Detección de actividad sialidasa Neu1 en la regulación de Toll-like receptor de activación

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar la inducción de la actividad celular de la nueva enzima sase en respuesta a la unión del ligando a su receptor específico. Esto se logra primero cultivando células sobre cubreobjetos circulares de vidrio de 12 milímetros en una placa de cultivo celular de 24 pocillos durante 24 horas. Como segundo paso, las células vivas adheridas al cubreobjeto de vidrio se colocan directamente en contacto con una mezcla previamente preparada de sustrato de sase y ligando del receptor, con o sin inhibidores específicos, sobre un portaobjetos para microscopio a continuación.

La laminilla del microscopio se coloca inmediatamente bajo un microscopio de fluorescencia para visualizar y capturar digitalmente las imágenes fluorescentes. Con el tiempo se obtienen resultados que muestran cambios en la actividad nueva de una sase en la superficie celular asociada con células vivas tratadas con ligando, basados en la intensidad de la fluorescencia azul que rodea a las células mediante microscopía de fluorescencia epiescopia.

La principal ventaja de utilizar esta técnica frente a métodos existentes como el análisis espectrofotométrico es que se usan menos reactivos. También se pueden observar y capturar imágenes de la actividad de sase en células vivas. Este método puede utilizarse para responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como examinar posibles interacciones novedosas entre ligandos y receptores, así como analizar los efectos de inhibidores específicos de enzimas o proteínas sobre la activación de receptores.

El procedimiento será demostrado por el Dr. Ray Amit y el Dr. PT Gath, antiguos estudiantes de doctorado de mi laboratorio que utilizan este ensayo en sus estudios de investigación. Antes de revivir las células de macrófagos congeladas, prepare el medio de cultivo utilizando medio de Eagle modificado estérilmente filtrado, suplementado con 10 % de suero bovino fetal y cinco microgramos por mililitro del antibiótico plasmina. Luego, añada cuatro mililitros del medio de cultivo a un frasco de cultivo celular de 25 centímetros cuadrados por cada vial de células congeladas, retire el vial de células congeladas del congelador a menos 80 grados Celsius y descongele rápidamente calentándolo con las manos dentro de la campana de contención biológica estéril.

Esto tomará aproximadamente de dos a tres minutos. Tan pronto como las células se descongelen, utilice una pipeta estéril de un mililitro para transferirlas rápidamente al frasco de cultivo celular que contiene el medio acondicionado. Coloque el frasco que contiene las células en un incubador de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono utilizando un microscopio invertido.

Revisear las células diariamente para observar crecimiento y adherencia hasta que alcancen una confluencia del 75 % al 90 % unos días antes de sembrar las células para el ensayo SASE. Preparar las laminillas circulares de vidrio de 12 milímetros en las que se sembrarán las células. En el gabinete de contención de riesgo biológico.

Coloque los portaobjetos en una placa de Petri de vidrio grande y esterilícelos sumergiéndolos en etanol al 100 % durante una hora. Retire el alcohol y deje los portaobjetos húmedos expuestos al flujo de aire estéril filtrado en el gabinete bajo luz UV durante 24 horas o hasta que estén secos para su siembra. Para comenzar, esterilice completamente una pinza curva de acero inoxidable de cuatro pulgadas con dientes mediante flameado.

Luego, use la pinza para colocar cuidadosamente una sola laminilla circular de vidrio estéril en cada pocillo de una placa de poliestireno tratada para cultivo de tejidos, de fondo plano y 24 pocillos. Utilizando una pipeta estéril de cinco mililitros, retire el medio condicionado DMEM del frasco que contiene las células de macrófagos adherentes. Lave las células una vez con solución salina tamponada con tris estéril 1x, pH 7,4, para eliminar cualquier medio que contenga suero.

A continuación, agregue un mililitro de tampón salino fosfato libre de fosfato con calcio a pH 7,4. Incube las células en un incubador a 37 grados Celsius durante aproximadamente 10 minutos o hasta que las células comiencen a desprenderse del frasco. Una vez que las células se hayan desprendido, agregue tres mililitros de medio condicionado DMEM a las células en suspensión.

