techniques%22">Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, Volume 3: Analytical Techniques</a>. Hochachka, P. W., Mommsen, T. P. , Elsevier. Amsterdam. 1-15 (1994).</li>
<li>Reavill, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+diagnostic+and+clinical+techniques+for+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Exot+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Common diagnostic and clinical techniques for fish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 9, 223-235 (2006).</li>
<li>Stoskopf, M. K. Surgery. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStoskopf%2C+MK+%22Fish+Medicine%22">Fish Medicine</a>. Stoskopf, M. K. , Saunders Company. Philadelphia. 91-97 (1993).</li>
</ol>

Inyección intraperitoneal de cinco pasos: en ayunas, con un peso, anestesia, la inyección, y la recuperación. Para cada etapa existen las mejores prácticas que pueden garantizar el éxito. El éxito incluye un paciente saludable de peces, así como un buen resultado del experimento. Ayuno: Un ayuno de 24 horas debe vaciar el bulbo intestinal. Esta práctica se ha tomado de la literatura de pescado veterinaria (por ejemplo, Brown 1993). Consideraciones adicionales en ayunas se discuten a continuación. A largo plazo en ayunas: Hemos descubierto que un ayuno de 72 horas es necesario para disminuir la glucosa en sangre a un nivel de referencia antes de la inyección (Eames et al, 2010).. También hemos encontrado que para los estudios de la glucosa son varios los procedimientos que se requieren para garantizar que el pescado en ayuno correctamente. Comience con un tanque limpio (sin restos en la parte inferior). Los tanques deben estar fuera de línea, claramente etiquetados como &quot;ayuno&quot;, y en un lugar donde entusiasta personal de atención de los peces no les dará de comer. Evaluar el ambiente externo de la cisterna y tomar medidas para evitar que los peces se hizo hincapié en las perturbaciones, como el estrés se sabe que aumentan la glucosa en sangre (Chavín y Young, 1970;. Groff et al, 1999). Por ejemplo, tuvimos un experimento de ayuno en la que fue operado de una radio a diario en el banco que llevaba los tanques de peces. Se encontró que la glucosa en sangre fue inusualmente alta y llegó a la conclusión de que el pescado se destacó por las vibraciones. Otro factor de estrés es el hacinamiento. El pescado debe mantenerse a una densidad que cumpla con las buenas prácticas de cría de peces. Para recomendaciones, consulte Brand et al. (2002) y Westerfield (1995). Hemos tenido buenos resultados en ayunas nuestros peces a una densidad de 10 a 12 peces en un tanque de 9 litros (con 3 capas de mármoles de tomar parte de ese volumen). La separación de los sexos puede causar estrés, por lo que se recomienda mantener una población de ambos sexos durante el ayuno. Esto significa que los huevos pueden ser puestos, y los huevos deben ser secuestrado para que no se comen. Una manera sencilla de capturar los huevos es para cubrir el fondo del tanque con 2-3 capas de canicas. La calidad del agua debe mantenerse mediante la eliminación de los huevos y los desechos y mediante la sustitución de alrededor del 10-15% del agua del tanque, todos los días. Para la eliminación de los huevos y los residuos, sifón funciona bien. Pesaje: Al pesar los peces que no están anestesiados, se debe tener cuidado para reducir al mínimo la transferencia de agua de la red en el vaso, para garantizar la exactitud de pesaje. Si la red (con pescado) se transfirieron a las toallas de papel, la mayor parte del exceso de agua se puede quitar, y el peso se puede medir con precisión. Puede ser más fácil para anestesiar a los peces antes del pesaje, pero no hemos probado los posibles efectos de la anestesia un pescado dos veces en un día. Hemos probado nuestra técnica pesando los primeros peces con la red / secante método y volver a pesar el pescado después de haber sido anestesiado, y suavemente borrado en seco. No se encontraron diferencias significativas en el peso entre los métodos (p = 0,7927, t-test). Además, hemos probado si esta red / secante de glucosa en la sangre método afectadas, en comparación con la simple transferencia de los peces en el vaso tan pronto como se anotó (sin borrar). No se encontraron diferencias significativas en el nivel de glucosa en sangre entre los dos métodos de transferencia (P = 0,2241, t-test). Anestesia: La anestesia química puede ser adecuado para muchos estudios. Aquí hemos demostrado anestesia agua fría como una alternativa, ya que anestésicos muchos (incluyendo tricaine/MS-222 (Brown, 1993)), elevar la glucosa en la sangre. En estudios anteriores, hemos determinado que el agua fría no elevan la glucosa en la sangre en el pez cebra (Eames et al., 2010). Para la anestesia de agua fría, la temperatura debe reducirse lentamente. La tasa de disminución parece depender del tamaño de los peces, con peces más pequeños va en más rápido que los peces más grandes. Después de la inyección, se puede observar que el pescado se está recuperando muy lentamente de la anestesia (ver más abajo). Esto puede dar lugar, cuando sea la temperatura inicial es demasiado bajo, o cuando la temperatura se reduce demasiado rápido. La temperatura inicial es muy baja si la curva de pescado lateralmente al entrar en el agua. Si la temperatura inicial es correcta, los peces mantener su equilibrio inicial. Girará sus aletas pectorales a una posición horizontal, jadear y tener movimientos rápidos opérculo. Por lo general, se va a nadar. A medida que disminuye la temperatura, los movimientos se reducirá y el pescado pierda el equilibrio. Un plano quirúrgico de anestesia se alcanza cuando los peces se pueden manejar sin reaccionar. Para mantener a los peces bajo anestesia quirúrgica, los dedos deben estar fríos, por lo que mantenerlos en el agua antes de manipular el pescado. La esponja también deben mantenerse en frío a la misma temperatura que el agua utilizada para anestesiar a los peces. Es importante para saturar la esponja con agua que se sufficiently fría para mantener la anestesia una vez que el pescado se coloca en la misma. Inyección: Antes de las inyecciones de empresa, es posible que desee analizar por lo menos un pescado para tener una idea del espesor de pared del cuerpo. Esto puede ayudarle a juzgar hasta qué punto la aguja tiene que insertar a entrar en la cavidad abdominal. Además, al insertar la aguja, se puede sentir la pared del cuerpo &quot;dar&quot; cuando la aguja entra en la cavidad abdominal. Durante la inyección, tomar medidas para mantener al paciente feliz. Asegúrese de que la esponja se satura con la temperatura del agua fría correcta para evitar que el pescado de reactivación durante la inyección. Una esponja muy suave y saturado es importante para minimizar los daños a las escalas y el moco que cubre de la piel. Una esponja bien saturada es también importante para mantener las branquias aireado. Le recomendamos la esponja de espuma se enumeran a continuación en Materiales. Finalmente, una vez que el pescado esté anestesiado, trabajar con rapidez para minimizar el tiempo que el pescado es bajo. Recuperación: El pescado debe recuperarse de la anestesia prácticamente al entrar en el tanque de agua caliente. Si el pescado no comienzan a nadar inmediatamente, agitar suavemente el agua hacia sus branquias para acelerar la recuperación. Si la recuperación es lenta, entonces los peces se hundió muy rápido y se debe ajustar el procedimiento de anestesia adecuada. Las posibles causas de la lenta recuperación se discuten en La anestesia.

