Name: El uso de las células estaminales perivasculares para la regeneración ósea (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Aprende a utilizar células estaminales perivasculares aisladas de tejido adiposo mediante FACS para regeneración ósea en modelos ectópicos y ortotópicos. Este método demuestra formación ósea significativa en ocho semanas.

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Este trabajo fue apoyado por el CIRM Temprana Premio de Investigación Traslacional II TR2-01821, NIH / NIDCR (subvenciones R21 DE0177711 y DE01607 SR1), UC Discovery Grant 07-10677, AWJ y RKS tienen T32 becas becas de capacitación (5T32DE007296-14), JNZ tiene una beca de formación CIRM (TG2-01169).

1. Stem Cell perivascular aislamiento Esto se describe en detalles en el artículo adyacente "La purificación de las células madre de tejido humano perivasculares adiposo blanco", por M. Corselli et al. 2. Andamio Creación <ol><li> Los andamios están hechos a medida de acuerdo al protocolo previamente publicado a partir de poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA, Burmingham polímero) con recubrimiento de hidroxiapatita 4-6. Apatito recubiertos andamios PLGA se fabrican a partir de 85/15 PLGA por moldeo con disolvente y un proceso de lixiviación de partículas. Los andamios se crean en una forma esférica (2-mm de diámetro) para la implantación músculo bolsa, una forma discoidal (4 mm de diámetro) para la implantación calota, o cilíndricas (4 mm de diámetro, 6 mm de longitud) para femorales defectos segmentarios. </li><li> En pocas palabras, PLGA / cloroformo soluciones mezclada con sacarosa (polímero / proporción de sacarosa 5/95, w / w), se han puesto en un diámetro de 200 a 300 micras-molde de teflón para crear los contras a la medidatruct. Tras la liofilización, durante la noche, los andamios se retira del molde de teflón y se sumergió en ddH 2 O para disolver la sacarosa. Los andamios son desinfectadas por inmersión en etanol al 70% durante 30 minutos, seguido de tres lavados de ddH 2 O. </li><li> Para el revestimiento de la apatita, un cuerpo simulado una solución líquida (SBF) se prepara disolviendo de forma secuencial CaCl2, MgCl2 • 6H 2 O, NaHCO 3 y K 2 HPO 4 • 3H 2 O en ddH 2 O. PH de la solución se reduce a 6 por adición de ácido clorhídrico 1M para aumentar la solubilidad. Na 2 SO 4, KCl, NaCl y se añaden y el pH final se ajustó a 6,5 (SBF 1). </li><li> Mg2 + y HCO 3 - libre SBF (SBF 2) se prepara mediante la adición de CaCl 2 y K 2 HPO 4 • 3H 2 O en ddH 2 O y el pH se reduce a 6. KCl y NaCl se añaden y el pH final se ajustó a 6,8. Todas las soluciones son estériles filtró a través de un membr micras 0,22 PSAAne (Nalgene). Inmediatamente antes del proceso de recubrimiento, las secas andamios PLGA se someten a descarga luminiscente de plasma de argón grabado (Harrick Scientific) para mejorar la humectación y la uniformidad de recubrimiento. </li><li> Andamios Etched se incuban en SBF 1 durante 12 horas y cambió a Mg2 + y HCO 3 - libre SBF 2 para otra h 12 a 37 ° C bajo agitación suave. Andamios recubiertas se lavan con ddH 2 O para eliminar el exceso de iones y se liofilizó antes de estudios adicionales. </li></ol> 3. La bolsa muscular modelo de implantación <ol><li> 100 l de una suspensión PSC en PBS (tampón fosfato salino) son suavemente dejó caer en el esférico PLGA basada implante inmediatamente antes de la implantación. Las células han sido pre-etiquetados por inserción lentiviral de luciferasa de luciérnaga, que permitan la implantación posterior en vivo de seguimiento. La densidad celular es de 2,5 x 10 5 por implante. </li><li> SCID (inmunodeficiencia combinada severa) los ratones se utilizan a las 6 semanas de edad. Los animales son