El aislamiento de las variantes de los virus de ARN de fidelidad y caracterización de la frecuencia de mutación de virus

Los virus de ARN utilizan ARN polimerasas codificadas por el virus para replicar sus genomas. Estas polimerasas tienen una tasa de error intrínsecamente más alta, lo que permite al virus adaptarse y evolucionar rápidamente. Este video presenta un método optimizado para detectar e identificar virus con mutaciones en su ARN polimerasa que afectan la tasa de error o la fidelidad durante la replicación.

Primero, se aplican mutágenos a las células huésped virales para determinar el nivel máximo de mutágeno que puede utilizarse sin matar las células o inhibir al virus. Una vez determinadas las condiciones óptimas, se realiza el paso del virus bajo la presión selectiva de mutágenos de ARN. Luego, se secuencia la población resistente al mutágeno para identificar la mutación responsable.

A continuación, se aísla el mutante resistente a mutágenos. Se monitorean la cinética de replicación y los resultados muestran aumentos o disminuciones en la fidelidad de la polimerasa. Esto ocurre simultáneamente con una resistencia amplia a mutágenos de ARN y alteraciones en la frecuencia de mutación de la población viral.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como los ácidos de fidelidad bioquímica utilizando polimerasas purificadas, es que las técnicas descritas son válidas para cualquier virus de ARN que pueda cultivarse en cultivo de tejidos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la virología, como el papel de la tasa de polimerasa en la adaptación y evolución del virus. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque las presiones selectivas que utilizan son demasiado fuertes o demasiado débiles, y el tamaño de la muestra de secuencias analizada de la región y el número de clones no se han optimizado para obtener poder estadístico.

Comience este experimento determinando el rango de concentraciones de mutágenos que pueden utilizarse en los siguientes experimentos sin provocar la muerte celular. Aspire el medio de placas de seis pocillos que contienen monocapas subconfluentes de células hilar. Luego agregue dos mililitros de medio suplementado con mutágeno aquí, se utilizan los mutágenos ribavirina, cinco Flo uracilo, cinco azacitidina, cloruro de magnesio y cloruro de manganeso.

Incube las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Luego, cada 24 horas durante los siguientes dos a siete días, utilice una placa de células para verificar la viabilidad mediante la exclusión de azul de tripano. Usando un hemocitómetro, calcule el porcentaje de células viables para cada concentración de mutágeno, incluidas las condiciones de control no tratadas que resultan en menos del 50% de muerte celular al momento del punto final de la infección.

Cuando se alcanzan las títulos máximos ideales, el siguiente paso del procedimiento consiste en determinar la concentración del mutágeno que ejercerá una presión selectiva óptima sin sobre-mutar la población en las concentraciones adecuadas. Cada genoma se muta al menos en una o dos posiciones. El mutágeno generará así la mutación de resistencia, que luego será seleccionada durante el paso.

Si se introducen demasiadas mutaciones, los mutantes que portan la mutación de resistencia serán ellos mismos letales. El mutágeno dificultará su aislamiento en placas de seis pocillos sembradas con nuestras células en dos mililitros de medio suplementado con mutágeno. Utilice el mismo rango de concentraciones que antes, excluyendo aquellas concentraciones que resultaron en más del 50 % de muerte celular.

Incubar durante dos horas para permitir la absorción del agente mutagénico tras la incubación. Aspirar el medio e infectar con el virus a baja multiplicidad de infección en 200 microlitros; incubar de 15 a 60 minutos para permitir que el virus infecte las células, agitando la placa a intervalos regulares para asegurar que el inóculo cubra la monocapa celular. Aspirar el virus inoculado y lavar dos veces con dos mililitros de PBS para eliminar la mayor cantidad posible del inóculo.

Luego, agregue medio con mutágeno a cada pocillo e incube las células durante el equivalente de tres a seis ciclos de replicación, generalmente de dos a siete días. Recopile el virus de cada pocillo y realice un ensayo estándar de placas o una dilución limitante para determinar el efecto antiviral sobre la titulación del virus a partir de las titulaciones calculadas. Identifique la concentración de mutágeno que reduzca las titulaciones del virus en comparación con la infección control no tratada entre 0,5 y 2 logaritmos y que además no sea altamente tóxica para las células.

