Name: Evisceración de vítreo y retina del ratón para análisis proteómico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 2 min 39 s
Description: Aprenda a aislar el vítreo, retina y lente del ojo de ratón mediante disección y centrifugación. Este protocolo permite obtener muestras puras para análisis proteómico en investigación oftalmológica.

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El financiamiento fue proporcionado por la lucha por la vista y de investigación para prevenir la ceguera.

1. La disección del segmento anterior. <ol><li> Tejido escleral por detrás del limbo se toma con una pinza 0,22 y el globo (globo ocular) se estabiliza. </li><li> Una hoja de microcirugía se utiliza para hacer una incisión lineal en la córnea de limbo a limbo. </li><li> Un 0,12 Colibri pinza se utiliza para captar la córnea en la incisión. </li><li> El líquido de la cámara anterior es absorbido con una lanza Weck-Cel quirúrgica. </li></ol> 2. Lente de la evisceración. <ol><li> Un 0,12 Colibri pinza agarrando la córnea se utiliza para estabilizar el mundo. </li><li> El titular de una fina aguja curva (curva o fórceps vestir) se inserta detrás de la lente hacia la parte posterior del globo. El titular de la aguja está parcialmente cerrada, y tiró hacia adelante. La presión se aplica con las pinzas en la superficie externa de la esclerótica, que empuja la lente hacia adelante a través de la incisión en la córnea, dejando intacta la pared del ojo. El humor vítreo se presenta como un gel translúcido y está parcialmente adherida a la lente. </li><li> El tejido del cristalino, humor vítreo se coloca en un tubo de centrifugación filtrado contiene 20 microlitros de cóctel de inhibidores de la proteasa (Roche) disuelto en PBS. </li></ol> 3. Retina evisceración. <ol><li> Seguir para estabilizar el mundo, con 0,12 fórceps Colibri captar la incisión en la córnea. </li><li> El titular de una fina aguja curva (curva o fórceps vestir) se coloca en lo posterior para el mundo como sea posible, cerca del nervio óptico. El titular de la aguja está parcialmente cerrada, y tiró hacia adelante. La presión se aplica con las pinzas en la superficie externa de la esclerótica, que empuja la retina hacia delante a través de la incisión en la córnea. El humor vítreo se presenta como un gel transparente adheridas a la retina. La retina es visualizado como un pañuelo amarillo, vascularizado. Las tiras de tejido pigmentado puede ser desprendido con pinzas. </li><li> El tejido de la retina-vítreo se coloca en el tubo de centrífuga de filtrado que contiene el tejido de lente vítreo. </li></ol> 4. Filtrada centrifugación. <ol><li> El tubo de centrífuga de filtrado se coloca en una centrífuga de mesa. Giran a 14.000 x G durante 12 minutos. </li><li> Aspirar el eluyente de la cámara baja, que es el humor vítreo. La retina permanece en la cámara alta. Estas muestras pueden ser utilizados para los estudios de las proteínas. </li></ol> 5. Resultados representante Muestras de humor vítreo fueron analizadas por SDS-PAGE (Figura 2). Las muestras también fueron utilizados para un ensayo de actividad enzimática (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagrama del ojo del ratón. La sección transversal esquemática del ojo humano y el ratón se muestra la relación de menor volumen vítreo en el ojo del ratón gracias a su lente más grande. <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Unidimensional SDS-PAGE del vítreo y la retina del ratón. Los perfiles de proteínas de vítreo del ratón, el 13,6 mg / mL (carril 1), y la retina, 11,35 mg / mL (carril 2). Electroforesis en gel se realizó en 150 kV durante 45 minutos, se tiñeron con tinción de Flamingo gel fluorescente y se visualizan mediante un sistema de VersaDoc Imaging (BioRad, Hercules, CA). <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Superóxido dismutasa (SOD) de la actividad enzimática en el ratón y el humor vítreo humano. Medición de la actividad total de SOD (SOD actividad colorimétrico aasay kit, # AB65354, Abcam, Inc., Cambridge, MA) se llevó a cabo en el vítreo y la retina recogidos por la evisceración de los ratones DBA y albino. Esto se comparó con la actividad de SOD en el núcleo humano vítreo y la retina humana proveniente de post-mortem ojos de donantes humanos para determinar la actividad relativa. Sin diluir las muestras de núcleo vítreo aspirado manualmente usando una aguja de calibre 23, 11 y en la retina fue recogido por la floración a los ojos y cortar el tejido del complejo EPR ​​/ coroides. Aunque la prueba no distingue entre las isoformas de SOD, la actividad de la SOD vítreo es probable que refleje SOD3, ya que es la isoforma extracelular sólo 12 La actividad de la SOD retina es probable que refleje todas las isoformas de SOD tres:. Intracelular SOD1, SOD2 mitocondrial y extracelular SOD3. 12 Para los ensayos enzimáticos de alta sensibilidad, la inclusión de este ensayo de SOD, la posibilidad de contaminación cruzada de las proteínas es posible y requiere más estudio. Las barras de error representan el SEM.

