Modificado anexina V / yoduro de propidio ensayo Apoptosis una evaluación precisa de la muerte celular

El objetivo general del experimento es superar los problemas actuales con las técnicas convencionales de tinción con anexina cinco y yoduro de propidio para la evaluación de la muerte celular por apoptosis y/o necrosis. Hemos descubierto que los enfoques convencionales de tinción de una amplia gama de líneas celulares y células primarias dan como resultado hasta un 40% de eventos falsos positivos. Estos eventos falsos positivos se deben a la tinción del ARN citoplasmático.

Por el contrario, nuestro protocolo reduce drásticamente el número de incidencias de falsos positivos mediante la introducción de pasos de fijación y degradación del ARN en etapas específicas En el procedimiento de tinción, primero las células se tiñen con una X en cinco y yoduro de peridio para detectar la muerte celular según los procedimientos convencionales. A continuación, las células se fijan con un 1% de formaldehído, lo que aumenta la permeabilidad de la membrana plasmática. Finalmente, las células fijadas se tratan con ARNs A con el fin de degradar el ARN citoplasmático, eliminando los falsos positivos causantes de la tinción de yoduro de propidio.

Al igual que muchos biólogos celulares, hemos utilizado métodos convencionales de citometría de flujo de nexina cinco y yoduro de propidio para detectar la muerte celular apoptótica y necrótica. Desafortunadamente, recientemente hemos descubierto que este método conduce a un número significativo de eventos falsos positivos de hasta el 40% en una variedad de líneas celulares y células primarias. Este método actualizado supera estas advertencias.

Nuestro enfoque aprovecha la fijación celular y la digestión del ARN en pasos específicos a lo largo del procedimiento para eliminar selectivamente el ARN plásmico cyop, la tinción que conduce directamente a estos eventos falsos positivos, recolectando las células que se analizarán para el experimento. En este video, usamos macrófagos crudos. Por ejemplo, centrifugar las muestras a 335 Gs durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, decantar el sobrenadante y volver a suspender las células en dos mililitros de un XPBS.

A continuación, vuelva a lavar las células en las mismas condiciones. Esta vez, resus suspendiendo las células en un mililitro de un X NX y cinco tampones de unión. Después de centrifugar las muestras y decantar de nuevo el sobrenadante, resuspender las células en un volumen final de 100 microlitros del tampón de unión One X NX Xin five.

Agregue un Xin cinco a cada muestra de celda de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Por ejemplo, en este vídeo, se añaden 2,5 microlitros de un Xin five zi a cada tubo de poliestireno de fondo redondo. Incubar los tubos en la oscuridad durante 15 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, añada 100 microlitros de un X NX en cinco tampones de unión a cada tubo de reacción. Ahora debe haber aproximadamente 200 microlitros de solución en cada tubo. A continuación, prepare una dilución de uno a 10 de propidio, yoduro o PI en un tampón de unión X NX.In cinco, agregue cuatro microlitros del PI diluido a cada tubo, produciendo una concentración final de dos microgramos por mililitro de PI en cada muestra.

Vuelva a incubar los tubos en la oscuridad durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de este período de incubación, lavar las células con 500 microlitros de un tampón de unión x y x y cinco y centrifugar las muestras a 335 Gs durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y decantar el snat. Vuelva a suspender las células en otros 500 microlitros de un X NX y cinco tampones de unión con 500 microlitros de formaldehído al 2%.

Para crear una solución de formaldehído al 1%, mezcle los tubos con un suave golpeteo. Fije las muestras en hielo durante 10 minutos después de la fijación. Agregue un mililitro de un XPBS a cada muestra y mezcle suavemente moviendo las celdas en centrífuga a 425 Gs durante ocho minutos a cuatro grados Celsius tres veces durante el lavado.

Prepare una dilución de uno a 100 de ARN A en un XPBS, vuelva a suspender el pellet moviendo los tubos y agregue 16 microlitros de los ARN diluidos, una solución para dar una concentración final de 50 microgramos por mililitro. A continuación, incubar las muestras durante 15 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, lave las células en un mililitro de un XPBS y mezcle suavemente agitando y luego centrifugue los tubos a 425 GS durante ocho minutos a cuatro grados centígrados.

Las muestras ya están listas para ser analizadas. Alternativamente, las muestras se pueden utilizar para los pasos de tinción posteriores si la tinción N-X-M-P-I se realiza en paralelo con otros procedimientos. Las imágenes representativas del citómetro de flujo de flujo muestran el alcance de la tinción de falsos positivos en tres poblaciones celulares únicas.

Una línea celular de uso común: macrófagos crudos y dos líneas celulares primarias que reflejan macrófagos de médula ósea y macrófagos primarios de riñón de pez dorado. El uso de macrófagos primarios de peces dorados destaca la aplicabilidad de esta técnica en una variedad de plataformas celulares. Los eventos verdaderos positivos muestran la colocalización esperada dentro del compartimiento nuclear entre PI y drac.

Five, un tinte altamente permeable a la membrana que tiñe con precisión el compartimento nuclear de las células vivas y muertas, como lo demuestra la tinción amarilla. Aquí, la precisión de la tinción nuclear de PI se evaluó en función de su grado de similitud con D dr cinco BRDU siete A.A D DPI, y DRAC cinco exhibió una similitud superior al 99% en su capacidad para teñir con precisión el núcleo en la línea celular bruta de 2 64 0,7 macrófagos. Por el contrario, la tinción citoplasmática de PI que se produce cuando se utilizan protocolos convencionales condujo a una marcada disminución en el porcentaje de similitud de la tinción nuclear en relación con d dr 5.

En esta figura, se puede ver que la incorporación de 50 microgramos por mililitro de ARN A elimina la tinción no nuclear de PI y aumenta significativamente el grado de similitud en relación con la tinción d dr cinco en células de macrófagos de riñón primarios de murn, macrófagos de médula ósea y peces dorados. Las imágenes representativas de los macrófagos renales primarios en esta figura muestran la pérdida de la tinción de ARN en el compartimento citoplasmático con el tratamiento con RN a. Estos diagramas de dispersión de macrófagos renales primarios de pez dorado muestran una reducción significativa de falsos eventos necróticos apoptóticos en células preparadas con el protocolo PI de nexina modificado.

El nuevo protocolo muestra que el 84,9% de las células son viables. Las puertas se dibujaron en función de muestras de flujos de imágenes paralelas que evalúan las características fluorescentes y morfológicas. En un ejemplo, los primeros progenitores, monocitos y macrófagos maduros, fueron teñidos por el NX modificado en cinco protocolos de PI descritos en este video, o por el método convencional para esta figura, la célula teñida por el protocolo modificado mostró una reducción visual en el número de eventos de PI positivos debido a la eliminación de eventos falsos positivos por el tratamiento con ARN.

Además, este efecto fue más pronunciado en las células macrófagas maduras grandes que en las células progenitoras tempranas más pequeñas. Las conclusiones basadas en protocolos convencionales habrían sugerido erróneamente una correlación positiva en la muerte celular para los subconjuntos de macrófagos más maduros. Después de este procedimiento de tinción, se pueden realizar pasos adicionales, como la tinción intracelular o de superficie, para responder preguntas específicas sobre las subpoblaciones dentro de su célula aislada. La relevancia de esta técnica va más allá de las preguntas basadas en la inmunidad, por ejemplo, también es relevante para los sistemas experimentales que utilizan células sometidas a estrés genotóxico, células tratadas con detención del ciclo celular, fármacos como la timidina o la hidroxiurea, y estudios en células embrionarias donde la progresión del desarrollo se caracteriza por cambios discretos en la síntesis de ARN celular.