En condiciones ideales, menos del 50 % de toxicidad para aislar variantes resistentes a mutágenos, comience por hacer pasar el virus a través de células huésped en presencia de la concentración óptima de cada mutágeno. Es posible que el virus deba pasarse hasta 30 veces; en cada paso, determine la titulación del virus y repita la infección y la incubación con el mutágeno como se muestra aquí. Los títulos virales de las muestras tratadas con mutágeno deberían disminuir durante los primeros pases en comparación con el título viral original y los títulos del control no tratado. Una vez que los títulos virales de una serie determinada alcancen una magnitud similar a la de los títulos del control no tratado, esto sugerirá resistencia.

Extraiga el ARN viral para secuenciación utilizando cebadores que amplifiquen los genes de la polimerasa o replicasa del virus de interés. Genere ADNc del genoma viral mediante RT-PCR y luego secuencie el ADN. Una vez obtenida la información de la secuencia.

Utilice un software de alineamiento para alinear las secuencias resultantes con el consenso de referencia e identificar las nuevas mutaciones puntuales. Además, revise los cromatogramas en busca de picos minoritarios que podrían haber sido pasados por alto por el software de alineamiento. Un mutante que represente entre el 20 y el 30 % de la población total aún se mostrará como un pico, pero demasiado pequeño para ser identificado como un nucleótido mixto mediante un análisis de secuencia estándar. Para identificar la mutación de interés, busque polimorfismos de un solo nucleótido que aparezcan exclusivamente en la población tratada con mutágeno en comparación con el control no tratado de la misma pasaje, como se muestra aquí. Una vez identificada una mutación, la variante resistente debe regenerarse a partir de ADNc infeccioso o aislarse en cultivo tisular, y debe confirmarse el fenotipo de resistencia.

Aquí aislamos mediante ensayo de placas para obtener los mutantes identificados. Prepare diluciones seriadas de la muestra resistente al nitrógeno y añádalas a monocapas celulares en placas de seis pocillos para un ensayo de placas, tras una incubación de una hora a 37 grados Celsius y cinco por ciento de dióxido de carbono. Añada una capa superior de agarosa entre dos y cinco días después de la infección.

Las placas deben ser claramente visibles. Idealmente, una de las placas producirá entre 10 y 50 placas bien separadas. Marque la ubicación de las placas en la placa con un punto, utilizando un marcador, teniendo cuidado de no desalojar ni desplazar la posición de la capa superior; inserte suavemente una punta de pipeta filtrante P200 a través de la capa de agaros.

Para obtener la placa, levante cuidadosamente la punta fuera de la capa superior y transfiera el tapón de aros a un tubo de microcentrífuga que contenga 250 microlitros de medio. Se transferirá una cantidad suficiente de virus independientemente de si el tapón de aros se libera de la punta; vortexe el tubo y tome hasta diez veces por tratamiento. Guarde una porción de la muestra para amplificar el virus vivo posteriormente.

Luego, extraiga el ARN del resto de la muestra y realice RT-PCR para identificar la muestra de placa que contiene la mutación deseada. Secuencie el ADNc. Asegúrese de que no haya mutaciones adicionales.

Luego prepare un stock mayor de este virus para todos los estudios posteriores. A continuación, confirme la resistencia conferida por la mutación identificada. Repita el ensayo con mutágenos utilizando varias condiciones mutagénicas.

Si la variante es resistente a múltiples mutágenos, probablemente tenga una fidelidad aumentada. Dado que las mutaciones que alteran la fidelidad se localizan en la polimerasa, es importante confirmar que la cinética de replicación no se haya modificado significativamente. Antes de determinar las frecuencias de mutación, examine la replicación mediante al menos dos enfoques complementarios.

