La visualización de la corteza organización y dinámica de los microorganismos, con total Microscopía de fluorescencia de reflexión interna

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de alta calidad, de reflexión interna total, fluorescencia o césped de microorganismos portadores de pared celular. Esto se logra preparando primero las hojas de cobertura y las celdas. El segundo paso es alinear con precisión la configuración del microscopio para obtener una calidad de imagen óptima.

A continuación, se eligen los incidentes, ángulos y condiciones de imagen correctos para la adquisición de imágenes o películas. El paso final es el procesamiento posterior a la imagen de las imágenes adquiridas. En última instancia, la microscopía de césped se utiliza para estudiar la dinámica de la localización de proteínas en la corteza celular.

La principal ventaja de esta técnica frente a metales superados como los convencionales o confocales para microscopía, es que el contraste de imagen en microscopía es muy alto, lo que permite tiempos rápidos y poca luz. Como tal, este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación de membranas, como los mecanismos de segregación lateral de proteínas o la movilidad de las proteínas de membrana. Los cubreobjetos para microscopía de césped deben limpiarse de partículas de polvo antes de su uso.

Dado que el césped es sensible a las señales de fondo que surgen del polvo en un cubreobjetos sucios. Se requiere un cubreobjetos limpio con menos fondo para comenzar el procedimiento de limpieza de cubreobjetos. Use pinzas para colocar los cubreobjetos en un soporte de cerámica con tapa.

A continuación, llene un recipiente de vidrio con un molar de hidróxido de sodio. Este hidróxido de sodio se puede reutilizar varias veces. Coloque el soporte cerámico que contiene los cubreobjetos en el hidróxido de sodio e incube los cubreobjetos durante dos horas bajo una rotación lenta y continua.

No incube durante más de ocho horas, ya que esto creará cubreobjetos opacos después de dos horas, lave los cubreobjetos con agua destilada dos veces durante cinco minutos cada vez bajo una rotación lenta y continua, guarde los cubreobjetos limpios en el soporte cerámico cubierto con etanol al 100%. Para preparar las células más sutiles del bacilo para la microscopía del césped, diluya a un OD 600 de 0,01 a 0,05 en cinco mililitros de medio de crecimiento apropiado y crezca hasta la fase exponencial. Prepare 1.25%aros en medio sintético, disuelva el polvo de aros en un tubo de plástico de 1.5 mililitros a 95 grados Celsius y luego almacene en un bloque calefactor a 72 grados Celsius.

Agregue una pequeña gota de aros en el centro de un portaobjetos y con un segundo tobogán, presione los aros en una almohadilla plana después de al menos dos minutos, separe cuidadosamente los portaobjetos. Haga girar 500 microlitros de células sutiles de bacilo en una microcentrífuga a 12.000 RPM durante un minuto. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en medio de 50 microlitros.

Agregue de dos a cuatro microlitros de células al centro de la almohadilla aros. A continuación, utilice unas pinzas para retirar un cubreobjetos limpio del recipiente lleno de etanol y séquelo con aire a presión. Coloque con cuidado el cubreobjetos sobre la muestra.

Deje que las células se asienten durante al menos dos minutos antes de la microscopía. Para obtener imágenes a largo plazo, selle los bordes del cubreobjetos con la mezcla calentada de vaselina, lanolina y parafina o Val app. Para preparar las células de Saccharomyces visi para la microscopía de césped, diluir un precultivo y cultivar en medios apropiados durante al menos cinco horas.

A la fase exponencial, tome un cubreobjetos del recipiente lleno de etanol y séquelo con aire a presión con una pipeta. Cinco microlitros, conval y a o con una solución en la cubierta. Deslice y seque con aire acondicionado presurizado A se une a los carbohidratos de la pared celular de la levadura e inmoviliza las células de levadura.

A continuación, transfiera 4,5 microlitros de una suspensión de células de levadura a un lado de la con, un cubreobjetos recubierto. Coloque con cuidado el cubreobjetos con la muestra hacia abajo en un portaobjetos de microscopio, comenzando con un borde y dejando caer lentamente. Esto evitará la formación de burbujas de aire.