anestesiathetized por inhalación isoflurano y premedicados con buprenorfina (Laboratorios Bedford). Después de la preparación de Betadine estándar, incisiones bilaterales en las patas traseras están hechas (longitudinal y 2 mm de longitud). </li><li> Los bolsillos están cortados en los músculos bíceps femoral mediante disección roma en paralelo al eje de la fibra muscular de largo. Para cada ratón, el implante de PLGA-basado con PSC se inserta, y la fascia que recubre el músculo se sutura con Vicryl 5-0 (Ethicon). </li><li> La piel está próxima cerrado con 5-0 Vicryl en un patrón subcuticular. Los animales son tratados con buprenorfina después de la operación durante 48 horas y TMP / SMX (TMP / SMX; Qualitest) durante 10 días. </li></ol> 4. El defecto del calvario de implantación del modelo <ol><li> Después de la anestesia con isoflurano de ratones SCID (12-14 semanas de edad), el pelo se recorta y la piel desinfectada con betadine por protocolo. </li><li> Una incisión en la piel 8-mm está hecho a lo largo de la sutura sagital medio de la bóveda craneal del ratón. A continuación, el CALVarial periostio se quita suavemente por Q-tip aplicación. </li><li> A continuación, utilizando adiamantadas bits de trepanación en un taladro dental de alta velocidad, un defecto parietal 4-mm hueso se crea. El defecto es de espesor total - sin embargo se tiene cuidado de no lesionar la duramadre subyacente. </li><li> El producto a medida PLGA basada implante con PSC injertadas se coloca entonces suavemente en el sitio del defecto. La densidad celular es de 2,5 x 10 5 por implante. Por último, la piel se suturó con Vicryl 6-0. Los animales son tratados con buprenorfina después de la operación durante 48 horas y TMP / SMX durante 10 días. </li></ol> 5. El femoral defecto segmentario implantación de modelos <ol><li> Ratas atímicos (12-14 semanas de edad) son anestesiados bajo inhalación de isoflurano. El fémur se limpia y preparada según el protocolo estándar con betadine (Figura 1). </li><li> Se hace una incisión longitudinal de 27 a 30 mm se realiza sobre la cara anterolateral del fémur. El eje femoral está expuesto a continuación, mediante la separación de la latitud vastoeralis y los músculos bíceps femoral (Figura 2). </li><li> Para maximizar la consistencia de la regeneración ósea, el periostio que recubre el defecto femoral se elimina por completo con el segmento resecado femoral. </li><li> Una placa de polietileno (longitud, 23 mm; ancho, 4 mm, altura, 4 mm) se coloca sobre la superficie anterolateral del fémur. La placa contiene seis agujeros previamente perforados para dar cabida a los cables de 0,9 mm de diámetro de rosca de Kirschner (Zimmer). Tomando la placa como una plantilla, seis alambres de Kirschner roscados se perforan a través de la placa y ambas corticales (Figura 3). </li><li> A continuación, con una pequeña hoja de sierra oscilante (Stryker, MI), un niño de 6 mm a mediados de la diáfisis defecto se crea. Defectos segmentarios se tratan a continuación por la inserción de los implantes de PLGA basados ​​en que han sido cargados con células según el protocolo (Figura 4). </li><li> El músculo y la fascia suprayacente se cierra con suturas absorbibles Vicryl 4-0 para asegurar el implante en su lugar, y la piel se sutura. </li> 6. En estudios in vivo <ol><li> Evaluaciones radiográficas se realizan en forma longitudinal por tanto alta resolución XR y de alta resolución μCT (micro tomografía computarizada) análisis. Para el análisis de μCT (Skyscan 1172F), las imágenes son escaneadas a una resolución de 19.73 m (100 kV y 100 mA fuente de radiación, utilizando un filtro de 0,5 mm de aluminio). Las imágenes se analizaron mediante DataViewer, Recon, CTAN, y programas de CTVol. </li><li> Imágenes