<table><tbody><tr><td>Espuma esponjosa</td><td>Jaece Industries</td><td>L800-D</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 60 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tapa de caja para puntas de pipeta</td><td></td><td></td><td>no demasiado profunda, por ejemplo 1,5 cm</td></tr><tr><td>Recipiente plástico de almacenamiento</td><td></td><td></td><td>profundo, por ejemplo 7 cm</td></tr><tr><td>Termómetro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hielo picado</td><td></td><td></td><td>hecho con agua de la instalación</td></tr><tr><td>Agua tibia de la instalación</td><td></td><td></td><td>1 litro o más</td></tr><tr><td>Vaso de precipitados de 500 ml</td><td></td><td></td><td>para pesar</td></tr><tr><td>Jeringa NanoFil</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NANOFIL</td><td>o jeringa Hamilton</td></tr><tr><td>Aguja de calibre 35</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NF35BV-2</td><td>biselada</td></tr><tr><td>Tubo de Silflex</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SILFLEX-2</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump III y controlador Micro4</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMPS-1</td><td></td></tr><tr><td>Interruptor de pedal</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>15867</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papel film</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Toallas de papel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución salina Cortland</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

inyección intraperitoneal en adultos de pez cebra

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Un método conveniente para tratar químicamente el pez cebra es introducir el reactivo en el agua del tanque, donde será absorbido por los peces. Sin embargo, este método hace que sea difícil saber la cantidad de reactivo es absorbido o tomado por los peces. Algunas de las preguntas experimentales, en particular los relacionados con los estudios metabólicos, pueden ser mejor atendidos por la entrega de una cantidad determinada a cada uno de los peces, en función del peso. Aquí presentamos un método para intraperitoneal (IP) la inyección en adultos de pez cebra. La inyección es en la cavidad abdominal, por detrás de la cintura pélvica. Este procedimiento es una adaptación de los métodos de uso veterinario para peces más grandes. Es seguro, como hemos observado la mortalidad cero. Además, hemos visto el sangrado en el sitio de la inyección en sólo 5 de cada 127 inyecciones, y en cada uno de esos casos, el sangrado fue breves segundos, durando varios meses, y la cantidad de sangre perdida era pequeño. Éxito con este procedimiento requiere de un manejo suave de los peces a través de varias medidas incluyendo el ayuno, con un peso, anestesia, la inyección, y la recuperación. Las precauciones son necesarias para reducir al mínimo el estrés durante el procedimiento. Nuestras precauciones incluyen el uso de un volumen de inyección de pequeñas y una aguja 35G. Usamos solución Cortland sal como el vehículo, que es equilibrada por ósmosis de peces de agua dulce. Aireación de las branquias se mantiene durante el procedimiento de inyección, en primer lugar con lo que el pescado en un plano quirúrgico de anestesia, que permite movimientos lentos opérculo, y en segundo lugar, mediante la celebración de los peces en un canal dentro de una esponja saturada de agua durante la inyección en sí. Demostrar la utilidad de la inyección de IP mediante la inyección de glucosa y el control de la elevación del nivel de glucosa en la sangre y su posterior regreso a la normalidad. Ya que el estrés se sabe que aumenta la glucosa en sangre en los peces teleósteos, se comparan los niveles de glucosa en sangre en adultos inyectados con vehículo y no inyecta-y demostrar que el procedimiento no causa un aumento significativo de la glucosa en sangre.

Demostramos inyección intraperitoneal en adultos de pez cebra. Nosotros usamos un 10 l microjeringa NanoFil controlado por un controlador Micro4 y III UltraMicroPump. Esta demostración incluye el uso de agua fría como un anestésico.

Inyección intraperitoneal en adultos de pez cebra

Un método conveniente para el tratamiento químico de los peces cebra consiste en introducir el reactivo en el agua del tanque, donde será absorbido por los peces. Sin embargo, ...

