Microscopía TIRF para visualizar la dinámica de acoplamiento de actina y microtúbulos

Los monómeros de actina se polimerizan de la cabeza a la cola para formar fibras delgadas, llamadas microfilamentos. De manera similar, los dímeros de tubulina se polimerizan en microtúbulos cilíndricos huecos más largos. Estos componentes del citoesqueleto mantienen la forma celular y facilitan la motilidad celular.

Para visualizar la dinámica de acoplamiento actina-microtúbulos mediante microscopía de reflexión interna total, TIRF, tome un conjunto de imágenes personalizado.

El conjunto de imágenes consta de dos cubreobjetos: un cubreobjetos superior recubierto de silano m-PEG y un cubreobjetos inferior recubierto de biotina-PEG recubierto de silano. Los dos cubreobjetos se espacian longitudinalmente con cinta adhesiva de doble cara y se sellan en ambos extremos para crear un canal de flujo.

Pipetee BSA en el canal de flujo para cebar la cámara. Agregue la solución de estreptavidina e incube. Las moléculas de estreptavidina se unen a las moléculas de biotina unidas al PEG-silano del cubreobjetos inferior.

Fluya el búfer TIRF hacia el canal. Agregue una solución de mezcla de citoesqueleto que contenga dímeros de tubulina marcados con fluoróforo verde y sin marcar, junto con monómeros de actina sin marcar, marcados con biotina y marcados con fluoróforo púrpura.

A continuación, agregue una solución de reacción que contenga ATP, agente promotor de la polimerización de actina, y GTP, agente promotor de la polimerización de tubulina y proteína de acoplamiento actina-microtúbulo. Incubar.

Los dímeros de tubulina se unen a las moléculas de GTP y polimerizan, mientras que los monómeros de actina se unen a las moléculas de ATP y polimerizan para formar microtúbulos y microfilamentos, respectivamente.

Coloque el conjunto de imágenes bajo un microscopio TIRF. Excite los fluoróforos con láseres de longitudes de onda apropiadas.

La luz de excitación se refleja internamente y crea un campo de luz que ilumina selectivamente los fluoróforos en una región limitada cerca de la interfaz vidrio-agua, donde hay dos medios con diferentes índices de refracción. En esta región, los microfilamentos aparecen de color púrpura y los microtúbulos de color verde.

Corte 12 tiras de cinta adhesiva de doble dorso y doble cara, a una longitud de 24 milímetros. Retire un lado del respaldo de la cinta y fije los trozos de cinta adyacentes a las seis ranuras presentes en una cámara de imagen limpia. Retire la segunda pieza de respaldo de la cinta, para exponer el lado adhesivo de la cinta a lo largo de cada ranura de la cámara, y coloque la cámara, con la cinta hacia arriba, sobre una superficie limpia.

Mezcle resina epoxi y soluciones endurecedoras, una a una en un pequeño bote de pesaje, y use una punta P1000 para colocar una gota de epoxi mezclado entre las tiras de cinta al final de cada ranura de la cámara de imágenes. Luego, coloque la cinta de la cámara, o con el lado epoxi hacia arriba, sobre una superficie limpia.

Retire un cubreobjetos recubierto de la incubadora a 70 grados Celsius y enjuague las superficies recubiertas y no recubiertas de los cubreobjetos con agua doble destilada seis veces. Seque con gas nitrógeno filtrado y luego fíjelo a la cámara de imágenes, con el lado del recubrimiento de cubreobjetos hacia la cinta.

Utilice una punta de pipeta P200 o P1000 para aplicar presión sobre la interfaz cinta-vidrio, para garantizar un buen sellado entre la cinta y el cubreobjetos. Incube las cámaras ensambladas a temperatura ambiente durante al menos cinco a 10 minutos, para permitir que el epoxi selle completamente las paredes de la cámara antes de su uso.

Las cámaras de perfusión caducan dentro de las 12 a 18 horas posteriores al montaje. Utilice una bomba de perfusión e intercambie secuencialmente soluciones de acondicionamiento en la cámara de perfusión haciendo fluir 50 microlitros de BSA al 1% para cebar la cámara de imágenes.

Retire el exceso de amortiguador del depósito del accesorio Luer-lock. Luego, fluya 50 microlitros de 0.005 miligramos por mililitro de estreptavidina e incube durante uno o dos minutos a temperatura ambiente. Retire el exceso de tampón del depósito.

Fluya 50 microlitros de BSA al 1% para bloquear la unión inespecífica e incube durante 10 a 30 segundos. Retire el exceso de tampón del depósito. A continuación, fluya 50 microlitros de 1x tampón TIRF tibio, y luego 50 microlitros de semillas de microtúbulos estabilizadas y 50% biotiniladas, diluidas en 1x tampón TIRF.

Configure el dispositivo calentador de escenario u objetivo para mantener una temperatura de 35 a 37 grados Celsius durante 30 minutos, antes de obtener imágenes de la primera reacción bioquímica. Luego, establezca el intervalo de adquisición en cada cinco segundos, durante 15 a 20 minutos. A continuación, establezca las exposiciones de láser 488 y 647 en 50 a 100 milisegundos a una potencia del 5% al 10%, ajustando primero la reacción de polimerización para iniciar el ensamblaje del filamento de actina.

Adquiera las imágenes a 647 nanómetros y realice los ajustes apropiados. Luego, ajuste la reacción de polimerización en un segundo pozo de perfusión acondicionado, para iniciar el ensamblaje de microtúbulos. Visualice a 488 nanómetros y realice los ajustes apropiados.

Combine tres microlitros de 488-tubulina 10-micromolar con la alícuota de 7,2 microlitros de tubulina 100 micromolares sin marcar fluorescentemente, no más de 15 minutos antes de su uso. Luego, combine tres microlitros de actina biotinilada diluida en volúmenes apropiados de actina marcada y sin marcar fluorescentemente, de modo que la mezcla final sea de 12,5 micromolares de actina total, con una etiqueta fluorescente del 10% al 30%.

Prepare la mezcla del citoesqueleto combinando dos microlitros del caldo de mezcla de actina de 12,5 micromolares con la mezcla de caldo de tubulina, no más de 15 minutos antes de la obtención de imágenes. Almacenar en hielo hasta su uso.

Prepare la mezcla de reacción de proteínas combinando todos los demás componentes y proteínas experimentales, incluidos 2x tampón TIRF, antiblanqueador, nucleótidos, tampones y proteínas accesorias. Incube la mezcla de citoesqueleto en la mezcla de reacción de proteínas por separado, a 37 grados Celsius durante 30 a 60 segundos.

Para iniciar la reacción, agregue el contenido de la mezcla de reacción de proteínas a la mezcla del citoesqueleto y mézclela. Fluir 50 microlitros de la mezcla de reacción que contiene 1x tampón TIRF suplementado con 15 tubulina libre micromolar, un GTP milimolar, 0,5 monómeros de actina micromolar y volúmenes apropiados de controles de tampón a la cámara de perfusión.

Grabe una película de lapso de tiempo con el software del microscopio, para adquirirla cada cinco segundos, durante 15 a 20 minutos. Acondicione un nuevo pozo de perfusión y reemplace el volumen del tampón con la proteína reguladora de interés y los controles del tampón. Adquirir para evaluar las proteínas reguladoras de las funciones emergentes de los microtúbulos de actina.