de bioluminiscencia también se hace en forma secuencial para evaluar el injerto de células, la viabilidad, proliferación y no incluyen la migración fuera de la zona del implante. Imágenes de bioluminiscencia se realiza mediante un dispositivo de IVIS Lumina II (Caliper Life Sciences). Salidas de luz se cuantificó usando el software Image Vida (Xenogen). Salida de luz total se registra en forma de fotones por segundo / sq cm / estereorradián. </li><li> El análisis histológico e histomorfométrico se realiza post-mortem. Tinciones de rutina empleadas incluyen tricrómico de Masson, azul de anilina, pentachrome y rojo Picrosirius. El análisis histomorfométrico se lleva a cabo fácilmente, ya sea con azul de anilina o manchas pentachrome, en el que osteoide aparece de color azul oscuro y amarillo, respectivamente. Píxeles por campo de alta potencia se calculan utilizando la herramienta Varita mágica en Adobe Photoshop. </li></ol> 7. Los resultados representativos Dado que tanto los defectos craneales y femorales son críticos de tamaño, no hay curación significativa se debe esperar sin tratamiento con factores de crecimiento exógenos o células madre. En cuanto a las maniobras quirúrgicas, la disección bolsa muscular debe ser a lo largo de planos fasciales y por lo tanto sangrado mínimo debe ser encontrado. A pesar de que el modelo de bolsa muscular se lleva a cabo bilateralmente, el ratón debe caminar con facilidad el primer día postoperatorio 1. Por el defecto craneal, hemorragia se encuentra, pero puede ser empapado con un Q-tip. El cuidado extremo debe tener cuidado de no lesionar la duramadre subyacente - ya que esto va a interferircon la curación normal. Para el modelo de FSD, se tenga cuidado de no lesionar los vasos sanguíneos grandes a fin de no causar sangrado excesivo o el nervio femoral para evitar el daño neurológico. Alambres de Kirschner se perforan con una presión suave para no dañar el hueso cortical en el proceso. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1."> Figura 1. La preparación preoperatoria de defecto segmentario femoral (FSD) en ratas atímicos. Las ratas macho (12-14 semanas de edad) son anestesiados bajo inhalación de isoflurano. El fémur se limpia y se prepara según el protocolo estándar con betadine. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2."> Figura 2. La exposición quirúrgica de defectos segmentales femoral (FSD) la creación. Se hace una incisión longitudinal de 27 a 30 mm se realiza sobre la cara anterolateral del fémur. La cara lateral de la caña femoral se expone entonces separando el vasto lateraly los músculos bíceps femoral. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3."> Figura 3. La fijación femoral de defecto segmentario (FSD) la creación. Una placa de polietileno (longitud, 23 mm; ancho, 4 mm, altura, 4 mm) se coloca sobre la superficie anterolateral del fémur. La placa contiene seis agujeros previamente perforados para dar cabida a los cables de 0,9 mm de diámetro de rosca de Kirschner. Tomando la placa como una plantilla, seis alambres de Kirschner roscados se perforan a través de la placa y cortezas ambos. A continuación, una de 6 mm a mediados de la diáfisis defecto se crea. Una vez que esto se realiza, un andamio a medida que se insertan directamente que encaja exactamente el sitio del defecto (no mostrado). <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4."> Figura 4. Ejemplo de defecto postoperatorio del calvario. A 4 mm, un defecto del calvario circular se creó en el hueso parietal derecho en ratones atímicos. Toma de imágenes de aquí es un sitio del defecto implantado conPSC a las 8 semanas postoperatorias. Tenga en cuenta la presencia de hueso nuevo en el sitio del defecto. </ol>

