La visualización de la corteza organización y dinámica de los microorganismos, con total Microscopía de fluorescencia de reflexión interna

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de alta calidad mediante fluorescencia, reflexión interna total o imágenes TURF de microorganismos que poseen pared celular. Esto se logra primero preparando las laminillas y las células. El segundo paso consiste en alinear con precisión el montaje del microscopio para obtener una calidad óptima de la imagen.

A continuación, se seleccionan los incidentes correctos, los ángulos y las condiciones de imagen para la adquisición de imágenes o videos. El paso final es el procesamiento posterior de las imágenes adquiridas. En última instancia, la microscopía TIRF se utiliza para estudiar la dinámica de la localización de proteínas en la corteza celular.

La principal ventaja de esta técnica frente a los metales excesivos como la microscopía convencional o confocal es que el contraste de la imagen en microscopía es muy alto, lo que permite tiempos rápidos y luz baja. Por tanto, este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación de membranas, como los mecanismos de segregación lateral de proteínas o la movilidad de las proteínas de membrana. Las laminillas para microscopía turf deben limpiarse de partículas de polvo antes de su uso.

Dado que el césped es sensible a las señales de fondo derivadas del polvo en una laminilla sucia, se requiere una laminilla limpia con menos fondo para comenzar el procedimiento de limpieza de laminillas. Utilice pinzas para colocar las laminillas en un portador de cerámica con tapa.

A continuación, llene un recipiente de vidrio con hidróxido de sodio uno molar. Este hidróxido de sodio puede reutilizarse varias veces. Coloque el soporte de cerámica que contiene las láminas de cubreobjetos en el hidróxido de sodio e incube las láminas durante dos horas con rotación lenta continua.

No incube durante más de ocho horas, ya que esto hará que las laminillas se vuelvan opacas después de dos horas; lave las laminillas con agua destilada dos veces, durante cinco minutos cada vez, bajo rotación lenta y continua, y almacene las laminillas limpias en el portador de cerámica cubierto con etanol al 100%. Para preparar células de bacillus subtilis para microscopía de césped, diluya hasta una DO 600 de 0.01 a 0.05 en cinco mililitros de medio de crecimiento adecuado y cultive hasta la fase exponencial. Prepare aros al 1,25% en medio sintético: disuelva el polvo de aros en un tubo plástico de 1,5 mililitros a 95 grados Celsius, y luego almacénelo en un bloque calefactor a 72 grados Celsius.

Agregue una pequeña gota de aros en el centro de un portaobjetos y, con un segundo portaobjetos, presione los aros para formar una capa plana; después de al menos dos minutos, separe cuidadosamente los portaobjetos. Centrifugue 500 microlitros de células de bacillus subtlest en una microcentrífuga a 12.000 RPM durante un minuto. Deseche el sobrenadante y re suspenda el sedimento en 50 microlitros de medio.

Agregue de dos a cuatro microlitros de células al centro del pad de aros. A continuación, use pinzas para retirar un cubreobjetos limpio del recipiente lleno de etanol y séquelo con aire comprimido. Coloque cuidadosamente el cubreobjetos sobre la muestra.

Deje que las células sedimenten durante al menos dos minutos antes de la microscopía. Para imágenes a largo plazo, selle los bordes del cubreobjetos con la mezcla calentada de vaselina, lanolina y parafina o con Val app. Para preparar células de Saccharomyces visi para microscopía turf, diluya un precultivo y crezca en medio adecuado durante al menos cinco horas.

Para la fase exponencial, tome una laminilla del recipiente lleno de etanol y séquela con aire presurizado utilizando un aplicador de pipeta. Aplique cinco microlitros de solución de conval o con A sobre la laminilla y seque con aire presurizado. Con A se une a los carbohidratos de la pared celular de levadura e inmoviliza las células de levadura.

A continuación, transfiera 4,5 microlitros de una suspensión de células de levadura a un lado del con, un cubreobjetos recubierto. Coloque cuidadosamente el cubreobjetos con la muestra hacia abajo sobre una portaobjetos, comenzando por un borde y dejando que las gotas caigan lentamente. Esto evitará la formación de burbujas de aire.

