Name: Preparación de las matrices de demanda para la cuantificación de la contracción celular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Aprenda a preparar matrices de poliacrilamida para cuantificar la contracción celular mediante microscopía de fuerza de tracción. Este método permite estudiar cómo la rigidez de la matriz extracelular modula el comportamiento celular.

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Damos las gracias al laboratorio de Ulrich Schwarz para el software de seguimiento de cálculo utilizados en la cuantificación de las fuerzas de tracción celular (Sabass et al., 2008). Este trabajo fue apoyado por una concesión de carrera Burroughs Wellcome y el premio el director del NIH de Pioneer (DP10D00354) a ML Gardel y Médico Investigador Científico del Premio Nacional de Servicio (5 T32 GM07281) de invierno SP.

<ol><li>Damljanovic, V., Lajerholm, B. C., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+and+micropatterned+conjugation+of+extracellular+matrix+proteins+to+characterized+polyacrylamid+substrates+for+cell+mechanotransduction+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamid substrates for cell mechanotransduction assays.</a> Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).</li>
<li>Engler, A., Bacakova, L. N. ewman, Hategan, C., Griffin, A., M, D. D. ischer <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+compliance+versus+ligand+in+cell+on+gel+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Substrate compliance versus ligand in cell on gel responses.</a> Biophys J. 86 ((1 Pt 1)), 617-628 (2004).</li>
<li>Gardel, M. L., Sabass, B., Ji, L., Danuser, G., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+stress+in+focal+adhesions+correlates+biphasically+with+actin+retrograde+flow+speed%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Traction stress in focal adhesions correlates biphasically with actin retrograde flow speed.</a> J Cell Biol. 183, 999-1005 (2008).</li>
<li>Rajagopalan, P., Marganski, W. A., Brown, X. Q., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+of+the+spread+area%2C+contractility%2C+and+migration+of+balb%2Fc+3T3+fibroblasts+adhered+to+fibronectin-+and+RGD-modified+substrata%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata.</a> Biophys J. 87 (4), 2818-2827 (2004).</li>
<li>Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+and+mechanics+of+endothelial+cell+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The dynamics and mechanics of endothelial cell spreading.</a> Biophys J. 89, 676-689 (2005).</li>
<li>Stricker, J., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+traction+force+microscopy+for+micron-sized+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys%3A+Condensed+Matter%22%5BJournal%5D)">Optimization of traction force microscopy for micron-sized focal adhesions.</a> J. Phys: Condensed Matter. 22, 194104-194114 (2010).</li>
<li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophys J. 94, 207-220 (2008).</li>
<li>Yeung, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+substrate+stiffness+on+cell+morphology%2C+cytoskeletal+structure%2C+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).</li>
<li>Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule%2Forganelle+motility+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule/organelle motility assays.</a> Curr Protoc Cell Biol. , 13.1.1-13.1.21 (1998).</li>
</ol>

El procedimiento descrito aquí para la instalación de un microscopio de fuerza de tracción (TFM) experimento, junto con la implementación de rutinas de seguimiento de cálculo (Sabass et al., 2008), permite la cuantificación de las fuerzas de celulares con escala micrométrica resolución espacial. Para optimizar el protocolo experimental, es fundamental para formar un sustrato de gel puro y uniforme con capa uniforme de ligando ECM. Se discuten posibles escollos a continuación: No unifor...

<table><tbody><tr><td>3-aminopropiltrimetoxisilano</td><td>Aldrich</td><td>28, 177-8</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamida al 40%</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>Bis-acrylamida al 2%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1404</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 150-20</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas fluorescentes de 40 nm</td><td>Invitrogen</td><td>F8789</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de imagen confocal (RC-30)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0320</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugadora para cubreobjetos</td><td>Hecho en casa</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Lámpara ultravioleta CL1000</td><td>UVP Inc.</td><td>95-0228-01</td><td></td></tr><tr><td>Estantería de acero inoxidable</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72239-04</td><td></td></tr><tr><td>acryloyl-X, SE (6-((acryloyl)amino)hexanoic acid)</td><td>Invitrogen</td><td>A-20770</td><td></td></tr><tr><td>Hidrazina hidratada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>225819</td><td></td></tr><tr><td>Meta-periodato de sodio</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>20504</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos (#1.5)</td><td>Corning</td><td>2940&amp;#8208;224</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>Rain-X</td><td>SOPUS Products</td><td>www.rainx.com</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Acros Organics</td><td>64-19-7</td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de las matrices de demanda para la cuantificación de la contracción celular