Luego, transfiera 0,5 mililitros de la suspensión con aproximadamente 0,5 millones de células a cada portaobjetos circular de vidrio de 12 milímetros en la placa de 24 pocillos e incube la placa de cultivo celular que contiene las células de macrófagos a 37 grados Celsius en un 5% de dióxido de carbono durante 24 horas para permitir que las células se adhieran a los portaobjetos circulares de vidrio. El ensayo de actividad de sase se realizará bajo tres condiciones diferentes en tres microscopios separados. Portaobjetos en el primer portaobjetos, que sirve como negativo.

Las células de control se exponen al medio de montaje. El sustrato de neuraminidasa para ANA y el tampón salino al tris, pero no el ligando del receptor tipo toll LPS. En el segundo portaobjetos, las células se exponen al medio de montaje, al ligando del receptor tipo toll LPS y al tampón salino al tris.

En el tercer portaobjetos, las células se exponen al medio de montaje formado por ANA, LPS Tris, solución salina tamponada y el inhibidor de neuraminidasa Tamiflu. Demostraremos el procedimiento solo para el segundo ensayo, ya que los tres ensayos difieren únicamente en la mezcla de compuestos en el portaobjetos del microscopio. Coloque el portaobjetos sobre el banco de laboratorio y agregue los siguientes compuestos en orden secuencial.

Un microlitro de medio de montaje seguido por un microlitro de la forma dos microlitros de LPS y, por último, tres microlitros de solución salina tamponada con tris, pH 7.4. A continuación, retire el medio de un pocillo de la placa de 24 pocillos que contiene las células. El siguiente paso es el aspecto más difícil de este procedimiento, ya que debe retirar la cubreobjetos circular de vidrio del pocillo de la placa de cultivo de tejidos con la pinza sin romperla usando una pinza de cuatro pulgadas.

Levante suavemente la laminilla circular de vidrio hacia la esquina del pocillo y luego retírela cuidadosamente, colocando la laminilla con las células hacia abajo en la mezcla de solución. Sobre la platina del microscopio, lleve inmediatamente la laminilla a un microscopio epifluorescente ajustado para el filtro UV y equipado con una cámara digital para capturar imágenes fluorescentes. Enfoque el microscopio en contraste de fase hasta que pueda ver las células y luego cambie al modo fluorescente.

Adquiera imágenes de las células en modo fluorescente a los uno, dos y tres minutos. Además, adquiera una sola imagen de las células en representación de contraste de fase. A continuación se muestran los resultados de un experimento de ensayo sase.

Primero, como control negativo, se colocaron células vivas adheridas a un portaobjetos de vidrio en contacto directo con una mezcla de montaje que contenía el sustrato. Si estaba presente la actividad de la enzima IP sase, el sustrato se hidrolizaría para producir etil lum beone libre, el cual presenta una emisión fluorescente a 450 nanómetros tras la excitación a 365 nanómetros, medida a los dos minutos de añadir el sustrato.

Esta imagen fluorescente muestra que no hay actividad de SASE alrededor de las células. La siguiente imagen muestra los resultados de un ensayo SASE positivo, en el que células vivas adheridas a una lámina de vidrio se pusieron en contacto directo con una mezcla de un punto compuesta por medio de montaje, sustrato cuatro y el ligando LPS del TLR cuatro. El sustrato fue hidrolizado por la enzima SASE para producir etil lumbeona libre, y la imagen fluorescente tomada a los dos minutos tras añadir el sustrato y el LPS indica altos niveles de actividad de SASE alrededor de las células.

Sin embargo, cuando las células vivas se colocaron en contacto directo con una mezcla de un punto de medio de montaje formado por el sustrato nano, el ligando del TLR4 LPS y el inhibidor de neuraminidasa Tamiflu, la actividad de sase se redujo considerablemente o ya no se detectó, dependiendo de la concentración del inhibidor. Finalmente, este gráfico muestra la concentración inhibitoria 50 % del Tamiflu y del carboxilato de oseltamivir, determinada al graficar la disminución de la actividad de sase frente al logaritmo de la concentración del agente; la fluorescencia media alrededor de las células de cada grupo fue medida. Utilizando el software Image J, al intentar este procedimiento, es importante recordar cultivar las células sobre cubreobjetos circulares de vidrio en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos durante 24 horas antes de iniciar el ensayo Sade.

Además, todos los reactivos que se utilizan en este ensayo deben prepararse antes de comenzar el ensayo.