Preparación de neuronas de rata E18 cortical de compartimentación en un dispositivo de microfluidos

Hola y bienvenidos al laboratorio del Dr. Newly John. En un video anterior, demostramos cómo fabricamos el dispositivo neuronal, una plataforma que permite al investigador separar los cuerpos celulares de las neuronas de una fracción axonal pura. La litografía blanda es la técnica utilizada para fabricar los dispositivos, que consiste en verter y curar PDMS sobre una oblea de silicio que contiene el diseño del dispositivo, fabricado previamente mediante litografía por fotolitografía.

En este video, demostraremos la preparación de neuronas corticales de rata spro dolly E 18 y cómo cargar las neuronas en el dispositivo neuronal. Me gustaría presentarle a Kiana Lee. Ella realizará las demostraciones hoy.

Antes de comenzar, es importante tener todos los medios y reactivos necesarios calentados a 37 grados en el baño de agua. Puede observar el medio neurobasal, tripsina al 0,25 % y DMEM que contiene suero bovino fetal al 10 %. Es fundamental asegurarse de que todo lo que se coloque en la cabina para usar durante el mantenimiento de las células esté esterilizado y limpiado con etanol al 70 %.

Primero, se limpia la cabina de cultivo celular con etanol al 70 %. A continuación, se rocían con etanol los estantes de plástico utilizados para sostener los tubos. Después, se limpia con etanol la bola de goma utilizada en el proceso de triestriación.

Es importante hacer esto al principio para que tenga tiempo suficiente para secarse. A continuación, los reactivos necesarios se limpian con etanol y se trasladan a la cabina. Dos fragmentos de corteza fetal de rata E18, correspondientes a un cerebro previamente diseccionado, se colocan en un tubo de 15 ml que contiene un ml de tampón de disección frío con hielo, sin calcio ni magnesio. Se añade un ml de tripsina-EDTA al 0,25 % a la corteza en el tampón de disección, alcanzando un volumen final de dos ml y una concentración final de tripsina del 0,125 %. El tubo de 15 ml que contiene la corteza con la tripsina recién añadida se coloca entonces en un baño de agua a 37 °C durante ocho minutos, mientras la corteza fetal se incuba a 37 °C en tripsina.

Tres pipetas de vidrio se pulen con fuego. La punta de la pipeta de vidrio se coloca en contacto ligero con la llama, cerca de la parte azul de la llama, y se gira lentamente hasta que solo la abertura se vuelva anaranjada. A medida que adquiere un color anaranjado.

Es importante mantener la rotación de la pipeta de vidrio para que no colapse. Observe que las aberturas de las pipetas de vidrio son sucesivamente más pequeñas. También es importante tener en cuenta que no debe hacer las aberturas demasiado pequeñas, ya que esto puede causar la lisis de las células después de que la corteza haya sido incubada durante ocho minutos a 37 grados; entonces, se añaden 10 ml de DMEM que contienen 10 % de FBS a la corteza para ayudar a detener la reacción de la tripsina.

El tubo de 15 ml que contiene la corteza y DMEM con 10 % de FBS se centrifuga a 2.500 RPM durante dos minutos. En la cabina de seguridad biológica, se utiliza una succión al vacío conectada a una pipeta de vidrio para eliminar el sobrenadante de la corteza, teniendo cuidado de no perturbar ni desplazar el precipitado.

Se añade un ml de medio basal neural que contiene B 27 y glutamato al pellet de cortex y se pipetea suavemente hacia arriba y hacia abajo. Es muy importante no crear burbujas de aire al pipetear hacia arriba y hacia abajo, ya que las burbujas de aire pueden dañar las células por oxidación. A continuación, se utiliza la pipeta posterior pulida al fuego con la abertura más ancha para triturar el cortex, colocando una bombilla de goma estéril en el extremo de la pipeta y pipeteando hacia arriba y hacia abajo aproximadamente cinco veces.

Teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire. Bien. El proceso continúa con las otras dos pipetas de vidrio, cada una con una abertura de tamaño reducido. Como se indicó anteriormente, es importante asegurarse de que no se introduzcan burbujas durante el proceso de trefilado.

También debería notar que ya no ve fragmentos visibles. Es importante seguir centrifugando hasta que ya no se puedan ver ninguno de los fragmentos del cortex en el medio. Tras la centrifugación, las células se centrifugan nuevamente a 2.500 RPM durante dos minutos.

Este es aproximadamente el tamaño del pellet que se esperaría obtener de dos fragmentos de corteza. Después de la centrifugación, el sobrenadante se retira nuevamente del pellet celular. Una vez eliminado el sobrenadante, se añade un ml de medio neurobasal que contiene B27 y glutamato a la corteza y se utiliza para resuspenderla.

El precipitado celular se aspira y expulsa nuevamente cuidadosamente para evitar introducir burbujas y asegurar que el precipitado se distribuya y desintegre uniformemente. Se añade un mil adicional de medio neurobasal a la suspensión celular, alcanzando un volumen final de dos mil. A continuación, la solución celular resuspendida se filtra a través de un filtro celular de 40 micrones de BD Biosciences antes de contar las células y evaluar su viabilidad.