<ol><li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Prog. Retin. Eye Res. 19, 323-344 (2000).</li>
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<li>Ciechanowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+synthesis+is+not+the+reason+for+decreased+activity+of+extracellular+superoxide+dismutase+in+patients+with+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Impaired synthesis is not the reason for decreased activity of extracellular superoxide dismutase in patients with diabetes.</a> Arch Med Res. 36, 148-153 (2005).</li>
</ol>

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Asociación para la Investigación y Visión en la declaración de Oftalmología para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research.

Los ratones transgénicos son un importante modelo para la investigación de enfermedades de la retina y vítreo-retiniana. 10.6 El cuerpo vítreo del ratón, sin embargo, cuenta con una proporción significativamente menor de los ojos, en comparación con el humor vítreo humanos debido a la gran lente en el ojo del ratón. 5 Esto hace que es difícil aislar y purificar el cuerpo vítreo del ratón. Comprender los cambios asociados a la proteína del vítreo en enfermedades como la retinopatía diabética proliferativa, relacionada con la edad degeneración macular, uveítis, desprendimiento de retina y le dará información sobre los mecanismos por los cuales el progreso. Este protocolo experimental visualizar proporciona un medio para obtener y purificar el cuerpo vítreo del ratón, al tiempo que maximiza el rendimiento de proteína para los análisis enzimáticos y proteómicos.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> 15 °, BD Beaver Microcirugía de la hoja </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 374881 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 fina sutura Castroviejo Pinzas </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1805 </td><td></td></tr><tr><td> 0,12 Colibri fórceps </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> 2 / 132 </td><td></td></tr><tr><td> Microcon centrífuga Ultracel filtro YM-100 o YM-50 </td><td> Millipore </td><td> 42412, 42415 </td><td></td></tr><tr><td> Actividad SOD Kit de ensayo colorimétrico </td><td> Abcam </td><td> Ab65354 </td><td></td></tr><tr><td> Weck-Cel quirúrgica lanzas </td><td> Medtronic </td><td> 0008680 </td><td></td></tr><tr><td> Cóctel de inhibidores de la proteasa </td><td> Roche </td><td> 11 836 170 001 </td><td></td></tr><tr><td> Flamingo gel de tinción fluorescente </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-04910 </td><td></td></tr></tbody></table>

evisceración de vítreo y retina del ratón para análisis proteómico

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

Mientras que la retina del ratón se ha convertido en un importante modelo genético para enfermedades hereditarias de retina, el vítreo del ratón que queda por explorar. El humor vítreo es una matriz extracelular muy acuosa que recubre la retina donde intraocular, así como las proteínas se acumulan durante la enfermedad extraocular. 1.3 interacciones anormales entre vítreo y la retina la base de varias enfermedades, tales como desprendimiento de retina, retinopatía diabética proliferativa, uveítis, y la vitreorretinopatía proliferativa. 1 , 4 El volumen relativo vítreo del ratón es significativamente menor que el vítreo humano (Figura 1), ya que la lente del ratón ocupa casi el 75% de su ojo. 5 Esto ha hecho que los estudios bioquímicos de vítreo ratón desafiante. En este artículo de vídeo, se presenta una técnica para analizar y aislar el vítreo de la retina del ratón, lo que permitirá el uso de modelos de ratones transgénicos para definir más claramente el papel de esta matriz extracelular en el desarrollo de enfermedades vítreo-retiniana.

La técnica de disección ilustra la evisceración del vítreo, la retina y el cristalino del ojo del ratón, la separación por centrifugación, y la caracterización de los ensayos de proteínas.

Evisceración de vítreo y retina del ratón para análisis proteómico

Si bien la retina del ratón ha surgido como un modelo genético importante para las enfermedades retinales hereditarias, el vítreo del ratón aún no se ha explorado. El vítreo es...