<ol><li>Crisan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3, 01-13 (2008).</li>
<li>Chen, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+multi-lineage+progenitor+cells+in+human+organs%3A+regenerative+units%2C+cytokine+sources+or+both%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Perivascular multi-lineage progenitor cells in human organs: regenerative units, cytokine sources or both.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 20, 429-434 (2009).</li>
<li>Corselli, M., Chen, C. W., Crisan, M., Lazzari, L., Peault, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+ancestors+of+adult+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Perivascular ancestors of adult multipotent stem cells.</a> Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 30, 1104-1104 (2010).</li>
<li>Zara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nell-1+enhances+bone+regeneration+in+a+rat+critical+sized+femoral+segmental+defect+model%5BTitle%5D)+AND+%22Plast.+Reconstr.+Surg%22%5BJournal%5D)">Nell-1 enhances bone regeneration in a rat critical sized femoral segmental defect model.</a> Plast. Reconstr. Surg. , Forthcoming (2010).</li>
<li>James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleterious+Effects+of+Freezing+on+Osteogenic+Differentiation+of+Human+Adipose-Derived+Stromal+Cells+In+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Deleterious Effects of Freezing on Osteogenic Differentiation of Human Adipose-Derived Stromal Cells In Vitro and In Vivo.</a> Stem Cells Dev. 20, 427-439 (2011).</li>
<li>Lee, M., Chen, T. T., Iruela-Arispeb, M. L., Wu, B. M., Dunn, J. C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+protein+delivery+from+modular+polymer+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modulation of protein delivery from modular polymer scaffolds.</a> Biomaterials. 28, 1862-1870 (2007).</li>
<li>Aghaloo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+role+of+nell-1+gene+modified+goat+bone+marrow+stromal+cells+in+promoting+new+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">A study of the role of nell-1 gene modified goat bone marrow stromal cells in promoting new bone formation.</a> Mol. Ther. 15, 1872-1880 (2007).</li>
<li>Levi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Adipose-Derived+Stromal+Cells+Stimulate+Autogenous+Skeletal+Repair+via+Paracrine+Hedgehog+Signaling+with+Calvarial+Osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Human Adipose-Derived Stromal Cells Stimulate Autogenous Skeletal Repair via Paracrine Hedgehog Signaling with Calvarial Osteoblasts.</a> Stem Cells Dev. 20, 243-257 (2011).</li>
<li>Leucht, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origin+and+Hox+status+determine+progenitor+cell+fate+during+adult+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic origin and Hox status determine progenitor cell fate during adult bone regeneration.</a> Development. 135, 2845-2854 (2008).</li>
<li>Rajashekhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFATS+collection%3A+Adipose+stromal+cell+differentiation+is+reduced+by+endothelial+cell+contact+and+paracrine+communication%3A+role+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">IFATS collection: Adipose stromal cell differentiation is reduced by endothelial cell contact and paracrine communication: role of canonical Wnt signaling.</a> Stem Cells. 26, 2674-2681 (2008).</li>
<li>Zuk, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose+tissue+is+a+source+of+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.</a> Mol Biol Cell. 13, 4279-4295 (2002).</li>
</ol>

