Name: La producción de extracto de embrión de pollo para el Cultivo de murino crestas de células neurales madre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprenda a preparar extracto de embrión de pollo de 11 días para cultivar células madre de cresta neural murina. Este protocolo estandarizado incluye maceración, centrifugación y filtración para obtener CEE de alta calidad.

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El apoyo y asesoramiento de Markus Pajtler Bohrer y Robert fueron de gran valor para la visualización de este protocolo.

Los autores afirman que los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las Comunidades Europeas la Directiva del Consejo (86/609/CEE), siguiendo las directrices de los NIH sobre el cuidado y uso de animales en los procedimientos experimentales y los reglamentos establecidos por el Comité Institucional la atención y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Duisburg-Essen (Alemania). Parte 1: Configuración (no se muestra en el vídeo) La elaboración de materiales y soluciones (antes de tomar los huevos de la incubadora) <ul><li> Los huevos que se incuban en una incubadora humidificada durante 11 días a 37 ° C (100 ° F). </li><li> 70% de etanol en aerosol, placas limpias, precisas pinzas limpias, 4 ° C (40 ° F) en frío estéril DMEM en hielo y 60 ml jeringas estériles </li><li> Tubos de 50 ml estéril Corning tiene que ser a medio llenar con 4 ° C frío DMEM para mezclar los embriones macerado en una proporción de 1:1 (en masa macerada: DMEM). Tan pronto como los huevos se sacan de la disección de la incubadora de los embriones de pollo tiene que ser iniciado. </li><li> Esterilizar las herramientas de disección en el autoclave o en el día de la disección, sumerja los instrumentos en el 70% de etanol durante 20 minutos. </li></ul> Parte 2: La disección de los embriones de pollo (demostrado en el vídeo) <ol><li> Húmedo los huevos se incuban con un spray de etanol al 70% por lo menos durante 30 segundos y secarlos cuidadosamente con toallas de papel suave, mientras que los huevos no sacudir demasiado. Nota: Se recomienda la disección no más de 60 embriones de pollo al mismo tiempo. </li><li> Abrir los huevos con cuidado por estrellarse contra un borde afilado y sacar el embrión con cuidado de no destruir el saco vitelino del embrión de pollo o de sí mismo. </li><li> Busque el principio de que el cordón umbilical de forma rápida y abrir el envoltorio transparente, sin destruir el saco vitelino o pequeños vasos. A continuación, analizar el cordón umbilical con unas pinzas limpias precisa. </li><li> Tome el embrión fuera del saco vitelino. Nota: Los embriones deben ser decapitados rápidamente (no se muestra en el video). </li><li> Recoger los embriones en medio esencial mínimo a 4 ° C. </li></ol> Parte 3: Maceración de los embriones de pollo <ol><li> Tome el émbolo de una jeringa de 60 mL estéril. </li><li> Transferencia de aproximadamente 10 embriones en una sola jeringa de 60 ml. </li><li> Ponga el émbolo con cuidado en la jeringa con el fin de no arriesgarse a perder el material macerado. </li><li> Macerar por empujando el émbolo. </li><li> Recoger la masa macerada en los tubos preparados Corning llenó medio con DMEM en una proporción de 1:1 (en masa macerada: DMEM). Con 10 embriones de un volumen aproximado de 25 ml se produce. </li><li> Coloque la mezcla en un agitador durante 45 min a 4 ° C. </li></ol> Parte 4: La centrifugación del embrión de pollo - Suspensión DMEM <ol><li> Transferencia de embrión de pollo - DMEM suspensión en los tubos de centrifugación. </li><li> Añadir hialuronidasa estéril a una concentración de 1 mg por cada 25 mg de embrión. </li><li> Tara de los tubos de centrifugación de manera muy precisa. Nota: Este paso debe realizarse con precaución, ya que la centrifugación se ejecuta en muy alto g-fuerza y el daño material o una centrifugadora, podría ocurrir si se utilizan tubos de desequilibrio. Con una alta precisión de pesaje de la máquina acuerdo con respecto a las tres posiciones después del punto decimal para todos los tubos deben ser recibidos por el ajuste de la cantidad que falta con DMEM. </li><li> Reducir la temperatura de la centrífuga a 4 ° C. Nota: Además, el rotor de centrifugación deben ser almacenados en una cámara de refrigeración o refrigerador durante la noche. </li><li> Centrífuga 6 horas por lo menos para 180.000 xgx h. Nota: Para obtener mejores resultados con respecto a la separación de las fases de un solo uso xgx 266.000 h. Si es posible, utilice el ajuste de vacío. </li></ol> Parte 5: Filtración del extracto de Embrión de Pollo Después de la centrifugación de tres fases se puede notar: La fase superior de líquido sucio con fragmentos de grasa, la fase líquida en el centro y el sedimento en el fondo del tubo de centrifugación. Nota: Temblor o movimiento rápido de la mezcla se centrifuga tiene que ser estrictamente evitados, ya que esto destruiría el resultado de la etapa de centrifugación por la pérdida de la fase líquida y clara central. Nota: Todos los pasos siguientes deben llevarse a cabo en condiciones asépticas utilizando un banco de flujo laminar de aire: <ol><li> Pipeta de la fase líquida en un sistema de filtros con poros de 0,45 micras. A continuación, encienda la bomba de vacío conectada. Nota: No toque la bolita en la parte inferior. Esto daría lugar a una contaminación de la extracción y un bloqueo del sistema de filtro. </li><li> Transferir el extracto pre-en un sistema de filtros con poros de 0,22 micras y el interruptor de la bomba de vacío conectada de nuevo. </li><li> Alícuota del extracto obtenido de embrión de polloen tubos estériles de 15 ml Corning. </li><li> Rápidamente almacenar las alícuotas a -80 ° C (-62 ° F). Nota: La duración de hasta dos años de Europa central y oriental, si se almacena a -80 ° C. </li></ol>