El objetivo general de este procedimiento consiste en inyectar una solución en la cavidad peritoneal del pez cebra adulto. En este ejemplo, inyectaremos glucosa en nuestro laboratorio. Utilizamos este procedimiento para estudiar la estasis de glucosa en sangre. Esto se logra primero pesando el pez para determinar cuánta solución inyectar por gramo de peso corporal. El segundo paso del procedimiento consiste en anestesiar al pez con agua fría. El tercer paso del procedimiento consiste en transferir el pez a la platina del microscopio e inyectar.El paso final del procedimiento consiste en devolver el pez a su tanque para su recuperación. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestren cambios en la homeostasis de la glucosa mediante la medición de los niveles de glucosa en sangre. Hola, soy Mary Kinkle del Laboratorio de Victoria Prince en el Departamento de Biología y Anatomía de los Organismos de la Universidad de Chicago.Soy Stephanie Ames, también del laboratorio Prince. Hoy les mostraremos un procedimiento para inyección intraperitoneal en peces cebra adultos. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la regulación de la homeostasis de la glucosa sanguínea.Así que comencemos. Para preparar los peces para la inyección, primero transfiera los peces a un tanque limpio y ayúnelos. Deje sin alimento a los peces durante 24 horas para vaciar el contenido del bulbo intestinal y durante 72 horas para reducir la glucosa sanguínea a niveles basales.La densidad utilizada en este protocolo es de 10 a 12 peces de poblaciones mixtas por sexo por tanque de nueve litros con tres capas de canicas; las canicas atrapan los huevos para que no sean comidos. Retire los huevos y los desechos diariamente mediante sifonado del tanque.A continuación, prepare la solución salina Cortland utilizando 124,1 milimolar de cloruro de sodio, 5,1 milimolar de cloruro de potasio, 2,9 milimolar de pirofosfato de sodio, 1,9 milimolar de sulfato de magnesio heptahidratado, 1,4 milimolar de cloruro de calcio dihidratado, 11,9 milimolar de bicarbonato de sodio, cuatro gramos de polivinilpirrolidona y 1000 unidades USP de heparina, llevando a un volumen final de 100 mililitros con agua desionizada; filtre, esterilice y almacene a cuatro grados Celsius. A continuación, disuelva cinco gramos de glucosa en 10 mililitros de solución salina Cortland. Para obtener una solución de glucosa de 0,5 miligramos por microlitro, filtre, esterilice y almacene a cuatro grados Celsius.Luego, prepare la mesa quirúrgica cortando una esponja blanda hasta una altura aproximada de 20 milímetros en la cara plana. Haga un corte de 10 a 15 milímetros de profundidad para sujetar el pez durante la inyección. Coloque la esponja en una placa de Petri de 60 milímetros y coloque la placa con la esponja en la tapa de un estuche para puntas de pipeta P200.A continuación, prepare el microscopio cubriendo su base con papel de plástico y toallas de papel para protegerla. En caso de derrames, coloque la mesa quirúrgica sobre la toalla de papel. Ajuste previamente el enfoque observando la mesa quirúrgica y enfocando la esponja.Coloque el dedo sobre la esponja y concéntrese en ella para minimizar futuros ajustes de enfoque cuando el pez esté sobre la mesa quirúrgica. Pese el pez llenando un vaso de precipitados de 500 mililitros aproximadamente un tercio con agua del acuario y una lágrima. En una balanza, transfiera el pez con la menor cantidad posible de agua excedente al vaso de precipitados y registre el peso; transfiera cada pez pesado a un tanque transparente etiquetado.Calcule el volumen de inyección en función del peso. En este ejemplo, se inyectará una solución de 0.5 miligramos por gramo de peso corporal de glucosa disuelta en solución salina Cortland. Dado que nuestra solución es de 0.5 miligramos por microlitro, el cálculo es: uno multiplicado por los gramos de peso del pez equivale al volumen a inyectar en microlitros. Prepare la jeringa y el equipo de inyección relacionado.Este protocolo utiliza una aguja de acero biselada de 30G, una bomba ultra micro y un microprocesador cuádruple, y una jeringa micro de 10 microlitros con llenado nanofill para la inyección de glucosa; llene la jeringa con glucosa al 0,5 miligramos por microlitro disuelta en solución salina Cortland. Es importante eliminar todas las