Deje que las células se asienten durante al menos dos minutos antes de que la microscopía selle los bordes del cubreobjetos con la aplicación val para obtener imágenes a largo plazo. Todos los experimentos que se muestran en este vídeo se realizan en una configuración de césped personalizada basada en un soporte IMEX totalmente automatizado con un objetivo Olympus 100 x 1,45 NA. Las fuentes de luz utilizadas son láseres de diodo de 75 milivatios, de estado sólido bombeado o DPSS de 488 nanómetros y 561 nanómetros.

Ángulos de césped y fluorescencia. La recuperación después del fotoblanqueo o la posición de la fraternidad se puede ajustar instantáneamente a través de dos galvanómetros. Un tercer galvanómetro se utiliza para cambiar entre epi, fluorescencia, frap y césped.

Los galvanómetros, que se controlan directamente desde el software de adquisición en vivo, permiten una medición sencilla de la cinética de localización de los objetos trazados en el césped. Las imágenes se recogen con una cámara EM CCD y una lente de dos aumentos delante de la cámara. La adquisición también está controlada por el software de adquisición en vivo. Antes de trabajar con el láser, póngase las gafas de seguridad para láser, proyecte el láser en el techo en modo césped y calibre la posición de cero grados de modo que el láser esté en línea recta.

Con el objetivo, enfocar el punto láser a un tamaño mínimo después de un ajuste óptimo, el perfil del láser debe formar un punto bien definido con una forma aproximadamente redonda. Realice la calibración antes de cada sesión. Para obtener una calidad de imagen óptima, la alineación del microscopio de césped es fundamental para el éxito de este procedimiento.

La incidencia, los ángulos y los parámetros correctos para la adquisición de imágenes deben ajustarse cuidadosamente para obtener una calidad de imagen óptima. Para comenzar la adquisición de imágenes, identifique la posición de las celdas mediante la iluminación de campo claro. Los LED rojos son particularmente buenos, ya que no inducen daños significativos en las fotos.

Cambie a la iluminación láser y seleccione las combinaciones adecuadas de láseres y filtros para excitar los fluoróforos de su elección, asegúrese de que el ángulo del césped sea subcrítico. De lo contrario, no se detectarán las señales que surjan de las proteínas de fusión GFP. Encuentra la sección superior de la celda, que es el lado de la celda que mira hacia el cubreobjetos.

Aumente gradualmente el ángulo de incidencia del rayo láser hasta que desaparezcan las señales y, a continuación, disminuya lentamente el ángulo hasta el punto en que reaparece la fluorescencia en la superficie de la célula. Vuelva a ajustar el enfoque Z para obtener una posición óptima en la superficie. Los ángulos aceptables del césped no crean un halo borroso en el borde de la célula, como se ilustra en este ejemplo de proteína de levadura.

PMA un GFP con ángulos de incidencia decrecientes desde la parte superior izquierda hasta la parte inferior derecha. Las imágenes muestran una pérdida repentina de señal en el ángulo crítico y una disminución progresiva de la información estructural y la relación señal-ruido, ajusta las intensidades del láser y la ganancia de la cámara para maximizar el rango dinámico. Por lo general, las cámaras E-M-C-C-D son óptimas para detectar señales muy bajas con una relación señal/ruido alta.

La microscopía de césped es muy sensible a la pequeña altura. Las diferencias del cubreobjetos dan como resultado solo unas pocas celdas que se pueden visualizar al mismo tiempo. Esta imagen de una densa suspensión de perlas fluorescentes es un ejemplo de un campo de visión desigual en el que solo una parte del campo de visión está enfocada.

Por lo tanto, para células pequeñas, la región de adquisición a menudo se puede reducir a una subregión que contiene el objeto de elección. Para los experimentos de césped de doble color, el sangrado de fluoróforos debe minimizarse para los pares R-F-P-G-F-P. Utilice filtros de emisión separados, ya que la RFP es excitada semanalmente por una luz de 488 nanómetros.