<ol><li>Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+analysis+reveals+multipotency+of+some+avian+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells.</a> Nature. 335, 161-164 (1988).</li>
<li>Stemple, D. L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+stem+cell+for+neurons+and+glia+from+the+mammalian+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest.</a> Cell. 71, 973-985 (1992).</li>
<li>Rao, M. S., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+and+controlled+in+vitro+differentiation+of+murine+multipotent+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Immortalization and controlled in vitro differentiation of murine multipotent neural crest stem cells.</a> J Neurobiol. 32, 722-746 (1997).</li>
<li>Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+glial+fate+acquisition+of+neural+crest+cells+are+regulated+by+an+interplay+between+the+transcription+factor+Sox10+and+extrinsic+combinatorial+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling.</a> Cell. 128, 3949-3961 (2001).</li>
<li>Kim, J., Lo, L., Dormand, E., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX10+maintains+multipotency+and+inhibits+neuronal+differentiation+of+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SOX10 maintains multipotency and inhibits neuronal differentiation of neural crest stem cells.</a> Neuron. 38, 17-31 (2003).</li>
<li>Anderson, D. J., Groves, A., Lo, L., Ma, Q., Rao, M., Shah, N. M., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+determination+and+the+control+of+neuronal+identity+in+the+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Review+Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell lineage determination and the control of neuronal identity in the neural crest.</a> Review Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 493-504 (1997).</li>
<li>Dorsky, R. I., Moon, R. T., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+signals+and+cell+fate+specification+in+premigratory+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Review+Bioessays%22%5BJournal%5D)">Environmental signals and cell fate specification in premigratory neural crest.</a> Review Bioessays. 22, 708-716 (2000).</li>
<li>Sieber-Blum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+controlling+lineage+specification+in+the+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Factors controlling lineage specification in the neural crest.</a> Int Rev Cytol. 197, 1-33 (2000).</li>
<li>Dupin, E., Real, C., Ledouarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+crest+stem+cells%3A+control+of+neural+crest+cell+fate+and+plasticity+by+endothelin-3%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">The neural crest stem cells: control of neural crest cell fate and plasticity by endothelin-3.</a> Int Rev Cytol. 73, 533-545 (2001).</li>
<li>Maurer, J., Fuchs, S., Jäger, R., Kurz, B., Sommer, L., Schorle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+controlled+differentiation+of+neural+crest+stem+cell+lines+using+conditional+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Establishment and controlled differentiation of neural crest stem cell lines using conditional transgenesis.</a> Differentiation. 75, 890-891 (2007).</li>
<li>Wu, Y. Y., Mujtaba, T., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+stem+and+precursor+cells+from+fetal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of stem and precursor cells from fetal tissue.</a> Methods Mol Biol. 198, 29-40 (2002).</li>
</ol>

