Inyección intraperitoneal en adultos de pez cebra
30 de agosto de 2010
Demostramos inyección intraperitoneal en adultos de pez cebra. Nosotros usamos un 10 l microjeringa NanoFil controlado por un controlador Micro4 y III UltraMicroPump. Esta demostración incluye el uso de agua fría como un anestésico.
El objetivo general de este procedimiento consiste en inyectar una solución en la cavidad peritoneal del pez cebra adulto. En este ejemplo, inyectaremos glucosa en nuestro laboratorio. Utilizamos este procedimiento para estudiar la estasis de glucosa en sangre.
Esto se logra primero pesando el pez para determinar cuánta solución inyectar por gramo de peso corporal. El segundo paso del procedimiento consiste en anestesiar al pez con agua fría. El tercer paso del procedimiento consiste en transferir el pez a la platina del microscopio e inyectar.
El paso final del procedimiento consiste en devolver el pez a su tanque para su recuperación. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestren cambios en la homeostasis de la glucosa mediante la medición de los niveles de glucosa en sangre. Hola, soy Mary Kinkle del Laboratorio de Victoria Prince en el Departamento de Biología y Anatomía de los Organismos de la Universidad de Chicago.
Soy Stephanie Ames, también del laboratorio Prince. Hoy les mostraremos un procedimiento para inyección intraperitoneal en peces cebra adultos. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la regulación de la homeostasis de la glucosa sanguínea.
Así que comencemos. Para preparar los peces para la inyección, primero transfiera los peces a un tanque limpio y ayúnelos. Deje sin alimento a los peces durante 24 horas para vaciar el contenido del bulbo intestinal y durante 72 horas para reducir la glucosa sanguínea a niveles basales.
La densidad utilizada en este protocolo es de 10 a 12 peces de poblaciones mixtas por sexo por tanque de nueve litros con tres capas de canicas; las canicas atrapan los huevos para que no sean comidos. Retire los huevos y los desechos diariamente mediante sifonado del tanque.
A continuación, prepare la solución salina Cortland utilizando 124,1 milimolar de cloruro de sodio, 5,1 milimolar de cloruro de potasio, 2,9 milimolar de pirofosfato de sodio, 1,9 milimolar de sulfato de magnesio heptahidratado, 1,4 milimolar de cloruro de calcio dihidratado, 11,9 milimolar de bicarbonato de sodio, cuatro gramos de polivinilpirrolidona y 1000 unidades USP de heparina, llevando a un volumen final de 100 mililitros con agua desionizada; filtre, esterilice y almacene a cuatro grados Celsius. A continuación, disuelva cinco gramos de glucosa en 10 mililitros de solución salina Cortland. Para obtener una solución de glucosa de 0,5 miligramos por microlitro, filtre, esterilice y almacene a cuatro grados Celsius.
Luego, prepare la mesa quirúrgica cortando una esponja blanda hasta una altura aproximada de 20 milímetros en la cara plana. Haga un corte de 10 a 15 milímetros de profundidad para sujetar el pez durante la inyección. Coloque la esponja en una placa de Petri de 60 milímetros y coloque la placa con la esponja en la tapa de un estuche para puntas de pipeta P200.
A continuación, prepare el microscopio cubriendo su base con papel de plástico y toallas de papel para protegerla. En caso de derrames, coloque la mesa quirúrgica sobre la toalla de papel. Ajuste previamente el enfoque observando la mesa quirúrgica y enfocando la esponja.
Coloque el dedo sobre la esponja y concéntrese en ella para minimizar futuros ajustes de enfoque cuando el pez esté sobre la mesa quirúrgica. Pese el pez llenando un vaso de precipitados de 500 mililitros aproximadamente un tercio con agua del acuario y una lágrima. En una balanza, transfiera el pez con la menor cantidad posible de agua excedente al vaso de precipitados y registre el peso; transfiera cada pez pesado a un tanque transparente etiquetado.
Calcule el volumen de inyección en función del peso. En este ejemplo, se inyectará una solución de 0.5 miligramos por gramo de peso corporal de glucosa disuelta en solución salina Cortland. Dado que nuestra solución es de 0.5 miligramos por microlitro, el cálculo es: uno multiplicado por los gramos de peso del pez equivale al volumen a inyectar en microlitros. Prepare la jeringa y el equipo de inyección relacionado.
Este protocolo utiliza una aguja de acero biselada de 30G, una bomba ultra micro y un microprocesador cuádruple, y una jeringa micro de 10 microlitros con llenado nanofill para la inyección de glucosa; llene la jeringa con glucosa al 0,5 miligramos por microlitro disuelta en solución salina Cortland. Es importante eliminar todas las burbujas de aire de la jeringa, montar la jeringa en la bomba ultra micro y programar el volumen de inyección para el primer pez introduciendo el volumen en nanolitros mediante el teclado numérico del microprocesador cuádruple. Por último, prepare el anestésico de hielo triturando suficientes cubitos de hielo hechos con agua del sistema de mantenimiento de peces.
