Multi-fotón imágenes de invasión de células tumorales en un modelo de ratón ortotópico de carcinoma oral de células escamosas

El objetivo general de este procedimiento es producir un modelo de ratón de cáncer oral que permita la visualización y cuantificación de la invasión tumoral en la lengua. Esto se logra generando primero células de carcinoma escamoso oral para la obtención de imágenes de dos fotones mediante infección lentiviral de la cereza Act M y selección clonal estable. Los tumores ortotópicos de xenoinjerto se producen en ratones desnudos mediante la inyección de células marcadas con cerezas Act M en las lenguas de ratones anestesiados.

Luego, se obtienen imágenes de las lenguas que contienen tumores mediante dos microscopías de fotones. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la invasión cuantificada de tumores orales locales dentro del músculo de la lengua a través de imágenes de dos fotones de tejido lingual fresco y la posterior reconstrucción tridimensional asistida por computadora de tumores primarios y grupos celulares invadidos regionalmente. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la inmunohistoquímica o la imagen bioluminiscente, es que la invasión de células tumorales se puede medir cuantitativamente en tres dimensiones.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la intervención terapéutica del cáncer oral, ya que proporciona un sistema modelo para el análisis de las proteínas implicadas en la invasión tumoral, así como la evaluación de compuestos preclínicos sobre estrategias terapéuticas antiinvasivas. Por lo general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades, ya que la inyección de las células tumorales en la lengua y la preparación de la lengua para dos fotomicroscopías es técnicamente exigente, lo que requiere habilidad y práctica. La visualización de este método es fundamental, ya que la inyección del tumor en dos pasos de fotones es difícil de aprender y requiere habilidades especializadas para comenzar el cultivo.

Líneas celulares tumorales de cabeza y cuello humanas en medio completo que consisten en DMEM suplementado con 10% de FBS, 1% de penicilina estreptomicina y 1% de aminoácidos no esenciales. Con el fin de transferir la secuencia de recubrimiento de cereza LIFE Act M al sitio del vector lentiviral PLL 7.0, primero se requiere la mutagénesis dirigida para introducir tres mutaciones silenciosas en el SBF: un sitio de reconocimiento en el mCherry CD NA principal. A continuación, la PCR amplifica la secuencia mCherry de la Ley de Vida Modificada con ECO R flanqueante, un SBF, un sitio y sub clent en el PLL 7.0. Para generar una construcción de cereza PLL 7.0 LIFE Act M siguiendo un cultivo en un sistema de expresión lentiviral, la línea celular de empaque 2 9 3 T 17 a 40% de confluencia en medio completo.

Con Cal Foss, transfecte las células con los vectores PLL, 7.0, LIFE, Act, M, cherry, PS, PACS, dos y P-V-S-V-G en una proporción de tres a dos a uno, respectivamente. Después de 24 horas, reemplace el medio con un medio fresco y completo, recoja y reponga el medio cada 12 horas durante 72 horas, y almacene el medio recolectado a cuatro grados centígrados para producir líneas celulares de cabeza y cuello con expresión de cereza Act M de vida estable. Girar el medio recolectado a 2000 RPM durante 10 minutos a cuatro grados Celsius, agregar un mililitro del medio clarificado que contiene el virus a las celdas OSC 19 o US CCC One durante 12 horas.

Enjuague las células, luego agregue un mililitro adicional de virus durante otro período de 12 horas. Cultivar las células en un medio que contenga 200 miligramos por mililitro de purmicina durante dos semanas Para seleccionar colonias resistentes, se examinaron visualmente las colonias supervivientes de por vida. Acto m expresión de cereza por microscopía de fluorescencia ojos de tripsina, colonias positivas individuales utilizando discos de clonación estériles de tres milímetros.

Mantener las células positivas en un medio que contenga 200 miligramos por mililitro de purmicina hasta que se congelen de nuevo, o se utilicen para la inyección ortotópica de xenoinjerto tumoral tripsina de la vida Act. M cereza que expresa células tumorales luego centrifugar el cultivo y resuspender aproximadamente 2,5 veces 10 a la cuarta células en 50 microlitros de medio completo. Cargue las células tumorales en una jeringa de un mililitro conectada a una aguja de media pulgada de calibre 27.

A continuación, anestesiar, zorro atímico hembra de ocho semanas de edad. Un ratón desnudo con una combinación de 80 miligramos por kilogramo de ketamina y 10 miligramos por kilogramo de xilacina. Una vez que el animal deje de moverse, aplique un ungüento lubricante para los ojos y verifique la capacidad de respuesta presionando una uña en la almohadilla para los pies.

Mantenga los ratones sobre una almohadilla térmica entre 37 y 40 grados centígrados. Con pinzas estériles, agarre suavemente la punta de la lengua y sáquela de la cavidad oral. Inyecte lentamente las células en un lado de cada lengua para crear una masa bulbosa en el centro de la lengua.

Inyecte a los ratones 2,1 miligramos por kilogramo de yohi ser y devuélvalos a la almohadilla térmica para monitorearlos durante la recuperación de la anestesia. Coloque a los ratones en jaulas estériles que contengan una dieta blanda de masa transgénica. Pesa a los ratones cada dos o tres días y monitorízalos visualmente para detectar la aparición del tumor.