Se colocan 60 microlitros de medio basal neural fresco en un tubo microfuga estéril. Luego, se añaden 20 microlitros de células a los 60 microlitros de medio basal neural, y finalmente, se agregan 20 microlitros de azul de tripano a las células en el medio basal neural. El azul de tripano tiñirá las células que ya no están vivas tras la tinción con azul de tripano.

Se pipetean 20 microlitros sobre un hemocitómetro y se observan al microscopio. Las células viables aparecen claras y translúcidas, mientras que las células con membranas perforadas se tiñen de azul debido al azul de tripano. Típicamente, obtenemos alrededor de 2,5 millones de células y 8 millones de células por corteza.

Normalmente obtenemos dos fragmentos de la corteza de un cerebro, con las células resuspendidas en un volumen final de dos mililitros. Por lo tanto, la concentración final de células suele estar entre 2,5 millones de células por mililitro y 8 millones de células por mililitro. Normalmente, cargamos alrededor de 20 microlitros de células por dispositivo.

Esto nos proporciona un rango de células por dispositivo entre 50.000 y 160.000 células. Las densidades celulares pueden variarse según la aplicación. Sin embargo, sembrar neuronas primarias a una densidad demasiado baja generalmente conduce a la muerte celular. Los dispositivos previamente preparados que contienen medio basal neural se introducen en la cabina de seguridad biológica para mantener la esterilidad.

Se elimina el exceso de medio de los pocillos mediante una sección de vacío. Sin embargo, se debe tener cuidado de no eliminar todo el medio. Debe quedar algo de medio en el canal principal; solo se debe aspirar el medio de los depósitos.

Solo se aplican 20 microlitros de células al depósito superior izquierdo del dispositivo. Las células fluyen hacia el dispositivo y se adhieren a la superficie tratada con PLL. Aquí pueden observarse las células mientras fluyen a través del canal principal, y comenzará a verse cómo algunas de ellas se adhieren efectivamente al vidrio.

Después de la carga, los dispositivos que contienen las células se devuelven al incubador durante aproximadamente 10 minutos para permitir que las células se adhieran. Después de 10 minutos en el incubador, los dispositivos se llevan nuevamente a la cabina de seguridad biológica y los depósitos se llenan con medio; luego, los dispositivos se devuelven al incubador. Algunos aspectos importantes a tener en cuenta son que, dependiendo del incubador y del nivel de humedad, el medio podría necesitar cambiarse en los dispositivos cada dos o tres días.

Es una buena práctica colocar medio fresco en los pocillos superiores y permitir que algo de medio fresco fluya a través del dispositivo y hacia los canales principales antes de llenar todos los depósitos. Las neuronas se visualizan aquí con amarillo de calcio, un colorante permeable a la célula que tiñe las células vivas. Aquí se puede observar el compartimento somático o lado celular del dispositivo, que contiene los cuerpos celulares, axones y dendritas.

Mientras desplazamos la vista por el dispositivo, puede observarse las microestrías por las que crecen los axones para alcanzar el otro lado del dispositivo, el lado de los axones, que contiene una fracción pura de axones. A efectos de demostración, estas células marcadas con fluorescencia se utilizarán para ilustrar el procedimiento de axotomía.

Una de las propiedades del dispositivo neuronal es que permite al investigador realizar una exotomía, es decir, cortar los axones a partir de la fracción axonal pura del dispositivo, con el fin de llevar a cabo investigaciones como el estudio de la regeneración axonal. Keano demostrará ahora cómo realizar la exotomía en el dispositivo neuronal, la cual se lleva a cabo mediante vacío.

Se coloca una pipeta de vidrio estéril en la abertura inferior del pocillo del lado axonal y se aspira el medio mediante vacío. Se elimina completamente todo el medio del lado axonal del dispositivo, incluido el medio presente en el canal principal. Para repetir el proceso tras la eliminación del medio, se inyectan forzosamente 150 microlitros de medio en el canal principal colocando la punta de la pipeta en la abertura del canal principal y presionando la pipeta con fuerza.

A continuación, se aplica vacío a la abertura del canal principal y al pocillo superior del lado axonal del dispositivo. Una vez más, se utiliza vacío para eliminar todo el medio del lado axonal, incluyendo el canal principal. Nuevamente, se fuerza la entrada de 150 microlitros de medio en el canal principal colocando la punta de la pipeta en la abertura del canal principal y presionando la pipeta con fuerza.

En este punto, el investigador puede observar el dispositivo bajo un microscopio para verificar la eficiencia del corte de los axones. Si los axones no se han cortado suficientemente, el proceso puede repetirse cuantas veces sea necesario. En este video, le hemos mostrado cómo preparar neuronas corticales fetales de rata de E 18 y cargarlas en el dispositivo para neuronas.

La principal ventaja de estos dispositivos es la capacidad de separar y compartimentar el cultivo de los cuerpos celulares neuronales en un lado del dispositivo de una fracción pura de axones en el otro lado del dispositivo. Esperamos que este video le haya resultado informativo y útil. Eso es todo desde el Laboratorio John.

Gracias por ver.