Aquí se muestra un flujo de trabajo típico para evitar el sangrado y las imágenes de doble color. Después de obtener imágenes de las celdas con conjuntos de filtros separados, las imágenes se involucionan y alinean mediante perlas fluorescentes antes de fusionarse Para el análisis, un parámetro crítico que influye en la calidad de la imagen es la alineación láser y un objetivo limpio. Después de alinear el láser y enfocarse en la posición Z utilizada para la obtención de imágenes de césped, retire la muestra y limpie el objetivo de todo el aceite.

El aceite residual provocará la difracción de la luz láser y manchas en el perfil del haz. La microscopía de césped se puede utilizar para visualizar la distribución de los homólogos de actina y las enzimas de la pared celular en las células bacterianas. En este resultado representativo, se obtuvieron imágenes de células sutiles de bacilo que expresan fusiones de GFP de la actina hoog MBL o la transpeptidasa PBPH mediante césped y epifluorescencia regular.

Las imágenes aquí representan proyecciones promedio de una serie de tiempo para indicar el área cubierta por el móvil. Parches MBL monitorizados con diferentes modos de imagen. El contorno azul de la imagen superpuesta indica el límite de la celda visualizado a partir de una imagen de campo claro.

La transpeptidasa PBPH expresada semanalmente se localiza en parches corticales que apenas son visibles por epifluorescencia, pero que se pueden distinguir claramente por césped. La penetración reducida se puede observar mejor para la señal P-B-P-H-G-F-P en el SEPTA indicado por las flechas, que aparecen como líneas en la epifluorescencia, pero como puntos en el césped. El siguiente conjunto de imágenes muestra una comparación entre la epifluorescencia y la iluminación del césped del componente del complejo TOR, bit 61 en Saccharomyces visi.

Esta proteína se expresa semanalmente y forma pequeños parches corticales con solo unas pocas copias de proteína por parche. En la epifluorescencia, solo se ven unos pocos parches sobre el fondo fuerte, mientras que los parches se pueden obtener con una muy buena relación señal-ruido en el césped. Se puede obtener una mejora adicional del contraste de la imagen a través de varios pasos de procesamiento de imágenes, como la sustracción de imágenes gaussianas o medianas, mientras que la sustracción de fondo local elimina el ruido y agudiza las estructuras de alta intensidad.

Esto a menudo se produce a costa de una pérdida de estructuras finas y una amplificación exagerada de regiones de alta intensidad. Como lo indica la flecha, un procedimiento superior es la deconvolución 2D, que se puede realizar con paquetes de software gratuitos o disponibles comercialmente. El aumento del contraste después de la deconvolución se ilustra en esta película de lapso de tiempo de GFP RAs dos que muestra imágenes de césped en bruto e involucionadas alternas.

Dado que GFP RAs dos es una proteína de movimiento rápido, es importante resolver tiempos de adquisición rápidos. Su comportamiento dinámico. El procesamiento de imágenes es especialmente importante para los análisis de colocalización, como se ilustra en esta película de doble color de lapso de tiempo de proteínas de levadura, FET 3G FP y PMA one RFP.

Los primeros 10 fotogramas representan imágenes sin procesar y los fotogramas restantes son imágenes invertidas. Para que el análisis sea posible, es fundamental maximizar el contraste y mejorar la nitidez de las imágenes sin procesar borrosas. Turf y frap ofrecen una poderosa combinación para estudiar la dinámica de las proteínas corticales. El uso de esta técnica en las células B más sutiles que expresan G-F-P-M-B-L descartó la cinta rodante como el mecanismo de la motilidad observada de los parches que contienen MBL.

El gráfico chm de la mancha móvil y el perfil de intensidad a lo largo del gráfico chm indicado por la línea punteada se muestra de manera similar a la membrana plasmática de levadura. Un PMA de TPAs reveló los lentos reordenamientos de las proteínas de la membrana plasmática de la levadura, que se distribuyen en dominios similares a redes que cubren toda la superficie celular después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que las investigaciones en el campo de la biología celular de las bacterias exploraran el mecanismo de síntesis de la pared celular en BA subtilis.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo adquirir imágenes de césped de microorganismos como levaduras y bacterias, y cómo esta técnica puede ayudar a estudiar las propiedades dinámicas de las proteínas corticales.