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

La regulación de la adhesión celular a la matriz extracelular (MEC) es esencial para la migración celular y la remodelación de ECM. Adhesiones focales son conjuntos macromoleculares que la pareja contráctil F-actina del citoesqueleto a la matriz extracelular. Esta conexión permite la transmisión intracelular de las fuerzas mecánicas a través de la membrana celular al sustrato subyacente. Trabajos recientes han demostrado las propiedades mecánicas de la ECM regular de adhesión focal y la morfología de la F-actina, así como numerosos procesos fisiológicos, como la diferenciación celular, la división, proliferación y migración. Por lo tanto, el uso de sustratos de cultivo celular se ha convertido en un método cada vez más frecuente para controlar con precisión y modulan las propiedades mecánicas de ECM. Para cuantificar las fuerzas de tracción en las adhesiones focales en células adherentes, sustratos compatibles se utilizan en combinación con imágenes de alta resolución y las técnicas de cómputo en un método llamado microscopio de fuerza de tracción (TFM). Esta técnica se basa en la medición de la magnitud local y dirección de las deformaciones inducidas por la contracción del sustrato celular. En combinación con la alta resolución de la microscopía de fluorescencia de las proteínas de marcado con fluorescencia, es posible correlacionar la organización del citoesqueleto y remodelación con las fuerzas de tracción. Aquí se presenta un protocolo experimental detallado para la preparación de dos dimensiones, matrices cumplen con el propósito de crear un sustrato de cultivo de células con un bien caracterizado, la rigidez mecánica ajustable, lo que es adecuado para medir la contracción celular. Estos protocolos incluyen la fabricación de hidrogeles de poliacrilamida, capa de proteínas ECM en tales geles, las células de revestimiento de gel, de alta resolución y microscopía confocal utilizando una cámara de perfusión. Además, ofrecemos una muestra representativa de los datos que demuestran la ubicación y magnitud de las fuerzas celular utilizando protocolos citados TFM.

En este vídeo, que muestran las técnicas experimentales utilizadas para la fabricación de cumplimiento, la matriz extracelular (ECM) sustratos recubiertos adecuadas para el cultivo celular, y que son susceptibles de microscopía de fuerza de tracción y observando los efectos de la rigidez de ECM en el comportamiento celular.

Preparación de las matrices de demanda para la cuantificación de la contracción celular

La regulación de la adhesión celular a la matriz extracelular (MEC) es esencial para la migración celular y la remodelación de la MEC. Las adhesiones focales son...

El objetivo general de este procedimiento es crear matrices compatibles para modular y cuantificar la contracción celular. Esto se logra primero activando un cubreobjetos para permitir la anclaje de la matriz. El segundo paso del procedimiento consiste en polimerizar un gel de poliacrilamida al cubreobjetos activado.El tercer paso del procedimiento consiste en sembrar las células sobre el gel y permitir que se adhieran. El paso final del procedimiento es obtener imágenes del gel para generar datos que serán analizados mediante protocolos de microscopía de fuerza de tracción. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren cómo las células aplican fuerzas de tracción sobre su matriz mediante la microscopía de fuerza de tracción.Hola, soy Yvonne Eons del laboratorio de Margaret ELL en el Departamento de Física y el Instituto de Dinámica Biofísica de la Universidad de Chicago. Soy Steven Winter, también del laboratorio Guard. Hoy queremos mostrarles un procedimiento para elaborar matrices flexibles destinadas a medir la contracción celular.Utilizamos estos procedimientos en nuestro laboratorio para estudiar redes contráctiles de actina y miosina. Así que comencemos. Ant

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Se describe el método para producir prototípico cubreobjetos de microscopio recubiertos de gelatina fluorescente para visualizar invadopodios mediada por la degradación de la matriz. Técnicas computacionales utilizando software disponible se presentan para la cuantificación de los niveles resultantes de la proteólisis matriz por las células individuales dentro de una población mixta y para los grupos multicelulares que abarcan todo campos microscópicos.

La medición cuantitativa de invadopodios mediada por proteolisis de la matriz extracelular en contextos simples y multicelulares

Este video describe la medición de la contracción de las células del músculo liso aórtico (SMC) utilizando la detección de impedancia eléctrica de sustrato de la célula, o ECIS. ECIS mide la locomoción de las células y es un método fiable para medir las contracciones.