Este protocolo se basa en modificaciones de los procedimientos que se han descrito en el pasado 10,11. Además de las publicaciones anteriores que aquí muestran los distintos pasos diferentes del proceso de ampliación más. Esto apoya el experimentador con detalles importantes asegurando los procedimientos correctos y los resultados fiables. Además, como el proceso de disección es una parte esencial de la extracción de Europa central y oriental se describe el procedimiento de toma de los embriones fuera del sac...

<table><tbody><tr><td>Huevos de pollo incubados durante 11 días</td><td>Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espray desinfectante alcohólico</td><td>Sch&amp;#252;lke Mayr GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEMGlutamax</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringa estéril (60 ml)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos estériles (50; 15 ml)</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta estériles</td><td>Starlab GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidasa tipo IV-S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milipore stericups estériles (0.45; 0.22 &amp;mu;l)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas estériles (25; 10; 5 ml)</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga L5-50</td><td>Tipo de rotor Ti-45</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la producción de extracto de embrión de pollo para el cultivo de murino crestas de células neurales madre

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

La cresta neural nace de la neuro-ectodermo durante la embriogénesis y persiste sólo temporalmente. Los primeros experimentos ya prueba de las células progenitoras pluripotentes a ser una parte integral de la cresta neural 1. Fenotípicamente, las células troncales de la cresta neural (NCSC) se definen por la vez que expresa p75 (bajo afín crecimiento de los nervios del receptor del factor, LNGFR) y SOX10 durante su migración desde la cresta neural, 2,3,4,5. Estas células progenitoras pueden diferenciarse en células musculares lisas, células cromafines, neuronas y células gliales, así como los melanocitos, cartílago y hueso 6,7,8,9. Para cultivar NCSC in vitro, un especial de madre de la cresta neural medio celular (NCSCM) se requiere 10. La parte más compleja de la NCSCM es la preparación del extracto de embrión de pollo (CEE), que representan una fuente esencial de los factores de crecimiento para el NCSC, así como para otros tipos de explantes neural. Otros ingredientes NCSCM lado CEE están disponibles comercialmente. La producción de CCE de laboratorio con equipamiento de serie es de gran importancia para conocer los detalles difíciles como el aislamiento, la maceración, la centrifugación, y los procesos de filtración. En este protocolo se describen las técnicas precisas para producir una cantidad al máximo de calidad en estado puro y de alta CEE.

Para cultivar las células troncales de la cresta neural (NCSC) in vitro, un medio especial (NCSCM) es necesario. Parte esencial de NCSCM es el extracto de embrión de pollo (CEE). Se describen las técnicas precisas para producir una cantidad al máximo de calidad en estado puro y de alta CEE, incluyendo detalles como el aislamiento, la maceración, la centrifugación, y los procesos de filtración.

La producción de extracto de embrión de pollo para el Cultivo de murino crestas de células neurales madre

La cresta neural se origina a partir del neuroectodermo durante la embriogénesis y persiste solo temporalmente. Experimentos tempranos ya demostraron la pluripotencia...