KT, BP, y CS son los inventores de perivasculares de células madre relacionadas con las patentes registradas en la UCLA. Dres. KT, y CS son fundadores de cicatrices Laboratories Inc., que sublicencias perivasculares de células madre relacionadas con las patentes de los regentes de la UC. El Dr. Chia Soo ocupa también un cargo de los Laboratorios de cicatrices, Inc.

El aislamiento del PSC está bien descrito en otra parte 03.01, incluyendo una publicación por separado Jove presentó específicamente a los protocolos de aislamiento del PSC y los métodos. El propósito específico de este artículo es describir y demostrar 3 protocolos de PSC en la aplicación in vivo para la formación de hueso / regeneración. La bolsa muscular de ratón SCID es un modelo comúnmente descrito para la formación ectópica de hueso humano 7. Existen importantes diferencias entre ectópicos y ortotópico (defecto) los modelos de los huesos, incluyendo la interacción con los receptores que forman paracrina ósea las células 8, así como una gran cantidad de factores osteogénicos de señalización presentes en el microambiente del defecto óseo. Dos defectos se presentan aquí, un defect8 calota y el defecto femoral segmentaria 4. Ambos están bien documentados a ser crítico de tamaño (es decir, no se curan por sí solas). Existen diferencias interesantes entre los defectos craneales y femorales. En primer lugar, elcelular: la interacción entre las células y las células PSC xenoinjertados endógenos es muy diferente. En términos de un defecto craneal, PSC interactuar con la duramadre subyacente (la capa más externa de las meninges), así como aquellos osteoblastos y células periósticos que circunscriben el sitio del defecto. Es importante destacar que la interacción entre las células implantadas y los osteoblastos que rodean 8, o de las células implantadas y que subyace a la duramadre (Levi et al., En prensa) son fundamentales para la célula madre normal mediada la osteogénesis para continuar. En términos del defecto femoral segmentaria (FSD), PSC xenoinjertados están expuestos a una celda muy diferente y el medio ambiente de citoquinas. Por ejemplo, el sitio FSD se compone de las células madre de médula ósea y de acompañamiento mesenquimales, así como el endostio, periostio y los osteoblastos de huesos largos. En teoría, cada célula tiene su propia reacción a una lesión, y cada uno puede tener de células: las interacciones celulares con xenoinjertos PSC. Otras claras diferencias existen entre la calotay los defectos femorales. Los huesos craneales inicialmente forman a través de osificación intramembranosa, mientras que los huesos se forman largas a través de un intermedio de cartílago (osificación endocondral). Por otra parte, el proceso de reparación después de la lesión también imita estos orígenes evolutivos. Después de la FSD, la formación de cartílago de callos se observa, mientras que no intermedia del cartílago se forma dentro de un defecto de hueso parietal. Finalmente, el origen embrionario del cráneo puede diferir de la de los huesos largos. La mayoría del cráneo (incluyendo las células perivasculares - pericitos - en la región de la cabeza entera) se deriva de la cresta neural (mesectoderm), mientras que el esqueleto apendicular es de derivación mesodermo paraxial 9. Todas estas diferencias pueden resultar en diferencias significativas en cuanto a la reparación ósea mediada por PSC. El uso de la PSC tiene varias ventajas sobre los tradicionales derivadas de tejido adiposo células del estroma (ASC). PSC no requieren de la cultura y son una población de células purificadas WHIch no incluye otras células del estroma que no participan en el - e incluso se puede regular negativamente - la diferenciación osteogénica, como las células endoteliales 10. En contraste, por ejemplo, los análisis clonales de ASCs muestran que sólo una subpoblación son capaces de experimentar diferenciación osteogénica in vitro 11. En última instancia, los esfuerzos de ingeniería de tejidos esqueléticos probable que incorpore una célula madre osteocompetent (como PSC) con factores de crecimiento exógenos y un osteoconductivo andamio (tales como HA-PLGA utilizada en los presentes métodos) para curar mejor defectos óseos.

el uso de las células estaminales perivasculares para la regeneración ósea

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Las células madre perivasculares (PSC) puede ser aislado en un número suficiente de múltiples tejidos para fines de tejido esquelético ingeniería 1-3. PSC son una población FACS-ordenados de &#39;pericitos&#39; (CD146 + CD34-CD45-) y de células adventicias (CD146-CD34 + CD45-), cada uno de los cuales ya hemos informado que tienen propiedades de las células madre mesenquimales. PSC, como MSC, son capaces de someterse a la diferenciación osteogénica, así como secretan pro-osteogénico 1,2 citoquinas. En el presente protocolo, se demuestra la osteogenicity del PSC en varios modelos animales, incluyendo un implante de bolsa muscular en SCID (inmunodeficiencia combinada severa) en ratones, un defecto del ratón SCID del calvario y un defecto femoral segmentaria (FSD) en ratas atímicos. El músculo del muslo modelo de bolsa se utiliza para evaluar la formación de hueso ectópico. Defectos de calota se centran en el hueso parietal y son de forma estándar de 4 mm de diámetro (tamaño crítico) 8. FSD son bicortical y se estabilizan conuna barra de polietileno y 4 K-cables. El FSD descrito es también un defecto de tamaño crítico, que no curan significativamente en su propio 4. Por el contrario, si las células madre o factores de crecimiento son añadidos al sitio del defecto, la regeneración ósea significativa se puede apreciar. El objetivo general de xenoinjerto PSC es demostrar la capacidad osteogénica de este tipo de células en modelos de regeneración tanto ectópicos y hueso ortotópico.