Medición de la contracción de SMC in vitro: un método no invasivo para evaluar la contracción de las células musculares lisas mediante la detección de impedancia eléctrica de sustrato celular

Este protocolo describe el uso de palancas de silicio microescala como superficies de cultivo flexibles para la medición de la contractilidad de las células musculares in vitro. La contracción celular hace que la flexión en voladizo, que se puede medir, grabada, y se convierte en lecturas de fuerza, proporcionando un sistema no invasivo y escalable para la medición de la función contráctil in vitro.

Utilización de microescala silicio voladizos para evaluar la función contráctil celular In Vitro

Aquí, describimos el desarrollo y la aplicación de un ensayo de contracción en gel para evaluar la función contráctil en células mesenquimales que experimentaron una transición epitelio-mesenquimatosa.

Desarrollo de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayo para evaluar la función contráctil de las células mesenquimales que la transición epitelio-mesenquimal Sufrió

La diferenciación celular está regulada por una serie de factores microambientales, incluyendo tanto la composición de la matriz y de material de sustrato propiedades. Se describe aquí una técnica utilizando microarrays de células en combinación con microscopía de fuerza de tracción para evaluar tanto la diferenciación celular y las interacciones célula-sustrato biomecánicas como una función del contexto microambientales.

Una de alto rendimiento plataforma de microarrays de células para análisis correlativo de la diferenciación celular y las fuerzas de tracción

Las fuerzas mecánicas son importantes para controlar la migración celular. Este protocolo demuestra el uso de hidrogeles elásticos que se pueden deformar utilizando una micropipeta de vidrio y un micromanipulador para estimular las células con un gradiente de rigidez local para provocar cambios en la estructura celular y la migración.

Ensayo Desafiador durotaxis de una sola célula para evaluar el control mecánico del movimiento celular y los eventos de señalización relacionados

Presentamos un protocolo para evaluar los efectos electromecánicos de la activación de GtACR1 en cardiomiocitos de conejo. Proporcionamos información detallada sobre el aislamiento celular, el cultivo y la transducción adenoviral, y sobre experimentos funcionales con las técnicas de abrazadera de parche y fibra de carbono.

Evaluación electromecánica de la actividad de cardiomiocitos moduladas optogenéticamente

Este artículo describe un método basado en el cultivo de explantes para el aislamiento y cultivo de células primarias del músculo liso aórtico humano específico del paciente y fibroblastos dérmicos. Además, se presenta un nuevo método para medir la contracción celular y el análisis posterior, que se puede utilizar para estudiar las diferencias específicas del paciente en estas células.

Aislamiento de células primarias del músculo liso aórtico específicas del paciente y mediciones semicuantitativas de contracción en tiempo real in vitro

Este trabajo presenta un protocolo flexible para utilizar la tecnología de superficies contráctiles elastoméricas marcadas fluorescentemente (FLECS) en formato de micropozos para una cuantificación simplificada y sin intervención de las fuerzas contráctiles de una sola célula basada en desplazamientos visualizados de micropatrones de proteínas fluorescentes.

Análisis simplificado y de alto rendimiento de la contractilidad de una sola célula utilizando elastómeros con micropatrones

El análisis de los cambios en la función contráctil y la integridad celular de los cardiomiocitos humanos derivados de iPSC es de inmensa importancia para el desarrollo de fármacos no clínicos. Un sistema híbrido de análisis celular de 96 pocillos aborda ambos parámetros en tiempo real y de manera fisiológica para obtener resultados confiables y relevantes para el ser humano, necesarios para una transición segura a las etapas clínicas.

Sistema de análisis de células híbridas para evaluar cambios estructurales y contráctiles de cardiomiocitos humanos derivados de iPSC para la evaluación preclínica del riesgo cardíaco

Este protocolo describe cómo medir la contractilidad en cardiomiocitos primarios humanos adultos de corazones de donantes con el sistema MyoBLAZER, una plataforma fiable para evaluar los cambios en la contractilidad inducidos por fármacos durante el desarrollo preclínico.

Medición de la contractilidad cardíaca en cardiomiocitos primarios humanos adultos aislados

Aprenda a preparar matrices de poliacrilamida para cuantificar la contracción celular mediante microscopía de fuerza de tracción. Este método permite estudiar cómo la rigidez de la matriz extracelular modula el comportamiento celular.

Preparación de las matrices de demanda para la cuantificación de la contracción celular

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