Para llenar un cubo de hielo, coloque la mesa quirúrgica en un recipiente más grande, como un recipiente de almacenamiento de alimentos de goma de 2,4 litros. Vierta agua tibia del suministro en el recipiente exterior y en la mesa quirúrgica. Mantenga un tanque de reserva con agua tibia del suministro cerca.
Sujete un termómetro al recipiente externo. Coloque el recipiente externo del anestésico junto con la mesa quirúrgica adyacente al microscopio. Tenga cerca el cubo con trocitos de hielo.
Comience a agregar trocitos de hielo hasta que la temperatura del agua sea de 17 grados Celsius. No baje por debajo de 17 grados Celsius en este paso. Utilice una red para transferir el pez al recipiente exterior.
A 17 grados o ligeramente inferior, los peces normalmente extienden sus aletas pectorales horizontalmente, jadean y presentan movimientos auriculares rápidos. Añada lentamente trocitos de hielo al recipiente para reducir la temperatura hasta 12 grados Celsius durante varios minutos. A medida que desciende la temperatura, el pez nadará más lentamente y finalmente dejará de nadar.
Finalmente, el jadeo cesará y los movimientos auriculares se ralentizarán. El pez está listo para la inyección cuando no reaccione al ser manipulado. Al alcanzar la temperatura requerida, presione la esponja para saturarla.
Mantenga los dedos en el agua fría el tiempo suficiente para que no calienten el pez y lo saquen de la anestesia. Durante el manejo con los dedos fríos, transfiera suavemente el pez al surco de la esponja. Coloque el pez con el abdomen hacia arriba y las branquias en el surco.
Transfiera rápidamente la mesa quirúrgica al platino del microscopio. Trabajando rápidamente, posicione cuidadosamente la aguja de modo que la punta apunte cranealmente y esté más cerca de la cintura pélvica que del ano. Introduzca la aguja en la línea media entre las aletas pélvicas.
Debe poder percibir cuándo la aguja está por debajo de la pared corporal. Al insertar la aguja, puede sentir cómo cede la pared corporal. Cuando la aguja entre en la cavidad abdominal, inyecte el volumen adecuado utilizando el microprocesador.
Utilice el pedal para inyectar un microlitro por gramo de peso corporal del pez; después de la inyección, retire la aguja y transfiera inmediatamente el pez de vuelta a su tanque de agua tibia para su recuperación. Al liberar el pez desde la esponja sobre el agua del tanque, revise la aguja bajo el microscopio. Ocasionalmente, puede quedar adherida una escama, la cual debe eliminarse antes de la siguiente inyección.
Después de un período de tiempo adecuado, continúe con su ensayo posterior. Hemos encontrado que se requiere un ayuno de 72 horas para reducir la glucosa sanguínea a un nivel basal antes de la inyección. En esta figura, los datos del control no inyectado mostrados en verde muestran valores de glucosa sanguínea no significativamente diferentes de los controles inyectados con vehículo mostrados aquí en rojo.
Sin embargo, la línea azul muestra los valores de glucosa en sangre de los peces inyectados con glucosa y refleja el aumento y descenso de la glucosa circulante. Con el tiempo, tanto los animales inyectados con glucosa como los inyectados con vehículo estuvieron bajo anestesia quirúrgica durante el procedimiento de inyección, mientras que los controles no inyectados no estuvieron bajo anestesia quirúrgica. Acabamos de mostrarle cómo realizar una inyección intraperitoneal en peces cebra adultos.
En nuestro laboratorio, estudiamos los cambios en la concentración de glucosa en sangre en diversos momentos tras la inyección IP de una solución de glucosa. Sin embargo, esta técnica que acaban de ver puede utilizarse para inyectar su solución de interés. Al realizar este procedimiento, recuerde anestesiar lentamente al pez y manipularlo con cuidado.
Así que eso es todo. Gracias por ver y buena suerte con sus experimentos.
Resumen
Este artículo demuestra el procedimiento para inyección intraperitoneal en pez cebra adulto, utilizando una microjeringa NanoFil y anestesia con agua fría. El método tiene como objetivo estudiar la homeostasis de la glucosa sanguínea mediante inyecciones precisas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Biología
- Fisiología
Antecedentes
- Las inyecciones intraperitoneales son esenciales para administrar sustancias directamente en la cavidad peritoneal.
- El pez cebra es un organismo modelo valioso para estudiar los procesos metabólicos.
- Comprender la regulación de la glucosa en sangre es crucial para obtener conocimientos sobre los trastornos metabólicos.
- El uso de anestesia es necesario para minimizar el estrés durante el procedimiento.