Por ejemplo, se puede realizar un enfoque que examine la producción de virus, como el ensayo de placas o la CIDT 50, además de un enfoque que examine la síntesis de ARN, como la R-T-P-C-R cuantitativa o la hibridación tipo northern blot. A continuación, para confirmar que el cambio identificado en la polimerasa que confiere resistencia al mutágeno altera la replicación, se miden las frecuencias de mutación por fidelidad. Esto puede realizarse tanto en poblaciones de virus viables como en poblaciones virales totales.

Para determinar las frecuencias de mutación de la población total de virus, que incluye variantes viables y no viables, extraiga el ARN y amplifique mediante RT-PCR una región de 800 a 1.200 nucleótidos de una secuencia codificante que se sabe que presenta variantes genéticas, como la que codifica para una proteína estructural. A continuación, clone por topo TA el producto purificado de cada población viral que se estudiará. Seleccione 96 colonias identificadas como portadoras de un inserto positivo mediante la selección azul-blanco en placas recubiertas con Xga.

Realice una PCR de colonia individual para confirmar la validez del tamizaje blanco azul. Utilizando el tamaño del fragmento y las condiciones anteriores, aproximadamente el 90 % de las colonias deberían ser positivas. Para cada colonia blanca positiva, use un palillo para transferir cada colonia a un mililitro de medio LB en 96.

Bueno, las placas de cultivo bacteriano se incuban durante la noche a 37 grados Celsius con agitación constante. Al día siguiente, aísle el ADN preparando minipreparaciones en formato de placa de 96 pocillos, secuenciando cada placa con suficientes cebadores para obtener la máxima cobertura del fragmento clonado.

Dos cebadores con cobertura de 600 bases deberían ser suficientes. Realice el análisis de secuencias utilizando una secuencia de referencia o consenso para cada población y un software de alineamiento adecuado que pueda identificar fácilmente polimorfismos de un solo nucleótido aquí. Busque el software Man del DNA Star Laser.

El gen se utiliza primero para descartar secuencias de baja calidad, como aquellas con llamadas de bases defectuosas en muchos extremos o aquellas que tienen una longitud demasiado corta. Alinear las secuencias restantes. Identificar el rango de nucleótidos cubierto por todas las secuencias en el análisis.

Descarte los clones que no estén completamente cubiertos en esta región. Por razones de comparación, es fundamental que la misma región esté completamente cubierta. Identifique y cuente los polimorfismos de un solo nucleótido que difieran de la cepa de referencia.

Calcule la frecuencia de mutación dividiendo el número total de polimorfismos de un solo nucleótido entre el número total de nucleótidos secuenciados. Presente este valor como el número promedio de mutaciones por cada 10.000 nucleótidos secuenciados. Si el mismo polimorfismo de un solo nucleótido aparece en un gran número de clones, presente dos valores que incluyan o excluyan estas mutaciones repetidas.

Determine la distribución de mutaciones. Elabore una lista ordenada del número de clones en cada población que presentan 0, 1, 2, 3, y así sucesivamente. Mutaciones en la región secuenciada como una opción.

Utilice las secuencias editadas para calcular todas las comparaciones por pares posibles dentro de una muestra y obtener los valores medios de diversidad poblacional. Existen varios programas de alineamiento disponibles aquí. El programa de análisis genético evolutivo molecular, también llamado mega, se utiliza para determinar las condiciones óptimas para seleccionar la resistencia a la mutagénesis del ARN.

Nuestras células fueron tratadas con concentraciones crecientes de ribavirina e infectadas con el virus Cox AKI B de tipo silvestre a una multiplicidad de infección de 0,01, 48 horas posteriores a la infección. Se recolectó el virus progenie y los títulos se determinaron mediante la dosis infectiva tisular 50 (TCID50). Esta figura indica el porcentaje de células sobrevivientes al tratamiento por debajo del eje x, determinado mediante tinción con azul de tripano a las 48 horas posteriores a la infección.

Los resultados muestran que las concentraciones de 100 y 200 micromolar reducen el título del virus en uno a dos logaritmos sin afectar la viabilidad celular. Para seleccionar poblaciones resistentes al mutágeno, el virus CHI ganga se pasó en células hilar en presencia barras grises o ausencia barras negras de 50 micromolar de ribavirina; tras cada paso, la progenie viral se cuantificó mediante un ensayo clásico de placas en células BHK, como se puede observar aquí. El efecto mutagénico es evidente durante los primeros pasajes, donde el título del virus tratado disminuyó en dos logaritmos.

