Preparación de las matrices de demanda para la cuantificación de la contracción celular

El objetivo general de este procedimiento es crear matrices compatibles para modular y cuantificar la contracción celular. Esto se logra primero activando un cubreobjetos para permitir la anclaje de la matriz. El segundo paso del procedimiento consiste en polimerizar un gel de poliacrilamida al cubreobjetos activado.

El tercer paso del procedimiento consiste en sembrar las células sobre el gel y permitir que se adhieran. El paso final del procedimiento es obtener imágenes del gel para generar datos que serán analizados mediante protocolos de microscopía de fuerza de tracción. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren cómo las células aplican fuerzas de tracción sobre su matriz mediante la microscopía de fuerza de tracción.

Hola, soy Yvonne Eons del laboratorio de Margaret ELL en el Departamento de Física y el Instituto de Dinámica Biofísica de la Universidad de Chicago. Soy Steven Winter, también del laboratorio Guard. Hoy queremos mostrarles un procedimiento para elaborar matrices flexibles destinadas a medir la contracción celular.

Utilizamos estos procedimientos en nuestro laboratorio para estudiar redes contráctiles de actina y miosina. Así que comencemos. Antes de la activación del cubreobjetos, coloque varios cubreobjetos número 1.5 de 22 por 40 milímetros previamente.

Lave con etanol al 70 % en un estante de acero inoxidable de manera que las laminillas estén separadas y no se toquen. Trabajando en una campana extractora de gases, prepare una solución al 2 % de tres o perfil trimet menor en isopropanol dentro de un recipiente cuadrado de vidrio. Utilice una pipeta de vidrio tipo espagueti para agregar el perfil de tres o menor.

Trimeth oxy debido a su reactividad con el plástico, sumerja completamente las laminillas en esta solución e incube durante 10 minutos con agitación en una placa agitadora dentro de la campana extractora. Después de remojar las laminillas, lávelas sumergiéndolas en agua doblemente destilada. Cambie el agua cuatro veces tras el último intercambio.

Deje en remojo durante 10 minutos con agitación. Luego, seque las laminillas en una incubadora a aproximadamente 37 grados Celsius durante 10 minutos. Una vez secas, déjelas enfriar a temperatura ambiente.

Sumerja los cubreobjetos en una solución de glutaraldehído al 1 % en agua doblemente destilada. Incube en un recipiente de vidrio cuadrado sobre una placa agitadora durante 30 minutos. Asegúrese de utilizar un recipiente limpio.

De lo contrario, la solución podría verse turbia posteriormente. Lave las laminillas mediante tres cambios de agua doblemente destilada, durante 10 minutos por cada cambio, con agitación. A continuación, cúbralas con papel de aluminio para evitar el polvo y séquelas a temperatura ambiente.

Una vez secos, guarde los cubreobjetos en un lugar seco y protegido del polvo durante hasta dos meses. Para preparar el gel de poliacrilamida o PAA, primero prepare soluciones stock de acrilamida-bis. Mezcle acrilamida al 40 % y bis-acrilamida al 2 % según se describe en el protocolo RI.

Degase la solución de acrilamida en una cámara de vacío durante 20 minutos. Esto reduce el oxígeno dentro del gel, lo cual evita la polimerización. Mientras tanto, prepare una solución de persulfato de amonio al 10 % o una solución de PS.

Luego limpie portaobjetos de microscopio de vidrio de una por tres pulgadas con toallitas Rain X para hacer la superficie del portaobjeto hidrofóbica. Retire cualquier polvo con una toallita Kim para asegurar una superficie de gel uniforme. Cubra el portaobjeto con papel de aluminio y déjelo aparte.

Luego, retire la solución de acrilamida de la cámara de vacío y agregue perlas fluorescentes. Para iniciar la polimerización del gel, añada 0,75 microlitros de TM E y 2,5 microlitros de PS al 10 %. Mezcle brevemente la solución pipeteando hacia arriba y hacia abajo. A continuación, aplique de 10 a 12 microlitros de la solución de acrilamida sobre el portaobjetos hidrofóbico previamente preparado.

Coloque un cubreobjetos activado de 22 por 40 milímetros encima de la gota. La solución de gel debe recubrir completamente el cubreobjetos. Alise cualquier burbuja que pueda aparecer dentro de la solución.

Deje que la solución del gel polimerice a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos. Una vez polimerizada, la gelatina se separará del borde del cubreobjetos. Utilizando la punta fina de un par de pinzas, retire cuidadosamente el cubreobjetos de la superficie del portaobjetos con el gel adherido.

Sumerja el gel en una placa de Petri que contenga agua doblemente destilada para mantener una superficie de gel hidratada y así entrecruzar la matriz extracelular o proteína ECM al gel. Primero, prepare alícuotas de trabajo de 40 microlitros de sulfur san par disolviendo el polvo de SULF san par en óxido de dimetilsulfuro anhidro o DMSO. A continuación, retire el agua doblemente destilada de la superficie del gel utilizando brevemente nuestro centrífugo de cubreobjetos.

