Multi-fotón imágenes de invasión de células tumorales en un modelo de ratón ortotópico de carcinoma oral de células escamosas

El objetivo general de este procedimiento es producir un modelo murino de cáncer oral que permita la visualización y cuantificación de la invasión tumoral en la lengua. Esto se logra primero generando células de carcinoma escamoso oral para imágenes de dos fotones mediante infección lentiviral con life Act M cherry y selección clonal estable. A continuación, se generan tumores alogénicos ortotópicos en ratones desnudos mediante la inyección de células marcadas con life Act M cherry en la lengua de ratones anestesiados.

Luego, las lenguas que contienen tumores se imagenan mediante microscopía de dos fotones. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la invasión local cuantificada del tumor oral dentro del músculo de la lengua mediante la obtención de imágenes de dos fotones de tejido lingual fresco y la subsiguiente reconstrucción tridimensional asistida por computadora de tumores primarios y grupos celulares invadidos regionalmente. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la inmunohistoquímica o la obtención de imágenes bioluminiscentes es que la invasión de células tumorales puede medirse cuantitativamente en tres dimensiones.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la intervención terapéutica del cáncer oral porque proporciona un sistema modelo para el análisis de proteínas implicadas en la invasión tumoral, así como para la evaluación de compuestos preclínicos en estrategias terapéuticas antiinvasivas. En general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades, ya que la inyección de células tumorales en la lengua y la preparación de la lengua para la microscopía de dos fotones es técnicamente exigente y requiere habilidad y práctica. La visualización de este método es fundamental, ya que la inyección tumoral en los pasos de dos fotones es difícil de aprender y requiere habilidades especializadas para comenzar el cultivo.

Líneas celulares de tumores humanos de cabeza y cuello en medio completo compuesto por DMEM suplementado con 10% FBS, 1% penicilina-estreptomicina y 1% de aminoácidos no esenciales. Con el fin de transferir la secuencia de recubrimiento LIFE Act M cherry al vector lentiviral PLL 7.0, primero se requiere mutagénesis dirigida a sitios para introducir tres mutaciones silenciosas en el sitio de reconocimiento SBF uno en el ADNc parental de mCherry. A continuación, amplificar por PCR la secuencia modificada de Life Act mCherry con sitios ECO R uno SBF uno en los extremos y subclonarla en el PLL 7.0. Para generar un constructo PLL 7.0 LIFE Act M cherry siguiendo un sistema de expresión lentiviral, cultivar la línea celular empacadora 2 9 3 T 17 hasta alcanzar una confluencia del 40% en medio completo.

Utilizando Cal Foss, transfecte las células con los vectores PLL 7.0 LIFE Act M cherry PS PACS dos y P-V-S-V-G en una proporción de tres a dos a uno, respectivamente. Después de 24 horas, reemplace el medio con medio completo fresco, recolecte y renueve el medio cada 12 horas durante 72 horas, y almacene el medio recolectado a cuatro grados Celsius para generar líneas celulares de cabeza y cuello con expresión estable de LIFE Act M cherry. Centrifugue el medio recolectado a 2000 RPM durante 10 minutos a cuatro grados Celsius, añada un mililitro del medio clarificado que contiene el virus a las células OSC 19 o US CCC uno durante 12 horas.

Lave las células, luego agregue un mililitro adicional de virus durante otro período de 12 horas. Incube las células en medio que contenga 200 miligramos por mililitro de puromicina durante dos semanas para seleccionar colonias resistentes. Examine visualmente las colonias sobrevivientes en busca de viabilidad. Detecte la expresión de Act m cherry mediante microscopía de fluorescencia y retire con tripsina colonias individuales positivas utilizando discos de clonación estériles de tres milímetros.

Mantenga las células positivas en medio que contenga 200 miligramos por mililitro de purotricina hasta su congelación o su uso para inyección ortotópica con el fin de generar un xenoinjerto de tumor ortotópico trypsin life Act. M cherry. Luego centrifugue el cultivo y re suspenda aproximadamente 2,5 × 10⁴ células en 50 microlitros de medio completo. Introduzca las células tumorales en una jeringa de un mililitro acoplada a una aguja de 27 gauge y media pulgada.

A continuación, anestesie un ratón hembra atímico foxn1 nu de ocho semanas de edad con una combinación de 80 miligramos por kilogramo de ketamina y 10 miligramos por kilogramo de xilacina. Una vez que el animal deje de moverse, aplique una pomada lubricante para los ojos y verifique la respuesta presionando la uña sobre la planta del pie.

Mantenga a los ratones sobre una placa calefactora entre 37 y 40 grados Celsius. Utilizando fórceps estériles, agarre suavemente la punta de la lengua y extráigala de la cavidad oral. Inyecte lentamente las células en un lado de cada lengua para crear una masa bulbosa en el centro de la lengua.

Inyecte a los ratones 2,1 miligramos por kilogramo de yohi being y devuélvalos a la almohadilla calefactora para monitorearlos durante la recuperación de la anestesia. Coloque a los ratones en jaulas estériles que contengan una dieta suave de masa transgénica. Pese a los ratones cada dos o tres días y obsérvelos visualmente para detectar el inicio de tumores.