burbujas de aire de la jeringa, montar la jeringa en la bomba ultra micro y programar el volumen de inyección para el primer pez introduciendo el volumen en nanolitros mediante el teclado numérico del microprocesador cuádruple. Por último, prepare el anestésico de hielo triturando suficientes cubitos de hielo hechos con agua del sistema de mantenimiento de peces.Para llenar un cubo de hielo, coloque la mesa quirúrgica en un recipiente más grande, como un recipiente de almacenamiento de alimentos de goma de 2,4 litros. Vierta agua tibia del suministro en el recipiente exterior y en la mesa quirúrgica. Mantenga un tanque de reserva con agua tibia del suministro cerca.Sujete un termómetro al recipiente externo. Coloque el recipiente externo del anestésico junto con la mesa quirúrgica adyacente al microscopio. Tenga cerca el cubo con trocitos de hielo.Comience a agregar trocitos de hielo hasta que la temperatura del agua sea de 17 grados Celsius. No baje por debajo de 17 grados Celsius en este paso. Utilice una red para transferir el pez al recipiente exterior.A 17 grados o ligeramente inferior, los peces normalmente extienden sus aletas pectorales horizontalmente, jadean y presentan movimientos auriculares rápidos. Añada lentamente trocitos de hielo al recipiente para reducir la temperatura hasta 12 grados Celsius durante varios minutos. A medida que desciende la temperatura, el pez nadará más lentamente y finalmente dejará de nadar.Finalmente, el jadeo cesará y los movimientos auriculares se ralentizarán. El pez está listo para la inyección cuando no reaccione al ser manipulado. Al alcanzar la temperatura requerida, presione la esponja para saturarla.Mantenga los dedos en el agua fría el tiempo suficiente para que no calienten el pez y lo saquen de la anestesia. Durante el manejo con los dedos fríos, transfiera suavemente el pez al surco de la esponja. Coloque el pez con el abdomen hacia arriba y las branquias en el surco.Transfiera rápidamente la mesa quirúrgica al platino del microscopio. Trabajando rápidamente, posicione cuidadosamente la aguja de modo que la punta apunte cranealmente y esté más cerca de la cintura pélvica que del ano. Introduzca la aguja en la línea media entre las aletas pélvicas.Debe poder percibir cuándo la aguja está por debajo de la pared corporal. Al insertar la aguja, puede sentir cómo cede la pared corporal. Cuando la aguja entre en la cavidad abdominal, inyecte el volumen adecuado utilizando el microprocesador.Utilice el pedal para inyectar un microlitro por gramo de peso corporal del pez; después de la inyección, retire la aguja y transfiera inmediatamente el pez de vuelta a su tanque de agua tibia para su recuperación. Al liberar el pez desde la esponja sobre el agua del tanque, revise la aguja bajo el microscopio. Ocasionalmente, puede quedar adherida una escama, la cual debe eliminarse antes de la siguiente inyección.Después de un período de tiempo adecuado, continúe con su ensayo posterior. Hemos encontrado que se requiere un ayuno de 72 horas para reducir la glucosa sanguínea a un nivel basal antes de la inyección. En esta figura, los datos del control no inyectado mostrados en verde muestran valores de glucosa sanguínea no significativamente diferentes de los controles inyectados con vehículo mostrados aquí en rojo.Sin embargo, la línea azul muestra los valores de glucosa en sangre de los peces inyectados con glucosa y refleja el aumento y descenso de la glucosa circulante. Con el tiempo, tanto los animales inyectados con glucosa como los inyectados con vehículo estuvieron bajo anestesia quirúrgica durante el procedimiento de inyección, mientras que los controles no inyectados no estuvieron bajo anestesia quirúrgica. Acabamos de mostrarle cómo realizar una inyección intraperitoneal en peces cebra adultos.En nuestro laboratorio, estudiamos los cambios en la concentración de glucosa en sangre en diversos momentos tras la inyección IP de una solución de glucosa. Sin embargo, esta técnica que acaban de ver puede utilizarse para inyectar su solución de interés. Al realizar este procedimiento, recuerde anestesiar lentamente al pez y manipularlo con cuidado.Así que eso es todo. Gracias por ver y buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aquí te mostramos cómo hacer retro-orbital de la inyección en adultos de pez cebra.