Teniendo cuidado de no secar el gel inmediatamente antes de su uso. Diluya las alícuotas de sulfuro de sampa en DMSO con agua doblemente destilada y cubra el centro de la superficie del gel con aproximadamente 200 microlitros. Luego, exponga la superficie del gel a luz UV en un horno de cruzamiento por UV.

Después de la exposición a UV, sumerja las laminillas en un vaso de precipitados con agua doblemente destilada fresca. Retire cualquier solución de la superficie del gel utilizando un centrífugo para laminillas. Luego coloque el param en un recipiente de placa de Petri y añada 50 microlitros de fibronectina fría sobre el param.

Dar la vuelta al cubreobjetos y colocar el lado del gel encima de la fibronectina. Dejar que los cubreobjetos reaccionen a temperatura ambiente durante una a dos horas o a cuatro grados Celsius durante la noche. Después de la incubación en una campana de cultivo de tejidos estéril y ventilada.

Coloque las laminillas en placas de cultivo de tejidos de seis centímetros que contengan PBS para recubrir las laminillas. Lave extensamente las laminillas con varios cambios de PBS en condiciones estériles tras el lavado. Esterilice las laminillas mediante tratamiento con UV durante 30 minutos.

Posteriormente, incubar las laminillas en medio celular durante 30 a 45 minutos antes de sembrar las células. A continuación, colocar una laminilla de 22 por 30 milímetros en el soporte superior para laminillas de una cámara de imagen confocal de Warner Instruments, utilizando grasa de vacío para mantener la laminilla en su lugar. Colocar una junta de goma formadora de cámara encima de la laminilla, permitiendo el acceso a los tubos de polietileno de entrada y salida.

Esto permitirá un espaciado de 150 a 1000 micrones entre la cubreobjetos superior y la cubreobjetos recubierta con gel de 22 por 40 milímetros, dependiendo del tamaño de la junta utilizada. Luego, cargue las jeringas que contienen medio celular tibio en los tubos de entrada mediante el kit de conectores, y verifique que el medio fluya a través de los tubos y hacia la cubreobjetos superior. Aplique grasa al vacío sobre la base de la cámara y coloque una cubreobjetos de 22 por 40 milímetros recubierta con gel, con el lado celular hacia arriba.

Aplique el medio tibio a las células. Coloque el soporte superior de la laminilla sobre la base de la cámara, con las juntas de la cámara separándolo de la laminilla recubierta con gel. Asegúrese de que los pasadores de ubicación dentro de la base de la cámara encajen en los orificios de ubicación del soporte superior de la laminilla.

Aplique la placa de presión a la base de la cámara y utilice la llave de la placa de presión para atornillar y asegurar la placa de presión. Verifique el flujo del medio a través del tubo y la cámara para monitorear posibles fugas dentro de la cámara. Y para eliminar cualquier zona libre de medio en la superficie celular.

Aplique la cámara de microscopía confocal al adaptador del portaobjetos situado dentro de un soporte de microscopio para obtener imágenes, mediante un microscopio confocal fluorescente, de la proteína marcada con fluorescencia y de las microesferas fluorescentes embebidas en el sustrato de gel, con el fin de capturar una imagen de la posición de las microesferas sin deformar dentro del gel perfundido. Realice repeticiones para separar las adhesiones celulares del gel y capture una imagen de las microesferas fluorescentes en el mismo campo de imagen donde se encuentran las células. Cuando el protocolo se sigue correctamente, la superficie del gel será relativamente plana y lisa, con microesferas fluorescentes distribuidas uniformemente en todo el material.

La MEC también se puede visualizar mediante inmunofluorescencia de fibronectina. Si se mide la contracción del gel en la ubicación de las adhesiones focales, la obtención de imágenes del gel y las células debe realizarse en el plano óptico confocal de las adhesiones focales. Aquí, las adhesiones focales se visualizan en un experimento de fuerza de atracción en una célula de osteosarcoma humano o célula U2 OS marcada con GFP pxi.

La contracción de un gel puede visualizarse mediante el desplazamiento de microesferas fluorescentes incrustadas bajo adhesiones focales. La comparación de microesferas deformadas en verde y posiciones de microesferas sin deformación en rojo permite cuantificar el desplazamiento del sustrato de gel durante la contracción. A continuación se muestra un resultado representativo de una célula extendida que se desprende de la superficie del gel mediante tripsina. Este es un resultado representativo al comparar las posiciones de microesferas deformadas y sin deformar.

El uso de algoritmos computacionales sofisticados puede generar tensiones de tracción asociadas con el desplazamiento de las microesferas y el módulo elástico de los geles. Estas tensiones se visualizan aquí mediante un mapa de escala de calor y con vectores, donde los colores más cálidos en el mapa térmico y las flechas más grandes indican fuerzas más intensas. Acabamos de mostrarle cómo preparar matrices flexibles para medir la contracción celular al realizar este procedimiento.

Es importante planificar con anticipación para que los pasos sensibles al tiempo puedan realizarse rápidamente. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.