Inyección intraperitoneal en adultos de pez cebra

El objetivo general de este procedimiento es inyectar una solución en la cavidad peritoneal del pez cebra adulto. En este ejemplo, inyectaremos glucosa en nuestro laboratorio. Utilizamos este procedimiento para estudiar la estasis de la glucosa en sangre.

Esto se logra pesando primero el pez para determinar la cantidad de solución que se debe inyectar por gramo de peso corporal. El segundo paso del procedimiento es anestesiar al pez con agua fría. El tercer paso del procedimiento es transferir el pez a la etapa de microscopio e inyectarlo.

El paso final del procedimiento es devolver el pez a su tanque para su recuperación. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran cambios en la homeostasis de la glucosa a través de la medición de los niveles de glucosa en sangre. Hola, soy Mary Kinkle del Laboratorio de Victoria Prince en el Departamento de Biología y Anatomía de Organismos de la Universidad de Chicago.

Soy Stephanie Ames, también del Prince Lab. Hoy te mostraremos un procedimiento para la inyección intraperitoneal en pez cebra adulto. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la regulación de la homeostasis de la glucosa en sangre.

Así que comencemos. Para preparar los peces para la inyección, comience por transferir los peces a un tanque limpio y retenga la comida rápidamente. El pescado durante 24 horas para vaciar el contenido del bulbo intestinal y 72 horas para reducir la glucosa en sangre a los niveles basales.

La densidad utilizada en este protocolo es de 10 a 12 personas de sexo mixto. Pescado por tanque de nueve litros con tres capas de canicas, el mármol secuestra los huevos para que no se los coman. Retire los huevos y los desechos diariamente mediante el sifón del tanque.

A continuación, prepare la solución salina de Cortland con cloruro de sodio 124.1 milimolar, cloruro de potasio 5.1 milimolar, pirofosfato de sodio 2.9 milimolar, 1.9 milimolar, sulfato de magnesio hidratado de hept, cloruro de calcio dihidratado 11.4 milimolar, bicarbonato de sodio 11.9 milimolar, cuatro gramos de polivinilo roona y 1000 unidades USP de heparina hasta un volumen final de 100 mililitros con filtro de agua desionizada, esterilizar y almacenar a cuatro grados centígrados. A continuación, disuelva cinco gramos de glucosa en 10 mililitros de solución de sal de cottin. Para hacer una solución de glucosa de 0,5 miligramos por microlitro, filtre, esterilice y almacene a cuatro grados centígrados.

A continuación, prepare la mesa quirúrgica cortando una esponja suave a una altura aproximada de 20 milímetros en la cara plana. Haz un corte de 10 a 15 milímetros de profundidad para sujetar el pez para la inyección. Coloque la esponja en una placa de Petri de 60 milímetros y coloque la placa de Petri con una esponja en la tapa de una caja de punta de pipeta P 200.

A continuación, prepare el microscopio cubriendo la base del microscopio con una envoltura de plástico y toallas de papel para su protección. En caso de derrames, coloque la mesa quirúrgica encima de la toalla de papel. Ajuste previamente el enfoque visualizando la mesa quirúrgica y enfocándose en la esponja.

Coloque su dedo encima de la esponja y concéntrese en ella para minimizar el ajuste focal adicional cuando el pez esté en la mesa quirúrgica. Después de pesar el pescado llenando un vaso de precipitados de 500 mililitros aproximadamente un tercio de su capacidad con agua y lágrima de la instalación de peces. En una báscula, transfiera los peces con la menor cantidad posible de exceso de agua al vaso de precipitados y registre el peso, transfiera cada pez pesado a un tanque claramente etiquetado.

Calcule el volumen de inyección en función del peso. En este ejemplo, inyectaremos una solución de 0,5 miligramos por gramo de peso corporal de glucosa disuelta en una solución salina de Cortland. Dado que nuestra solución es de 0,5 miligramos por microlitro, el cálculo es una vez que el peso del pez es igual al volumen a inyectar en microlitros, preparar la jeringa y el equipo de inyección relacionado.

