Name: La disección de los elementos humanos Cuerpo Vítreo para el análisis proteómico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-23T17:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Aprenda técnicas de disección del cuerpo vítreo humano para análisis proteómico en ojos post mortem. Este método permite aislar subestructuras como el hialoides anterior y la base vítrea con precisión.

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El financiamiento fue proporcionado por la lucha por la vista. Los tejidos fueron obtenidos a partir del Banco de Ojos Iowa Leones.

1. La disección del segmento anterior. <ol><li> La córnea se elimina en primer lugar hacer una incisión en el limbo en la cámara anterior con una hoja de 15 ° (Figura 1). A continuación, una hoja de curva escleral córnea-tijera se introduce en la cámara anterior. Cortes circunferenciales se hacen en la córnea, justo por delante del limbo. </li><li> 0,12 Colibri pinzas y tijeras Westcott se utilizan para cortar la circunferencia anterior del iris en el cuerpo ciliar. </li><li> El núcleo del cristalino se extrae con pinzas de 0,12 Colibri o una cuchilla de 15 ° (supersharp) y la corteza y la cápsula con las pinzas. </li></ol> 2. La aspiración central del vítreo. <ol><li> Una aguja de calibre 23 en una jeringa de 5 cc se inserta en la mitad de vítreo (Figura 1). </li><li> Aproximadamente 1 ml o más de núcleo vítreo es aspirada suavemente. </li><li> La muestra se coloca en un tubo de microcentrífuga y luego en nitrógeno líquido. </li></ol> 3. La disección hialoidea anterior. <ol><li> La hialoides anterior se ve como un anillo semi-transparente, mediante el ajuste de la luz incidente de una luz de gallina microscopio cuello. Aspiración previa de la base del vítreo se separa la hialoides anterior de otras estructuras para facilitar su identificación. </li><li> La hoja de tejido elástico se hala cuidadosamente lejos del cuerpo ciliar con Colibri o fórceps vestirse y cortarse con tijeras Vannas. Esta maniobra se repite. </li><li> La muestra se coloca en un tubo de microcentrífuga y luego en nitrógeno líquido. </li></ol> 4. Disección base del vítreo. <ol><li> Utilizando unas pinzas 0,12 para estabilizar el ocular, tijeras Westcott se utilizan para "flor" a los ojos, haciendo cuatro equidistantes para aliviar el estrés cortes del cuerpo ciliar hacia la cabeza del nervio óptico. </li><li> La pars plicata del cuerpo ciliar (Figura 2) se elimina de cada uno de los cuadrantes con tijeras de Westcott. </li><li> La base del vítreo se amarra a ambos lados de la ora serrata con unas pinzas sobre la pars plana y la retina (Figura 2). </li><li> La tracción continua sobre la base del vítreo se aplica con las pinzas. Corte con tijeras de Westcott secuencial extractos de un pañuelo de papel semi-transparente, con un "collar de perlas", aspecto que se extirpa. </li><li> La muestra se coloca en un tubo de microcentrífuga y luego en nitrógeno líquido. </li></ol> 5. Eliminación de la corteza vítrea. <ol><li> La pars plana se extirpa de cada uno de los cuadrantes con tijeras de Westcott mediante la reducción de la hoja de aproximadamente 3 mm por detrás de la ora serrata (Figura 2). </li><li> Entre los prospectos de tejidos, la corteza del vítreo se visualiza como una película semi transparente. </li><li> La película elástica está bien agarrado con pinzas de 0,12 o en poder de la adhesión a una esponja Weck-Cel quirúrgica. La corteza del vítreo se tira a la retina y corta con tijeras Westcott (Figura 1). </li><li> La muestra se coloca en un tubo de microcentrífuga y luego en nitrógeno líquido. Todas las muestras se almacenan a -80 ° C hasta el momento utilizados para la experimentación. </li></ol> 6. Resultados representante Las muestras de tejido puede ser procesado por una variedad de métodos para experimentos específicos. En nuestro caso, las muestras fueron enviadas para análisis de proteínas por SDS-PAGE (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Corte transversal del ojo humano que representa subestructuras diferentes partes del cuerpo vítreo. El humor vítreo más anterior es una fina capa de colágeno llamada la hialoides anterior. El núcleo vítreo comprende toda la región central del cuerpo vítreo. Esta parte del vítreo es más acuosa, en contraste con la base del vítreo, que es viscoso, lo suficiente como para ser captado por los fórceps y se une firmemente con el cuerpo ciliar y la retina subyacente. Que abarca el núcleo vítreo es un shell de colágeno muy fino llamado la corteza del vítreo. <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Anatomía base del vítreo. La base del vítreo es una subestructura semi-transparente del cuerpo vítreo, situado a lo largo de la ora serrata (flechas blancas), que es la línea divisoria que separa el cuerpo ciliar y la retina. El borde anterior de la base del vítreo se extiende sobre la pars plana (línea blanca) del cuerpo ciliar. El borde posterior de la base del vítreo se extiende de 2 a 3 mm por detrás de la ora serrata (tablero blanco). Para extirpar la base del vítreo, fórceps se utilizan para agarrar el tejido y tire de ella fuera del cuerpo ciliar y la retina subyacente. Una vez elevada, tijeras Westcott se utilizan para cortar a lo largo de la base. <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Una dimensión SDS-PAGE de los elementos del cuerpo vítreo. Concentración de proteínas totales de la hialoides anterior, base del vítreo, vitnúcleo vítreo, y la corteza vítrea fueron 11.24, 20.1, 16.61, 14.24 mg / ml, respectivamente. Electroforesis en gel se realizó en 200 kV durante 45 minutos, se tiñeron con Flamingo (Bio-Rad), y se visualizan mediante un sistema de VersaDoc imágenes (Bio-Rad). Los perfiles de los diferentes tejidos muestran varias bandas similares, lo que indica de conservación o la contaminación cruzada de las proteínas, así como bandas únicas (asterisco), lo que indica proteínas diferencialmente localizados.