Las células madre perivasculares (PSC) son una nueva clase de madre para la regeneración celular del tejido óseo similares a las células madre mesenquimales (MSC). PSC puede ser aislado por FACS (fluorescencia de células activadas clasificación) a partir de tejido adiposo adquirido durante los procedimientos estándar de liposucción, entonces se combinan con una osteoinductivo andamio para lograr la formación de hueso<em&gt; En vivo</em&gt;.

El uso de las células estaminales perivasculares para la regeneración ósea

Las células madre perivasculares (PSC) humanas pueden aislarse en cantidades suficientes a partir de múltiples tejidos para fines de ingeniería de tejido esquelético1-3. Las PSC son ...

El objetivo general del siguiente experimento es observar los efectos del implante de células madre perivasculares en modelos de diferenciación ósea ectópicos y ortotópicos. Esto se logra primero mediante el aislamiento de células madre del tejido adiposo utilizando tecnología fax. Luego, se fabrican andamios personalizados para proporcionar una superficie para la diferenciación celular en un entorno ya sea ectópico u ortotópico.Para evaluar la formación ósea mediada por CPM, se crean defectos esqueléticos utilizando un modelo de bolsa muscular en ratón desnudo, un modelo de calota craneal en ratón desnudo o un modelo de defecto segmentario femoral en rata atímica, y el andamiaje injertado se coloca dentro del defecto. El análisis radiográfico, histológico y bioquímico revela que la diferenciación de células madre perivasculares conduce a una formación ósea significativa in vivo. La principal ventaja del uso de células madre perivasculares frente a otras fuentes más tradicionales de células madre es que los CPM, o células madre perivasculares, constituyen una población más homogénea, lo que aumenta la pureza de las células madre, potencia la producción de factores tróficos y posiblemente incrementa la formación ósea.Comience creando un andamio como se describe en el manuscrito adjunto. Prepare el andamio para la implantación añadiéndole una suspensión celular. Para los modelos de bolsa muscular en ratón o defecto calvarial, utilice una densidad de 250.000 células por cien microlitros tras la anestesia.Ratones skid de seis semanas de edad con isoflurano y buprenorfina. Realice una preparación estándar con Betadine en la extremidad trasera. A continuación, realice una incisión longitudinal bilateral de dos milímetros y use disección roma para crear bolsillos de cuatro milímetros de profundidad en los músculos bíceps femorales.Paralelo a la fibra muscular, solo se debe encontrar un sangrado mínimo. Inserte el implante injertado con PSC. Ahora, sutúre la fascia que recubre el músculo con un patrón continuo simple con Vicryl cinco oh.A continuación, cierre la piel con puntos de Vicryl 5-0 en un patrón subcuticular. Postoperatoriamente, trate a los animales con buprenorfina durante 48 horas y con T-M-P-S-M-X durante 10 días. El ratón debe caminar con facilidad el primer día postoperatorio.Después de inducir la anestesia con isoflurano en un ratón skid de 12 a 14 semanas de edad. Realice una preparación estándar con Betadine en la región calvarial. Comience con una incisión cutánea de ocho milímetros de longitud sobre la sutura sagital media del cráneo del ratón.A continuación, retire suavemente el periostio de la calota con un aplicador de algodón y utilice un aplicador para absorber la sangre. Ahora, utilizando una fresa trepanadora recubierta de diamante acoplada a una fresa dental de alta velocidad, realice un defecto óseo parietal de cuatro milímetros. El defecto debe ser de espesor completo, es decir, atravesando completamente el hueso, pero tenga extrema precaución para no lesionar la duramadre subyacente, ya que esto interferiría con la cicatrización.Ahora coloque suavemente el implante injertado con PSC en el sitio del defecto. Finalmente, sutúre