Preparación de neuronas de rata E18 cortical de compartimentación en un dispositivo de microfluidos

Hola y bienvenidos al laboratorio del Dr. Newly John. En un vídeo anterior, demostramos cómo fabricamos el dispositivo neuronal, una plataforma que permite al investigador separar los cuerpos celulares de las neuronas de una fracción axonal pura. La litografía blanda es la técnica utilizada para fabricar los dispositivos, que consiste en fundir y curar PDMS sobre una oblea de silicio que contiene el diseño del dispositivo que se fabricó previamente mediante fotolitografía.

En este video, demostraremos la preparación de las neuronas corticales de rata spro dolly E 18 y cómo cargar las neuronas en el dispositivo neuronal. Me gustaría presentarles a Kiana Lee. Ella estará haciendo las demostraciones hoy.

Antes de comenzar, es importante tener todos los medios y reactivos necesarios a 37 grados en el baño de agua. Puede ver medios neurobasales con 0,25% de tripsina y DMEM que contienen 10% de FBS. Es importante asegurarse de que todo lo que se coloque en la campana para reparar las celdas esté esterilizado y se limpie con etanol al 70%.

En primer lugar, la campana de cultivo de tejidos se limpia con etanol al 70%. A continuación, las rejillas de plástico utilizadas para sujetar los tubos se rocían con etanol. A continuación, la bola de goma utilizada en el proceso de triple estría, se limpia con etanol.

Es importante hacer esto desde el principio para que tenga tiempo suficiente para secarse. A continuación, los reactivos necesarios se limpian con etanol y se trasladan a la campana. Dos piezas de corteza fetal de rata E 18 que representan un cerebro previamente disecado se colocan en un tubo de 15 ml que contiene un ml de tampón de disección helado, libre de calcio y magnesio, un ml de tripsina EDTA al 0,25% se añade a la corteza en el tampón de disección, lo que eleva el volumen final a dos molinos y la concentración final de prueba al 0,125%. en un baño de agua a 37 grados durante ocho minutos, mientras la corteza fetal se incuba a 37 grados en tripsina.

Tres pipetas de pasta están pulidas al fuego. La punta de la pipeta de vidrio se coloca justo en contacto con la llama cerca de la parte azul de la llama y se gira lentamente hasta que solo la abertura se vuelve naranja. Mientras se volvía naranja.

Es importante seguir girando la pipeta de vidrio para que no colapse. Tenga en cuenta que las aberturas de las pipetas de vidrio son sucesivamente más pequeñas. También es importante tener en cuenta que no debe hacer las aberturas demasiado pequeñas, ya que esto puede causar lisis de las células después de que la corteza se haya incubado durante ocho minutos a 37 grados con la tripsina, se agregan 10 ml de DMEM que contiene 10% de FBS a la corteza para ayudar a detener la reacción de tripsina.

El tubo de 15 ml que contiene la corteza y DMEM 10%FBS se centrifuga a 2.500 rpm durante dos minutos. En la cabina de bioseguridad, se utiliza la succión al vacío conectada a una pipeta de vidrio para eliminar el sobrenadante de la corteza. Teniendo cuidado de no perturbar o desprender el pellet.

Se añade un ml de medio basal neural que contiene B 27 y glutamato a la pastilla de la corteza y se pipetea suavemente hacia arriba y hacia abajo. Es muy importante no crear burbujas de aire mientras se pipetea hacia arriba y hacia abajo, ya que las burbujas de aire pueden dañar las células por oxidación. A continuación, la pipeta posterior pulida al fuego con la abertura más ancha que se utiliza para probar la corteza conectando un bulbo de goma estéril al extremo de la pipeta y pipeteando hacia arriba y hacia abajo aproximadamente cinco veces.

Teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire. Bien. El proceso ha continuado con las otras dos pipetas de vidrio, cada una con el tamaño de apertura disminuido. Como se indicó anteriormente, es importante asegurarse de que no se introduzcan burbujas durante el proceso de triestría.

También debería notar que ya no ve ningún trozo visible. Es importante mantener la calificación tri hasta que ya no pueda ver ninguno de los trozos de la corteza en los medios. Después de la ación, las celdas se vuelven a fusionar por centrif a 2.500 rpm durante dos minutos.

Esto es aproximadamente el tamaño aproximado de la bolita que uno esperaría de dos piezas de corteza. Después de la centrifugación, la sup natin se elimina una vez más de la pellet de la célula. Después de que se elimina la supernatina, se agrega a la corteza un ml de medio neurobasal que contiene B 27 y glutamato y se usa para suspender la corteza.

Una vez más, el pellet de celda se pipetea hacia arriba y hacia abajo con cuidado para evitar agregar burbujas y garantizar que el pellet de celda se distribuya y rompa uniformemente. Se añade una milésima de pulgada más de medio neurobasal a la suspensión celular, lo que eleva el volumen final a dos milésimas de pulgada. A continuación, la solución celular resuspendida se filtra a través de un filtro celular de 40 micras de BD biosciences para contar las células y evaluar la viabilidad.