Objetivo del estudio
- Demostrar un método confiable para la inyección intraperitoneal en pez cebra.
- Facilitar la investigación sobre la homeostasis de la glucosa y su regulación.
- Proporcionar un protocolo que pueda replicarse en otros laboratorios.
Métodos Utilizados
- Preparación de los peces mediante ayuno y pesaje para determinar el volumen de inyección.
- Anestesia de los peces utilizando agua fría para garantizar un movimiento mínimo durante la inyección.
- Inyección de una solución de glucosa en la cavidad peritoneal utilizando una microjeringa precisa.
- Monitoreo de la recuperación de los peces tras la inyección para evaluar el impacto del procedimiento.
Resultados Principales
- El procedimiento permite con éxito la inyección de sustancias en peces cebra adultos.
- Los niveles de glucosa en sangre pueden medirse tras la inyección para estudiar los cambios metabólicos.
- Los peces se recuperan bien después del procedimiento, lo que indica la eficacia de la anestesia utilizada.
- Los resultados contribuyen a una mejor comprensión de la homeostasis de la glucosa en el pez cebra.
Conclusiones
- Este método proporciona una herramienta valiosa para los investigadores que estudian los procesos metabólicos en el pez cebra.
- La inyección intraperitoneal es una técnica factible y eficaz para administrar soluciones.
- Estudios futuros pueden basarse en este protocolo para explorar diversas condiciones metabólicas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La administración precisa de compuestos en pez cebra permite reducir el riesgo mecanicista de dianas metabólicas mediante el establecimiento de relaciones dosis-respuesta en un sistema vertebrado. Este enfoque apoya la validación de dianas a través de la perturbación controlada de la homeostasis de la glucosa, reduciendo la ambigüedad en la interrogación de vías. El método mejora la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al proporcionar lecturas fenotípicas cuantitativas y reproducibles, relevantes para la modelización de enfermedades metabólicas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la administración de dosis definidas para evaluar la interacción con dianas en las vías de regulación de la glucosa.
- Valor operativo: Proporciona una administración reproducible del compuesto para minimizar la variabilidad en la evaluación del fenotipo metabólico.
- Valor científico: Apoya la reducción de riesgos biológicos mediante la medición directa de los cambios en la glucosa sanguínea como lectura funcional de la modulación de dianas metabólicas.
Desarrollo de pruebas y cribado
- Valor científico: Genera mediciones cuantitativas de variables dependientes (niveles de glucosa en sangre) que permiten el análisis de respuesta a la dosis para la identificación de compuestos activos.
- Valor operativo: Estandariza el volumen de inyección según el peso del pez, mejorando la reproducibilidad del ensayo entre lotes experimentales.
- Valor científico: Facilita la preparación de sistemas biológicos validados para flujos de trabajo de cribado metabólico posterior.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Se alinea con sistemas relevantes para enfermedades al modelar la alteración de la homeostasis de la glucosa relacionada con la fisiopatología diabética.
- Valor operativo: Asegura la consistencia del procedimiento mediante protocolos estandarizados de ayuno, anestesia e inyección, favoreciendo la reproducibilidad entre laboratorios.
- Valor científico: Permite la reducción mecanicista de riesgos al aislar el efecto de los compuestos inyectados frente a la elevación de glucosa inducida por estrés, mediante controles con vehículo.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la validación del blanco hasta la optimización del fármaco líder, al proporcionar una ruta confiable para la administración de compuestos en ensayos metabólicos con pez cebra.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías en la regulación de la glucosa mediante la administración precisa de compuestos a peces cebra adultos.
- Tamizaje: Permite estar listo para ensayos mediante volúmenes de inyección estandarizados según el peso, que garantizan una exposición constante al compuesto.
- Análisis: Genera mediciones cuantitativas de glucosa en sangre que permiten comparar las respuestas metabólicas entre grupos tratados.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante el uso de un modelo vertebrado con mecanismos conservados de homeostasis glucídica.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable para el tamizaje de fenotipos metabólicos en múltiples series de compuestos y clases diana.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en el análisis de vías metabólicas.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización mediante volúmenes de inyección definidos y procedimientos controlados de anestesia.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos claros de respuesta a la dosis sobre la modulación de la homeostasis de la glucosa.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos basada en efectos metabólicos validados en un sistema de organismo completo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de pez cebra, anestesia y técnicas de inyección con microjeringa.
- Depende del acceso a bombas ultra-micro, jeringas NanoFil y sistemas de anestesia con control de temperatura.
- Necesita la estandarización entre equipos en cuanto a la duración del ayuno, la medición del peso y el cálculo del volumen de inyección.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes solubilidades de compuestos y volúmenes de inyección en solución salina Cortland como vehículo.
- Limitado por la habilidad técnica necesaria para mantener la aeración branquial y evitar traumatismos en el sitio de inyección durante la ejecución del procedimiento.