Hola, mi nombre es Annaa del laboratorio de la profesora Ika Egar en el Departamento de Oncología Pediátrica del Hospital Pediátrico Universitario, Esen, Alemania. Hoy les mostraremos un procedimiento para preparar extractos de pollos embrionarios prenatales de 11 días de edad. Coloque el DMEM en hielo para enfriarlo hasta al menos cuatro grados Celsius.Utilizamos DMEM con glutamato de GIBCO preparado en tubos estériles, llenándolos hasta la mitad. Con el MEM, lave los huevos con etanol al 70 % en volumen que hayan sido incubados durante 11 días a 100 grados Fahrenheit en un incubador humedecido. Asegúrese de dejar que el etanol se absorba durante al menos 30 segundos.Después de aplicarlo, seque cuidadosamente los huevos con toallas de papel suaves. Limpie una placa de plástico o vidrio con etanol. Abra los huevos.Coloque cuidadosamente el embrión en la placa. No destruya el EC ni ningún vaso pequeño. Utilice juegos de alfileres de precisión afilados y limpios para diseccionar los embriones.Primero, busque el cordón umbilical. Nuevamente, no destruya el yac ni ningún vaso pequeño mientras busca el cordón umbilical. Una vez que haya encontrado el cordón umbilical, siga hasta su origen y disecciónelo.Después de abrir el envoltorio transparente sobre el embrión, retire cuidadosamente el embrión del EC sin destruirlo. Coloque los embriones en medio mínimo esencial estéril sobre hielo. Utilizamos DMEM con glutamato de gyp Co. Retire el émbolo de una jeringa estéril de 60 mililitros.Coloque aproximadamente 10 embriones a la vez en la jeringa. Introduzca el émbolo en la jeringa. Madure los embriones presionando hacia abajo el émbolo.Tenga cuidado de no aplicar demasiada presión, ya que de lo contrario perderá material madurado. Recolecte los embriones madurados en los tubos preparados en una proporción de uno a uno, embriones respecto a los embriones MEM 10. Debe producir aproximadamente 25 mililitros de volumen.Agite la mezcla de la proporción de uno a uno de embriones a EMEM durante 45 minutos a cuatro grados Celsius. Transfiera cuidadosamente la mezcla a los tubos de centrifugación. Añada los días de hialuronidasa rile.Utilizamos los días R Hay de testículo de bovino de Sigma. Desgarre los tubos de centrífuga con una balanza analítica especial de precisión AC. Es muy importante tener cuidado con las tres cifras después del punto decimal.Deben ser iguales. De lo contrario, existe el riesgo de tener problemas con la centrífuga debido a la alta velocidad necesaria para centrifugar la mezcla. Si es necesario, ajuste las diferencias pipeteando la cantidad faltante del MEM. El rotor debería haber estado dentro de un refrigerador o una cámara de enfriamiento durante la noche para enfriarlo hasta cuatro grados Celsius.Los tubos de centrifugación deben cerrarse muy bien. De lo contrario, existe el riesgo de tener problemas para sacarlos del rotor. Después de la centrifugación, llene el rotor con los tubos y ciérrelo muy bien con anticipación.Enfríe la centrífuga hasta cuatro grados Celsius. Utilice vacío en todos los casos. Espere hasta que el rotor haya alcanzado su velocidad final.Si ocurre algo extraño, detenga inmediatamente la centrífuga. Presione el botón de freno para detener la centrifugación. Esto ocurre después de que un rotor TI I 45 haya funcionado durante seis horas a una velocidad de 45 000 revoluciones por minuto.Retire cuidadosamente los tubos. No los agite en absoluto, ya que esto podría provocar un aumento de la capa líquida superior turbia dentro de los tubos. Observe las tres fases.En la parte superior hay un líquido turbio con fragmentos grasos. En el medio, hay un líquido claro, y en la parte inferior se puede observar el sedimento. Tenga mucho cuidado al recoger la fase clara del centro del tubo.No toque en absoluto el precipitado, ya que esto provocaría contaminación del extracto y también obstrucción del sistema de filtración. Primero, utilice un filtro de 0,45 micrómetros conectado a una bomba de vacío. En el segundo paso, filtre el líquido obtenido a través de un filtro de 0,22 micrómetros. También conecte a la bomba de vacío para introducir el extracto en los tubos.Finalmente, almacene los tubos a menos 80 grados Celsius.

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Investigación

JoVE Journal

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Neurociencia

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Cultura de ratón con células madre neurales Precursores

Inducción neural es el primer paso en la formación del cerebro. Se trata de un mecanismo por el cual el nodo de Hensen (organizador), instruye a los tejidos adyacentes a la adopción de un destino neuronal, es decir, para dar lugar al sistema nervioso. Este video muestra un ensayo de inducción neural en el embrión de pollo.

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Aislamiento de cresta neural embrionario del tubo neural facilita el uso...

Aislamiento y cultivo de células de la cresta neural de embriones murinos del Tubo Neural

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