Se colocan 60 microlitros de medio basal neural fresco en un tubo de microfuga estéril, luego se agregan 20 microlitros de células a los 60 microlitros de medio neurobasal y, finalmente, se agregan 20 microlitros de azul de trian a las células en el medio neurobasal. El azul de trian teñirá las células que ya no estén vivas después de que las células se hayan teñido con azul de trian.

Pipeteamos 20 microlitros en un hemocitómetro y los observamos bajo el microscopio. Las células viables parecen claras y translúcidas, mientras que las células que tienen sus membranas perforadas se tiñen de azul debido al azul triano. Normalmente, obtenemos alrededor de 2,5 millones de células y 8 millones de células por corteza.

Normalmente obtenemos dos partes de la corteza de un cerebro con las células resuspendidas en un volumen final de dos milésimas de pulgada. Por lo tanto, la concentración final de células suele estar entre 2,5 millones de células por milímetro y 8 millones de células por mil. Normalmente, cargamos unos 20 microlitros de células por dispositivo.

Esto nos da un rango de celdas por dispositivo entre 50.000 celdas y 160.000 celdas. Las densidades de las celdas pueden variar en función de la aplicación. Sin embargo, la siembra de neuronas primarias a una densidad demasiado baja suele provocar la muerte celular. Los dispositivos previamente preparados que contienen medios basales neuronales se introducen en el gabinete de bioseguridad para mantener la esterilidad.

El exceso de medios de los pocillos se elimina mediante una sección de vacío. Sin embargo, hay que tener cuidado de no eliminar todos los medios. Debe haber algunos medios en el canal principal, solo aspirar medios de los depósitos.

Solo se aplican 20 microlitros de células en el depósito superior izquierdo del dispositivo. Las células fluyen hacia el dispositivo y se adhieren a la superficie tratada con PLL. Aquí puedes ver las células a medida que fluyen hacia abajo a través del canal principal, y comenzarás a ver algunas de ellas realmente unidas al vidrio.

Después de la carga, los dispositivos que contienen las células se vuelven a colocar en una incubadora durante aproximadamente 10 minutos para permitir que las células se adhieran. Después de 10 minutos en la incubadora, los dispositivos se llevan una vez más a la cabina de bioseguridad, y los depósitos se llenan con medios y los dispositivos se vuelven a colocar en la incubadora. Algunas cosas importantes a tener en cuenta, dependiendo de la incubadora y el nivel de humedad que necesite el medio, es posible que deban cambiarse en los dispositivos cada dos o tres días.

Es una buena práctica colocar medios frescos en los pozos superiores y permitir que algunos medios frescos fluyan a través del dispositivo y hacia los canales principales antes de llenar todos los depósitos. Las neuronas se visualizan aquí con calcio, un tinte permeable celular que tiñe las células vivas. Aquí puede ver el compartimento so o el lado de la célula del dispositivo que contiene los cuerpos celulares, los axones y las dendritas.

A medida que nos desplazamos por el dispositivo, puede ver los microrancos a través de los cuales crecen los axones para llegar al otro lado del dispositivo, el lado del axón, que contiene una fracción axonal pura. Con fines de demostración. Estas células marcadas con fluorescencia se utilizarán para ilustrar el procedimiento de otomía con hacha.

Una de las propiedades del dispositivo neuronal es que permite al investigador realizar una exotomía, es decir, cortar los axones de la fracción axonal pura del dispositivo. Con el fin de realizar investigaciones como el estudio de la regeneración axonal. Keano ahora demostrará la realización de la exotomía en el dispositivo neuronal, la exotomía se realiza mediante un vacío.

Se coloca una pipeta de vidrio estéril en la abertura inferior del pocillo en el lado axonal, el medio se aspira por vacío. Todos los medios se eliminan por completo del lado axonal del dispositivo, incluidos los medios del canal principal. Para repetir el proceso después de retirar el medio, se fuerzan 150 microlitros de medio en el canal principal colocando la punta de la pipeta en la abertura del canal principal y presionando la pipeta con fuerza.

A continuación, se aplica el vacío a la abertura del canal principal y al pocillo superior del lado axonal del dispositivo. Una vez más, el vacío se utiliza para eliminar todos los medios del lado axonal, incluido el canal principal. Una vez más, se fuerzan 150 microlitros de medio en el canal principal colocando la punta de la pipeta en la abertura del canal principal y presionando la pipeta con fuerza.

En este punto, el investigador puede ver el dispositivo bajo un microscopio para verificar la eficiencia del corte del axón. Si los axones no están lo suficientemente cortados, el proceso puede repetirse de nuevo según sea necesario. En este vídeo, le hemos mostrado cómo preparar las neuronas corticales de rack fetal E 18 y cargarlas en el dispositivo neuronal.

La principal ventaja de estos dispositivos es la capacidad de separar y compartimentar el cultivo de los cuerpos de las células neuronales en un lado del dispositivo de una fracción axonal pura en el otro lado del dispositivo. Esperamos que este video le haya resultado informativo y útil. Así que eso es todo del John Lab.

Gracias por mirar.