El ojo humano está lleno de una matriz extracelular líquida llamada vítreo en el ojo del ratón. Este espacio está mayormente ocupado por el cristalino. Para aislar el vítreo y la retina, primero debemos diseccionar el segmento anterior, estabilizar el ojo con pinzas y usar una cuchilla súper afilada para hacer una incisión única a través de la córnea.Una hoja desafilada puede desgarrar la córnea y requerir varios movimientos. Se utiliza una esponja celular WEX para absorber el líquido en la cámara anterior. Las flechas indican los puntos en los que presionaremos con pinzas para expulsar el cristalino y el vítreo, cerraremos parcialmente las pinzas y tiraremos hacia adelante.El cristalino tiene el aspecto de una esfera transparente y detrás de él se observa el gel vítreo. En este ejemplo, el vítreo permanece adherido a la parte posterior del cristalino; para aislar la retina, se colocan pinzas más atrás, cerca del nervio óptico, se aprieta suavemente y se tira hacia adelante. La retina tiene el aspecto de un material amarillento y gelatinoso.En algunos casos, la retina, el vítreo y el cristalino saldrán como un único tejido. El siguiente paso consiste en aislar y separar estos tres tejidos utilizando un dispositivo de centrifugación con filtro. La pieza del filtro se coloca en la parte superior de un tubo einor y agregamos algo de solución salina tamponada con fosfato.A medida que se aíslan cada uno de los tejidos, se colocan en el pocillo superior que contiene el filtro. Las lentes en la esquina superior izquierda y el vítreo retiniano están en el lugar inferior derecho. Los tubos en una microcentrífuga se hacen girar a 14.000 G durante 12 minutos.El vítreo girará hacia la parte inferior del tubo de lente einor, y la retina permanecerá en la parte superior. Usaremos pinzas para separar la lente de la retina, luego aislaremos la retina del pocillo superior. Todos estos tejidos pueden colocarse en tubos einor y posteriormente procesarse para análisis de proteómica.

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Investigación

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Biología

Este video muestra una técnica eficaz para la diferenciación y la disección de las diferentes estructuras semi-transparente del cuerpo humano en el vítreo posterior ojos mortem.

La disección de los elementos humanos Cuerpo Vítreo para el análisis proteómico

Digestión con tripsina es uno de los métodos más comúnmente utilizados para analizar vasculatura de la retina. Este manuscrito describe el método en detalle, incluyendo alteraciones clave para optimizar la técnica y eliminar el tejido no vascular, mientras que la preservación de la arquitectura general de los vasos.

Tripsina Protocolo Resumen Para analizar la vasculatura de la retina de un modelo de ratón

Hemos desarrollado una preparación rebanada horizontal de la retina de mamíferos adultos con el plano de seccionamiento en paralelo a la superficie de la retina. campos dendríticas de las neuronas de la retina orientadas nonradially no fueron truncados, lo que permite el estudio de las técnicas de procesamiento de señales con patch-clamp y de imagen.

Preparación de cortes horizontales de ratón adulto Retina de Estudios electrofisiológicos

Este protocolo presenta dos técnicas para aislar los compartimentos subcelulares de los fotorreceptores de bastón murino para el análisis de proteínas. El primer método utiliza retina viva y papel de filtro de celulosa para separar los segmentos externos de la varilla, mientras que el segundo emplea retinas liofilizadas y cinta adhesiva para pelar las capas internas y externas de la varilla.

Dos métodos de peeling para el aislamiento de compartimentos de células fotorreceptoras en la retina del ratón para el análisis de proteínas

La retinopatía diabética es una de las principales causas de ceguera. La histología, el ensayo de ruptura de la barrera hematoencefaliana y la angiografía por fluorescencia son técnicas valiosas para comprender la fisiopatología de la retina, lo que podría mejorar aún más la detección eficaz de medicamentos contra la retinopatía diabética.

Evaluación fisiopatológica de la retina en un modelo de rata

Este protocolo describe un método para el aislamiento de células endoteliales retinianas postnatales murinas optimizadas para el rendimiento, la pureza y la viabilidad celular. Estas células son adecuadas para los enfoques de secuenciación de próxima generación.

Aislamiento de células endoteliales retinianas murinas para secuenciación de próxima generación

Se desarrolló un ensayo de protección para monitorizar la resistencia de la vasculatura de la retina a la muerte por lesiones relacionadas con la diabetes/retinopatía diabética, como el estrés oxidativo y las citocinas.

Un ensayo para detectar la protección de la vasculatura de la retina frente a la muerte relacionada con la diabetes en ratones

Este protocolo describe los pasos detallados para la preparación de muestras de retina para microscopía electrónica de volumen, centrándose en las características estructurales de los terminales fotorreceptores de la retina.

Preparación de muestras de retina para microscopía electrónica volumétrica

Los pericitos de la vasculatura de la retina se examinaron mediante tinción inmunofluorescente con receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas β después de la inyección retroorbitaria de lectina fluorescente de tomate. La retina marcada se trató posteriormente con el método de limpieza de tejidos y se montó completa para visualizar las vistas tridimensionales de los pericitos que rodean la vasculatura de la retina bajo un microscopio confocal.

Visualización 3D de pericitos vasculares retinianos en ratones mediante inmunotinción 

La retina exhibe una organización espacial compleja a través de su estructura laminar. La transcriptómica espacial moderna y las técnicas de secuenciación requieren secciones de tejido &lt; 20 μm de grosor, lo que limita su aplicabilidad en la investigación de la retina. Este método de criosección recién congelada produce secciones delgadas en la cara de la retina del ratón al tiempo que preserva las relaciones espaciales planas, lo que permite un mapeo molecular completo a través de las...

En la cara Crioseccionamiento de retina de ratón para análisis molecular espacial de alta dimensión

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