Este protocolo utiliza una aguja de acero biselado de 30 5G, una bomba ultra micro y un procesador micro cuatro y una jeringa micro de relleno nano de 10 microlitros para inyección de glucosa, llene la jeringa con 0,5 miligramos por microlitro de glucosa disuelta en la solución salina de Cortland. Es importante eliminar todas las burbujas de aire de la jeringa, montar la jeringa en la bomba ultra micro y programar el volumen de inyección para el primer pez ingresando el volumen en nanolitros, usando el teclado numerado en el procesador micro four. Por último, prepare el anestésico de hielo triturando suficientes cubitos de hielo hechos con agua de las instalaciones de los peces.

Para llenar una cubeta de hielo, coloque la mesa quirúrgica en un recipiente más grande, como un recipiente de almacenamiento de alimentos hecho con goma de 2,4 litros. Vierta un poco de agua tibia en el recipiente exterior y en la mesa quirúrgica. Mantenga cerca un tanque de reserva de agua tibia para las instalaciones.

Coloque un termómetro en el recipiente exterior. Coloque el recipiente exterior de anestésico más la mesa quirúrgica adyacente al microscopio. Ten a mano el cubo de trozos de hielo.

Comience a agregar trozos de hielo hasta que la temperatura del agua sea de 17 grados centígrados. No bajes de los 17 grados centígrados para este paso. Use una red para transferir el pescado al recipiente exterior.

A 17 grados o un poco más abajo, el pez generalmente extenderá sus aletas pectorales horizontalmente, jadeará y tendrá movimientos auriculares rápidos. Agregue lentamente trozos de hielo al recipiente para bajar la temperatura a 12 grados centígrados en el transcurso de varios minutos. A medida que baja la temperatura, los peces nadarán más lentamente y finalmente dejarán de nadar.

Con el tiempo, el jadeo se detendrá y los movimientos auriculares se harán más lentos. El pez está listo para la inyección cuando no reacciona al ser manipulado. A medida que se alcanza la temperatura requerida, presione la esponja para saturarla.

Mantenga los dedos en el agua fría lo suficiente como para que no calienten el pescado y lo saquen de la anestesia. Durante la manipulación con los dedos fríos, transfiera suavemente el pescado al canal de la esponja. Coloque el pez con el abdomen hacia arriba y las branquias en el comedero.

Transfiera rápidamente la mesa quirúrgica a la etapa del microscopio. Trabajando rápidamente, coloque con cuidado la aguja de modo que la punta apunte hacia la cresta y esté más cerca de la cintura pélvica que del ano. Inserta la aguja en la línea media entre las aletas pélvicas.

Debería poder sentir cuando la aguja está profundamente en la pared del cuerpo. A medida que inserta la aguja, puede sentir que la pared del cuerpo cede. Cuando la aguja entre en la cavidad abdominal, inyecte el volumen adecuado utilizando el micro para el procesador.

Use el pedal para inyectar un microlitro por gramo de peso corporal del pez después de la inyección, retire la aguja e inmediatamente transfiera el pez a su tanque de agua caliente para su recuperación. Al soltar el pez de la esponja sobre el agua del tanque, revise la aguja bajo el microscopio. Ocasionalmente se colocará una incrustación que debe retirarse antes de la próxima inyección.

Después de un período de tiempo adecuado, proceda con su ensayo posterior. Hemos encontrado que se requiere un ayuno de 72 horas para disminuir la glucosa en sangre a un nivel basal antes de la inyección. En esta figura, los datos de control no inyectados que se muestran en verde muestran valores de glucosa en sangre que no difieren significativamente de los controles inyectados en vehículos que se muestran aquí en rojo.

Sin embargo, la línea azul muestra los valores de glucosa en sangre para los peces inyectados con glucosa y muestra el aumento y la disminución de la glucosa circulante. Con el tiempo, tanto los animales inyectados con glucosa como los inyectados en vehículos estuvieron bajo anestesia quirúrgica durante el procedimiento de inyección, mientras que los controles no inyectados no estuvieron bajo anestesia quirúrgica. Acabamos de mostrarle cómo realizar la inyección intraperitoneal en peces cebra adultos.

En nuestro laboratorio, estudiamos los cambios en la concentración de glucosa en sangre en varios puntos después de la inyección IP de una solución de glucosa. Sin embargo, esta técnica que acabamos de mostrar se puede utilizar para inyectar la solución que le interese. Al realizar este procedimiento, recuerde anestesiar al pez lentamente y manipularlo suavemente.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.