la piel con seis puntos de Vicryl postoperatoriamente. Trate a los animales con buprenorfina durante 48 horas y con T-M-P-S-M-X durante 10 días.Comience por limpiar y preparar el fémur de una rata amic de 12 a 14 semanas de edad, que ha sido anestesiada con Isof fluorine. Utilice el protocolo estándar de Betadine. Realice una incisión longitudinal de 27 a 30 milímetros sobre la cara anterior lateral del fémur.A continuación, exponga el cuerpo del fémur separando los músculos vasto lateral y bíceps femoral para evitar una hemorragia excesiva. Tenga cuidado alrededor de los principales vasos sanguíneos. Para maximizar la consistencia de la regeneración ósea, completamente.Retire el periostio que recubre el defecto femoral, junto con el segmento femoral resecado. Evite dañar el nervio femoral para prevenir lesiones neurológicas. Coloque ahora una placa de polietileno sobre la superficie anterolateral del fémur.Seis orificios precortados en la placa acomodan agujas de Kirschner roscadas de 0,9 milímetros de diámetro. Utilizando la placa como plantilla, se perforaron seis agujas de Kirschner roscadas a través de la placa y ambas corticales. Con una pequeña hoja de sierra oscilante, realice un defecto medio de seis milímetros.Luego, implante la PSC y el andamio injertado en el defecto. Cierre el músculo y la fascia superpuestos con cuatro puntos de Vicryl absorbibles. Para asegurar el implante en su lugar, administre analgesia al ratón durante dos días posteriores a la cirugía y monitoree la dehiscencia de la herida durante cuatro semanas posteriores al implante en el bolsillo muscular.Hubo un aumento gradual del volumen óseo y de la densidad mineral ósea, observado mediante análisis de micro-TC y de RX tras el injerto de PSC, durante ocho semanas tras la creación de un defecto calvarial. No se observó curación ósea alguna sin andamiaje debido al tamaño crítico del defecto, ni con andamiaje pero sin células. Se estimó una curación mínima del entorno del 20%, tal como se esperaba. Se observó un aumento gradual de la osificación del defecto con un andamiaje sembrado.La osificación principal ocurrió dentro de las dos semanas. La osificación completa se produjo a las ocho semanas después de la creación de un defecto femoral. Se observó un aumento gradual de la osificación cuando el defecto fue tratado con BMP-2, con evidencia de unión ya a las cuatro semanas en algunos animales, y a las ocho semanas todos los animales estaban curados.En contraste, no se observó unión ósea sin un andamiaje o con un andamiaje sin células ni proteína recombinante. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo aislar células madre paravasculares, cómo utilizar luego estas células madre paravasculares en combinación con andamiajes osteoinductivos de PLGA, y finalmente, cómo emplear estos andamiajes combinados y productos celulares en tres métodos diferentes de ingeniería de tejidos. Al intentar realizar cada procedimiento tal como se presenta aquí, hay algunas consideraciones importantes que deben tenerse en cuenta. Primero, en el modelo de defecto craneal, la preservación precisa de la duramadre asegura que se produzca una cicatrización adecuada.En segundo lugar, para el modelo de defecto segmentario del fémur en ratas, es importante minimizar el trauma a los nervios y vasos sanguíneos circundantes. Una vez que una persona domina una técnica quirúrgica determinada como la presentada aquí, se puede esperar que cada implantación en el bolsillo muscular tarde aproximadamente 20 minutos en realizarse, y que cada defecto calvarial y defecto segmentario femoral pueda tardar hasta 30 minutos en ejecutarse adecuadamente.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Este protocolo describe el aislamiento de tejido adiposo derivado de células estromales de lipoaspirado y la creación de un 4 mm de tamaño crítico defecto craneal para evaluar la regeneración esquelética.