Retro-orbital de inyección en adultos de pez cebra

Este video describe la técnica de inyección intramuscular para administrar compuestos en los músculos dorsales de un pez cebra adulto.

Inyección intramuscular (IM): administración de compuesto en el músculo dorsal de un pez cebra adulto

Este video describe una técnica de inyección intraperitoneal, un método para administrar soluciones en la cavidad abdominal de un pez cebra adulto.

Inyección intraperitoneal: un método de administración de solución en la cavidad abdominal de un pez cebra adulto

Este video describe la técnica de administrar compuestos en el corazón de un pez cebra adulto mediante inyección intratorácica.

Inyección intratorácica: administración de compuestos al corazón del pez cebra adulto

Aquí se describe un protocolo para la inmunización del adulto pez cebra (Danio rerio) con una vacuna de ADN y demostrar la validación de un evento de éxito de la vacunación. Este método es adecuado para la investigación preclínica de candidatos vacunales en varios modelos de infección.

Inmunización de pez cebra adulto para la evaluación preclínica de vacunas basadas en ADN

Este método se basa en la inyección de 0,5 − 3 μL de solución en el tórax del pez cebra adulto. El procedimiento proporciona eficientemente proteínas y compuestos químicos en la proximidad del corazón del pez cebra sin dañar el órgano. El enfoque es adecuado para probar los efectos de factores exógenos en varios tejidos del corazón.

Inyección intratorácica para el estudio del corazón de pez cebra adulto

Se describe un nuevo método de inyección intraperitoneal (IP) en pez cebra adulto. Cuando se manipulan compuestos tóxicos como la doxorrubicina, este procedimiento es más eficaz que los dos métodos IP descritos anteriormente. La técnica está diseñada para ser fácilmente adoptada por investigadores con experiencia limitada en el modelo de pez cebra.

Una técnica de inyección intraperitoneal en peces cebra adultos que minimiza el daño corporal y la mortalidad asociada

Aquí, presentamos un protocolo optimizado y efectivo para la inyección intravenosa de células o agentes farmacológicos en peces cebra adultos, lo que resulta en un mayor injerto celular y mayores tasas de supervivencia del pez cebra tratado.

Inyección intravenosa optimizada en pez cebra adulto

El trasplante de médula del riñón entero en adultos de pez cebra

Después de la formación del tubo neural, el neuroepitelio se contrae y se dobla mientras que el tubo se llena de líquido cefalorraquídeo embrionarias (ECSF) para formar los ventrículos del cerebro embrionario. Hemos desarrollado esta técnica de inyección del ventrículo para visualizar mejor el espacio lleno de líquido, en contraste con la forma neuroepitelial en un embrión vivo.

Cerebro del pez cebra ventrículo inyección

Aprende la inyección intraperitoneal en adultos de Danio rerio utilizando anestesia con agua fría y microjeringa. Este método permite estudiar la homeostasis de glucosa en investigaciones metabólicas.

Inyección intraperitoneal en adultos de pez cebra

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