Para preparar las lenguas de los ratones para la obtención de imágenes ex vivo, se practica la eutanasia a los ratones que albergan tumores en diferentes momentos. Usando la inhalación de dióxido de carbono, extraiga las lenguas y enjuáguelas con un XPBS. Luego, use hilo de coser monofilamento de una tienda de pasatiempos local y una aguja de coser de tamaño ocho.

Fije la lengüeta a un lado de un casete convencional de inclusión de tejido de parafina. Una vez inmovilizada la lengüeta, sumerja todo el conjunto del casete en un XPBS. Procese inmediatamente las lenguas usando dos microscopía de fotones para obtener imágenes de las lenguas usando dos microscopía de fotones.

Sumerge los casetes de lengua en un plato de 60 milímetros que contenga un XPBS. Asegure el plato en un soporte de diseño personalizado en un brazo en voladizo retráctil colocado debajo del objetivo del microscopio de dos fotones. Coloque una lente de objetivo de inmersión en agua de apertura numérica de 40 x 0,8 directamente sobre o sobre una lesión tumoral visible.

Imagen de la lengua mediante microscopía de dos fotones con el láser de zafiro de titanio con una intensidad de 60 milivatios y una longitud de onda de entrada de 755 nanómetros. Para optimizar la señal de cereza M, recopile imágenes de escaneo láser en serie de un micrómetro a profundidades incrementales de un micrómetro sobre una profundidad total de tejido entre 15 y 100 micrómetros. Con esta configuración, se pueden analizar tumores de hasta un milímetro de profundidad en el tejido.

Utilice el escaneo de imagen para capturar imágenes. La imagen de escaneo genera una salida de dos canales de patrones de escaneo de trama para controlar los espejos de escaneo métrico de galvan XY y, al mismo tiempo, captura una entrada de señal de cuatro canales como máximo simultáneamente desde tubos multiplicadores de fotos a través de una placa de adquisición de datos. Escanear imagen recopila imágenes de la pila Z controlando el eje Z del objetivo y recopila imágenes de lapso de tiempo en modo único o cíclico.

Guarde las imágenes en un solo archivo TIF con una profundidad de 16 bits. Con el software Amira, renderice pilas de imágenes tumorales en una sola imagen tridimensional abriendo el archivo TIF que contiene el conjunto de imágenes de pila Zs. Utilice la función TEX para generar una representación tridimensional.

Es probable que en la imagen renderizada haya una imagen de tumor primario grande con varios grupos invasivos disociados más pequeños. Para medir el volumen tumoral, defina el umbral del área tumoral primaria y cada corte de la pila de imágenes corrija y elimine la fluorescencia de fondo. Repita el procedimiento de umbral para cada grupo invasivo.

Una vez que se seleccionan el tumor primario y todos los ig, determine la medición del volumen, así como las coordenadas OID del tumor X, Y y Z para el tumor primario. Para calcular las distancias de igs desde el punto central del tumor, se calcula el índice invasivo del tumor o ti utilizando el ti igual a N NT por VT por dt. Donde NT es igual al número total de igs en la imagen, VT es igual al volumen total de todas las igs y DT es igual a la distancia total recorrida por todos los grupos invasivos desde el centro del tumor primario.

Se pueden generar representaciones tridimensionales con mayor detalle topográfico importando los archivos de punta monocromática originales de 16 bits a los elementos NIS de Nikon dentro del software. Cree un archivo ND a partir de una pila de imágenes. A continuación, calibre manualmente el documento para especificar el tamaño de píxel para obtener representaciones de mayor calidad.

Agregue sectores adicionales en el plano Z. Esta figura muestra un ejemplo de los datos brutos adquiridos a partir de una imagen de dos fotones, elementos NIS o un espejo. Se puede utilizar software para reconstruir los datos brutos de los tumores de lengua, que se muestran en esta figura.

Este panel muestra un ejemplo de la representación tridimensional utilizando la función TEX en el software Amira. A continuación, se muestra un ejemplo de umbralización de una sección individual de dos fotones de la pila de imágenes para identificar grupos invasivos del tumor primario, así como del centro o oide del tumor primario. Después de analizar cada sección umbral, Amira cuantifica el volumen y la distancia recorrida por cada grupo invasor desde el Centro.

Estos datos se pueden demostrar gráficamente y utilizar para obtener el valor numérico del nivel completo de invasión de células tumorales. Un atributo del sitio primario que se muestra aquí son imágenes representativas de tumores visualizados por el marcaje inmunohistoquímico patológico convencional en comparación con una imagen tridimensional de un tumor similar utilizando el protocolo descrito Una vez dominada desde el punto de extracción de la lengua hasta la representación final en 3D, esta técnica se puede realizar en aproximadamente dos horas si se realiza correctamente mientras se intenta este procedimiento. tenga cuidado de no perforar la lengua con la aguja, perdiendo así las células tumorales e impidiendo la toma del tumor. Se pueden realizar pruebas de compuestos terapéuticos o células con niveles de proteínas manipulados para determinar su eficacia en la invasión del cáncer oral.

En un entorno in vivo, no olvide que trabajar con células tumorales humanas modificadas con lentivirus es peligroso, siempre se deben tomar precauciones como el EPP adecuado y trabajar en una campana de flujo laminar con certificación BSL de dos mientras se trabaja con ratones inyectados.