Para preparar lenguas de ratón para imágenes ex vivo, sacrifique ratones que presenten tumores en diferentes puntos temporales. Mediante inhalación de dióxido de carbono, extraiga las lenguas y enjuáguelas con un XPBS. Luego, utilice hilo de sutura monofilamento de una tienda local de pasatiempos y una aguja de coser tamaño ocho.

Sujete la lengua a un lado de un casete convencional para inclusión de tejidos en parafina. Una vez que la lengua esté inmovilizada, sumerja todo el conjunto del casete en un XPBS. Procese inmediatamente las lenguas utilizando microscopía de dos fotones para obtener imágenes de las lenguas mediante microscopía de dos fotones.

Sumerja las cassettes linguales en una placa de 60 milímetros que contenga un XPBS. Fije la placa en un soporte de diseño personalizado sobre un brazo en voladizo retráctil colocado debajo del objetivo del microscopio de dos fotones. Coloque una lente de objetivo de inmersión en agua de 40 x 0,8 de apertura numérica directamente sobre o encima de una lesión tumoral visible.

Imaginación de la lengua mediante microscopía de dos fotones con el láser de titanio-safiro con una intensidad de 60 milivatios y una longitud de onda de entrada de 755 nanómetros. Para optimizar la señal de M cherry, recolecte imágenes seriadas de escaneo láser de un micrómetro a profundidades incrementales de un micrómetro sobre una profundidad tisular total entre 15 y 100 micrómetros. Con esta configuración, se pueden analizar tumores hasta un milímetro de profundidad tisular.

Utilice Scan Image para capturar imágenes. Scan Image genera una salida de dos canales con patrones de escaneo raster para controlar los espejos galvanométricos de escaneo XY y, al mismo tiempo, captura simultáneamente una señal de entrada de hasta cuatro canales procedente de tubos fotomultiplicadores a través de una tarjeta de adquisición de datos. Scan Image recopila imágenes en pilas Z mediante el control del eje Z del objetivo y recopila imágenes de lapso de tiempo en modo individual o cíclico.

Guarde las imágenes en un único archivo TIF con una profundidad de 16 bits. Mediante el software Amira, renderice pilas de imágenes de tumor en una única imagen tridimensional abriendo el archivo TIF que contiene el conjunto de imágenes en pilas Z. Utilice la función TEX para generar una representación tridimensional.

Es probable que en la imagen renderizada aparezca una gran imagen de tumor primario con varios grupos invasivos disociados más pequeños o igs. Para medir el volumen del tumor, defina el umbral del área del tumor primario y de cada corte de la pila de imágenes, corrigiendo y eliminando la fluorescencia de fondo. Repita el procedimiento de umbralización para cada grupo invasivo.

Una vez seleccionado el tumor primario y todos los GIS, determine la medición del volumen, así como las coordenadas OID en X, Y y Z del tumor primario. Con el fin de calcular las distancias de los GIS desde el punto central del tumor, calcule el índice invasivo del tumor o TI utilizando la fórmula TI igual a N GIS por V GIS por dT. Donde N GIS equivale al número total de GIS en la imagen, V GIS equivale al volumen total de todos los GIS y dT equivale a la distancia total recorrida por todos los grupos invasivos desde el centro del tumor primario.

Se pueden generar representaciones tridimensionales con mayor detalle topográfico importando los archivos originales de la punta en escala de grises de 16 bits en Nikon NIS Elements dentro del software. Cree un archivo ND a partir de una pila de imágenes. Luego, calibre manualmente el documento para especificar el tamaño del píxel y obtener representaciones de mayor calidad.

Agregue cortes adicionales en el plano Z. Esta figura muestra un ejemplo de los datos brutos adquiridos a partir de una imagen de dos fotones en NIS elements o un espejo. Puede utilizarse software para reconstruir los datos brutos de tumores de la lengua, lo cual se muestra en esta figura.

Este panel muestra un ejemplo de la representación tridimensional utilizando la función TEX en el software Amira. Aquí se presenta un ejemplo de umbralización de una sección individual de dos fotones proveniente de la pila de imágenes, para identificar grupos invasivos procedentes del tumor primario, así como el centro u óide del tumor primario. Después de analizar cada sección umbralizada, Amira cuantifica el volumen y la distancia recorrida por cada grupo invasivo desde el Centro.

Estos datos pueden demostrarse gráficamente y utilizarse para obtener el valor numérico del grado completo de invasión de las células tumorales. Atribuible al sitio primario, las imágenes representativas de tumores que se muestran aquí fueron visualizadas mediante inmunohistoquímica patológica convencional, en comparación con una imagen tridimensional de un tumor similar obtenida mediante el protocolo descrito. Una vez dominada la técnica, desde la extracción de la lengua hasta la representación final en 3D, este procedimiento puede realizarse en aproximadamente dos horas si se lleva a cabo correctamente. Al realizar este procedimiento, tenga cuidado de no atravesar la lengua con la aguja, lo que podría provocar la pérdida de células tumorales y dificultar el establecimiento del tumor. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar pruebas con compuestos terapéuticos o células con niveles de proteína modificados para determinar su eficacia sobre la invasión del cáncer oral.

En un entorno in vivo, no olvide que trabajar con células tumorales humanas modificadas con lentivirus es peligroso; se deben tomar precauciones como el uso adecuado de EPP y trabajar en una cabina de flujo laminar certificada BSL-2 al manipular ratones inyectados.