Gradualmente, Titus regresó a los niveles normales sin tratamiento. No se observan diferencias significativas en cinco poblaciones tratadas con mutágenos en comparación con las no tratadas, lo que sugiere que se han seleccionado variantes resistentes. De hecho, el secuenciamiento identificó mutaciones únicas en la población viral sometida al tratamiento con ribavirina. Para confirmar la resistencia amplia a mutágenos de ARN de estructura diferente, se evaluó la variante de alta fidelidad A 3 72 V del virus COA B tres, aislada inicialmente en el cribado, para determinar su sensibilidad reducida frente a diferentes concentraciones de los mutágenos de ARN ribavirina, fluorouracilo y azacitidina.

Las células fueron tratadas con las concentraciones indicadas de ribavirina e infectadas con el virus Cox AKI tipo silvestre B a una multiplicidad de infección de 0,01, 48 horas posteriores a la infección. Se recolectó el virus progenie y se determinaron las titulaciones mediante TCID50. Aquí se muestran los títulos del tipo silvestre y de la variante A372 en función de la concentración del mutágeno. La variante A372 presenta consistentemente títulos más altos que el tipo silvestre.

Bajo todas las condiciones evaluadas para determinar la cinética de crecimiento en un solo paso de la producción de virus, nuestras células fueron infectadas a una multiplicidad de infección de 10 con cualquiera de las variantes de alta fidelidad de tipo silvestre, A 3 72 V, o con la variante deficiente en replicación CX 64 del virus Cox AKI B. En los puntos de tiempo indicados, la descendencia viral fue recolectada de las células y los sobrenadantes mediante congelación-descongelación y titulada por TCID50. El aumento de fidelidad de A 3 72 V no coincide con un defecto observable en la replicación en cultivo celular. La variante CX 64 presenta un retraso significativo en la cinética de replicación y alcanza títulos máximos que son 1000 veces más bajos que los del virus de tipo silvestre.

Mediante el enfoque descrito en este video, cada clon que se secuencia proviene de un genoma único dentro de la población total de virus y, por lo tanto, presenta mutaciones únicas. Esta figura muestra una alineación típica tras la limpieza de secuencias de baja calidad y la visualización de polimorfismos de un solo nucleótido. Se contabilizaron los polimorfismos de un solo nucleótido totales dentro de una población y se anotó el número de polimorfismos de un solo nucleótido presentes en cada clon.

Por ejemplo, el clon subrayado con una barra contiene dos mutaciones únicas, mientras que otros ocho clones contienen una sola mutación única. Estos datos se utilizan para compilar una tabla como la mostrada aquí. La tabla muestra la distribución ordenada de los clones secuenciados según el número de mutaciones.

La comparación estadística de valores clasificados puede determinar si una distribución es significativamente diferente de otra. Para facilitar la interpretación, los datos numéricos obtenidos a partir del análisis de secuencias y estadístico se pueden representar como un gráfico o un histograma. Como se muestra aquí, el virus A 3 72 V genera menos mutaciones que el tipo salvaje y presenta una frecuencia de mutación significativamente menor con un valor P inferior a 0,01.

La misma población viral del virus de la gangrena del pollo produce frecuencias de mutación similares, ya sea que se utilice el stock vírico o una dilución de 10 a la cinco para la extracción de ARN. Por lo tanto, tras seguir este procedimiento, podría interesar realizar ensayos bioquímicos in vitro o estudios de cristalización para comprender mejor la base mecanicista y estructural de la fidelidad en esta variante de la polimerasa.

Tras este desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología exploraran la correlación entre la diversidad genética y la aptitud viral in vivo. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo aumentar tus probabilidades de aislar variantes de fidelidad de virus de ARN y cómo utilizar las frecuencias de mutación para identificar estas diferencias de fidelidad.