La reparación de un modelo de defecto crítico del tamaño de calota Uso adiposo derivados de las células del estroma cosechadas desde lipoaspirado

Las células madre mesenquimales (MSCs) tienen un potencial de diferenciación hacia el linaje osteoblástico cuando se estimulan con factores solubles o biomateriales específicos. Este trabajo presenta una opción novedosa para la administración de MSCs de la membrana amniótica humana (AM-hMSCs) que emplea la matriz ósea bovina Nukbone (NKB) como andamio.

El aislamiento de células madre mesenquimales humanas y su cultivo en la matriz del hueso poroso

tejido cardíaco humano alberga poblaciones de células precursoras multipotentes perivasculares que pueden ser adecuados para la regeneración miocárdica. La técnica descrita aquí permite el aislamiento simultáneo y purificación de dos poblaciones de células estromales multipotentes asociados con vasos nativos sangre, es decir CD146 + CD34 - pericitos y CD34 + CD146 - células adventicias, desde el miocardio humano.

Aislamiento de Perivasculares Multipotentes poblaciones de células precursoras de Cardíaca Tejido humano

El cultivo de células mesenquimales estromales humanas (hMSC) con suero autólogo, reduce los riesgos de rechazo por el material xenogénico y otros efectos negativos. También permite la recuperación de un subconjunto de progenitores mesodérmicos, que puede entregar hMSCs frescas. Incorporación de hMSCs en un coágulo de fibrina autóloga permite un manejo fácil y efectiva implantación quirúrgica.

Mesenquimales estromales de cultivo celular y de entrega en autólogas Condiciones: Enfoque inteligente para aplicaciones ortopédicas

Las células estromales derivadas del tejido adiposo pueden ser útiles para diseñar nuevo tejido a partir de las propias células de un paciente. Presentamos un protocolo para el aislamiento de una subpoblación de células estromales derivadas del tejido adiposo humano (ASCs) con mayor potencial osteogénico, seguido de la aplicación de las células en un ensayo de curación calvarial in vivo.

El aislamiento rápido de BMPR-IB + derivadas de tejido adiposo células estromales de uso en un Defecto La curación Modelo de calota

Aquí, presentamos un protocolo para visualizar la formación de vasos sanguíneos en vivo y en tiempo real en 3D andamios por microscopía multifotón. Angiogénesis en andamios modificados genéticamente fue estudiada en un modelo de defecto murino hueso calvarial de crítica. Más nuevos vasos sanguíneos fueron detectados en el grupo de tratamiento que en los controles.

Visualización de angiogénesis por microscopía multifotón En Vivo en modificados genéticamente 3D-PLGA/nHAp andamio para Calvarial críticos de la reparación del defecto óseo

Se presenta un método para crear y vivir-imagen diferentes nichos humanizados de médula ósea en ratones. Basándose en el nicho de soporte creado por las células mesenquimales humanas, la adición de células endoteliales humanas induce la formación de vasos humanos, mientras que la adición de rhBMP-2 induce la formación de tejido óseo maduro quimérico humano-ratón.

Bioingeniería de los microambientes humanizados de la médula ósea en el ratón y su visualización por imágenes en directo

Presentamos un protocolo para investigar los biomarcadores de la expresión de mRNA de células derivadas del periostio (PDC) inducidas por la vitamina C (vitamina C) y 1, 25-dihidroxi vitamina D [1,25-(OH) D23]. Además, evaluamos la capacidad de PDC se diferencian en osteocitos, condrocitos y adipocitos.

Aislamiento de células madre mesenquimatosas del periostio Alveolar humano y efectos de la vitamina D en la actividad osteogénica de células derivadas del periostio

La terapia ósea a través de la osificación endocondral mediante la implantación de tejido cartilaginoso artificial producido a partir de células madre mesenquimales tiene el potencial de eludir los inconvenientes de las terapias convencionales. Los hidrogeles de ácido hialurónico son eficaces para escalar injertos de cartílago uniformemente diferenciados, así como para crear hueso integrado con vascularización entre injertos fusionados in vivo.

Formación ósea integrada a través de la osificación endocondral in vivo utilizando células madre mesenquimales

Aquí, establecimos osteoorganoides in vivo activados por andamios de gelatina cargados con proteína morfogenética ósea 2 para recolectar células madre/progenitoras hematopoyéticas terapéuticas para la reconstrucción de un sistema hematopoyético e inmunológico dañado. En general, este enfoque puede proporcionar una fuente celular prometedora para las terapias celulares.

Enfoque osteo-organoide in vivo para la recolección de células madre/progenitoras hematopoyéticas terapéuticas

Aprende a utilizar células estaminales perivasculares aisladas de tejido adiposo mediante FACS para regeneración ósea en modelos ectópicos y ortotópicos. Este método demuestra formación ósea significativa en ocho semanas.

El uso de las células estaminales perivasculares para la regeneración ósea

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