<ol><li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Prog Retin Eye Res. 19, 323-344 (2000).</li>
<li>Sebag, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pharmacologic+vitreolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Am+Ophthalmol+Soc%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pharmacologic vitreolysis.</a> Trans Am Ophthalmol Soc. 103, 473-494 (2005).</li>
<li>Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+inflammatory+immune+mediators+in+vitreoretinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases.</a> PLoS One. 4, e8158-e8158 (2009).</li>
<li>Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P., Feener, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+vitreous+proteome+in+diabetes+without+diabetic+retinopathy+and+diabetes+with+proliferative+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy.</a> J Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).</li>
<li>Izuta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+SOD+and+VEGF+are+increased+in+vitreous+bodies+from+proliferative+diabetic+retinopathy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients.</a> Mol Vis. 15, 2663-2672 (2009).</li>
<li>Azimzadeh, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+proteome+analysis+using+gel-free+and+gel-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics.</a> J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).</li>
</ol>

El cuerpo vítreo es un gel semi-transparente, cuya composición molecular es poco conocida, especialmente en el ámbito de sus subestructuras: la base del vítreo, el núcleo, la corteza y hialoidea anterior. El núcleo vítreo contiene colágeno II, V, IX y XI, junto con el sulfato de condroitina proteoglicanos, proteoglicanos heparán sulfato, y ácido hialurónico. 1,2 biomarcadores de proteínas en el núcleo vítreo se han asociado con enfermedades como la retinopatía diabética. 3.5 ¿Cómo estas proteínas se expresan diferencialmente en cada una de las subestructuras, y en muchos casos las identidades de proteínas específicas, no se conocen. Estos detalles pueden dar una idea sobre el origen de las proteínas asociadas con enfermedades específicas vítreo-retiniana y ayudar a las terapias blanco en el futuro. Aunque el mensaje óptimo intervalo mortem para la disección de los tejidos no se ha determinado, la degradación de proteínas puede afectar a los experimentos posteriores. Por ejemplo, la inmunohistoquímica se ve afectado en los ojos postmortem de 12 horas y algunas actividades enzimáticas específicas se puede reducir en unas pocas horas (observaciones no publicadas). Todos los tejidos de este estudio fueron recogidos entre 2 y 8 horas de la muerte, sin cambios significativos en la expresión de la proteína o la idoneidad para analsyis proteómica. El método de congelación de nitrógeno líquido de conservación se elige sobre la fijación con el fin de evitar que pequeños cambios en la estructura de las proteínas causada por fijador de reticulación, que se ha demostrado en otros tejidos por LC-MS/MS. Seis estudios proteómicos dependerá de la capacidad de precisión analizar los diferentes compartimentos del vítreo, como se demuestra en este experimento de vídeo. Hemos validado la técnica de disección con una dimensión SDS-PAGE. A medida que nuestros resultados sugieren, que se expresan diferencialmente en las proteínas de las subestructuras de diversas partes del cuerpo vítreo. La identificación de estas proteínas proporcionan una comprensión más detallada de la compartimentalización del vítreo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 0,12 fórceps </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1502 </td></tr><tr><td> 5 cc jeringa </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 309603 </td></tr><tr><td> Recta Pinzas Vestirse con dientes </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1400 </td></tr><tr><td> 23 calibre de la aguja </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 305145 </td></tr><tr><td> Colibri fórceps </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> 2 / 132 </td></tr><tr><td> Castroviejo córnea tijeras en ángulo </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3223 </td></tr><tr><td> Vannas tijeras curvas de la capsulotomía </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3387 </td></tr><tr><td> Weck-Cel quirúrgica lanzas </td><td> Medtronic </td><td> 0008680 </td></tr><tr><td> Westcott Tijeras tenotomía curvas </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3320 </td></tr></tbody></table>

la disección de los elementos humanos cuerpo vítreo para el análisis proteómico

Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis

El humor vítreo es un ópticamente transparente, la matriz extracelular de colágeno que llena el interior del ojo y se superpone a la retina. 1,2 interacciones anormales entre las subestructuras de vítreo y la retina la base de varias enfermedades vítreo-retiniana, incluyendo desgarro retiniano y desprendimiento, pliegue macular, agujero macular, relacionada con la edad degeneración macular, la tracción vitreomacular, vitreorretinopatía proliferativa, retinopatía diabética proliferativa, y vitreoretinopathies heredado. 1,2 La composición molecular de las subestructuras del vítreo no se conoce. Dado que el cuerpo vítreo es transparente con el acceso quirúrgico limitado, ha sido difícil de estudiar sus subestructuras en el nivel molecular. Hemos desarrollado un método para separar y conservación de estos tejidos para análisis proteómico y bioquímicos. La técnica de disección en este video experimental muestra la forma de aislar a base del vítreo, hialoidea anterior, vítreo núcleo y la corteza vítreo de ojos de cadáver. Una dimensión SDS-PAGE análisis de cada componente vítreo mostró que nuestra técnica de disección resultó en cuatro perfiles de proteínas único correspondiente a cada sub-estructura del cuerpo vítreo humano. Identificación de proteínas diferencialmente en compartimientos revelará las moléculas candidatas subyacente de diversas enfermedades vítreo-retiniana.

Este video muestra una técnica eficaz para la diferenciación y la disección de las diferentes estructuras semi-transparente del cuerpo humano en el vítreo posterior ojos mortem.

La disección de los elementos humanos Cuerpo Vítreo para el análisis proteómico

El vítreo es una matriz extracelular colagenosa y ópticamente transparente que rellena el interior del ojo y recubre la retina. 1,2 Las interacciones anormales...

El vítreo es una matriz extracelular ópticamente clara que llena el interior del ojo. Puede dividirse en varias subestructuras, incluyendo el hialoide anterior detrás del cristalino, la base vítreo en la retina anterior, la corteza vítreo que forma una envoltura elástica y el núcleo vítreo en el centro. Para diseccionar el vítreo, primero necesitamos eliminar el segmento anterior.Se utiliza una hoja súper afilada para incisionar la córnea en el limbo. Luego se emplean tijeras corneoesclerales para cortar la córnea justo anterior al limbo. El iris se disecciona con tijeras curvas tirando de él desde su superficie.Una presión suave sobre el globo puede expulsar el núcleo. Para eliminar el núcleo vítreo, utilice una aguja de calibre 23 en una jeringa de cinco cc y aspire el vítreo, que es principalmente líquido. El hialoide anterior se vuelve visible como una estructura delgada y transparente que puede sujetarse con pinzas.Es una estructura elástica justo detrás del cristalino. El círculo interno es el ligamento de Wieger. Se utilizan tijeras de Van para cortar el hialoide mientras que las pinzas aplican tracción.El tejido lat puede transferirse a un tubo afu y la maniobra se repite hasta que todo el tejido haya sido diseccionado. Para acceder a las subestructuras vitrosas restantes, es necesario abrir el ojo utilizando tijeras curvas de Westcott. Cada uno de los colgajos se aparta con pinzas en una placa de Petri.Esta imagen muestra la anatomía de la base del vítreo, un tejido delgado y transparente que se extiende a ambos lados de la ora serrata. La ora serrata es la línea divisoria entre el cuerpo ciliar anteriormente y la retina posteriormente. A diferencia de otras partes del vítreo, la base del vítreo se adhiere firmemente al cuerpo ciliar y a la retina subyacentes, por lo que tirar con pinzas realmente eleva el tejido.Para aislar la base del vítreo, primero se elimina el pars plana utilizando fórceps y tijeras de Wescott. El pars plana es esta pequeña área con crestas. Luego, para aislar la base del vítreo, corte dos a tres milímetros posteriores al limbo con tijeras de Wescott mientras estabiliza el ojo con fórceps, sostenga y aplique tracción sobre la base del vítreo usando fórceps y corte secuencialmente con tijeras de Wescott.Hay una apariencia de collar de perlas cuando se extirpa la base del vítreo, y se puede observar cómo esta matriz extracelular podría compartimentalizar proteínas. Se pueden utilizar diferentes técnicas para diseccionar la cubierta del vítreo. El contacto con una esponja de células WEX elevará la corteza.Se puede encontrar un borde de cortex entre los lóbulos tal como se muestra aquí. Nuevamente, utilice la pinza para crear tracción y localice las tijeras de VanNess para cortar secuencialmente el cortex vítreo. El cortex también puede levantarse desde el disco y aquí se usan tijeras Westcott más grandes para diseccionar el cortex mientras se desprende cuidadosamente de la superficie de la retina.Las muestras pueden entonces colocarse en un micro y almacenarse para un análisis proteómico posterior.

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