Deje que las células sedimenten durante al menos dos minutos antes de la microscopía; selle los bordes del cubreobjetos con cera para aplicaciones de imagenología a largo plazo. Todos los experimentos mostrados en este video se realizan en un sistema turf personalizado basado en un soporte IMEX completamente automatizado con un objetivo Olympus 100x 1.45 NA. Las fuentes de luz utilizadas son láseres de estado sólido bombeados por diodo, o láseres DPSS, de 75 milivatios a 488 nanómetros y 561 nanómetros.

Ángulos de TURF y fluorescencia. La recuperación tras el blanqueo fotónico o la posición FRAP puede ajustarse instantáneamente mediante dos galvanómetros. Un tercer galvanómetro se utiliza para cambiar entre epi, fluorescencia, FRAP y TURF.

Los galvanómetros, que se controlan directamente desde el software de adquisición en tiempo real, permiten la medición sencilla de la cinética de localización para objetos rastreados en imágenes de césped, las cuales se obtienen con una cámara EM CCD y una lente de dos x de aumento colocada delante de la cámara. La adquisición también es controlada por el software de adquisición en tiempo real. Antes de trabajar con el láser, póngase gafas de seguridad para láser, proyecte el láser sobre el techo en modo césped y calibre la posición de cero grados de manera que el láser quede alineado en línea recta.

Con el objetivo, enfoque el punto láser al tamaño mínimo tras un ajuste óptimo; el perfil del láser debe formar un punto bien definido con una forma aproximadamente redonda. Realice la calibración antes de cada sesión. Para obtener una calidad óptima de imagen, el alineado del microscopio TURF es fundamental para el éxito de este procedimiento.

La incidencia, los ángulos y los parámetros correctos para la adquisición de imágenes deben ajustarse cuidadosamente para obtener una calidad óptima de la imagen. Para comenzar la adquisición de imágenes, identifique la posición de las células utilizando iluminación de campo brillante. Los LED rojos son particularmente adecuados, ya que no inducen daño fotoeléctrico significativo.

Cambie a la iluminación láser y seleccione los láseres y combinaciones de filtros adecuados para excitar los fluoróforos de elección, asegurándose de que el ángulo de estera sea subcrítico. De lo contrario, las señales provenientes de las proteínas de fusión GFP no serán detectadas. Localice la sección superior de la célula, que es el lado de la célula que enfrenta la cubreobjetos.

Aumente gradualmente el ángulo de incidencia del haz láser hasta que las señales desaparezcan, y luego disminuya lentamente el ángulo hasta el punto en que reaparezca la fluorescencia en la superficie celular. Ajuste nuevamente el enfoque Z para obtener una posición óptima en la superficie. Los ángulos de incidencia aceptables no generan un halo borroso en el borde de la célula, como lo ilustra este ejemplo de la proteína de levadura.

PMA con uno GFP, imagenado con ángulos de incidencia decrecientes de arriba a la izquierda a abajo a la derecha. Las imágenes muestran una pérdida repentina de señal en el ángulo crítico y una disminución progresiva de la información estructural y de la relación señal-ruido; ajuste las intensidades del láser y la ganancia de la cámara para maximizar el rango dinámico. Típicamente, las cámaras E-M-C-C-D son óptimas para detectar señales muy bajas con altas relaciones señal-ruido.

La microscopía de barrido es muy sensible a pequeñas diferencias de altura. Las variaciones del cubreobjetos hacen que solo se puedan observar unas pocas células al mismo tiempo. Esta imagen de una suspensión densa de microesferas fluorescentes es un ejemplo de un campo de visión desigual en el que solo una parte del campo está enfocada.

Por lo tanto, para células pequeñas, la región de adquisición a menudo puede reducirse a una subregión que contenga el objeto de interés. En experimentos de césped de doble color, debe minimizarse la transmisión cruzada de fluoróforos para pares R-F-P-G-F-P. Utilice filtros de emisión separados, ya que la RFP es débilmente excitada por luz de 488 nanómetros.

Se muestra aquí un flujo de trabajo típico para evitar la fuga de señal y la obtención de imágenes con doble color. Después de adquirir las imágenes de las células con conjuntos separados de filtros, las imágenes se descomponen y alinean utilizando perlas fluorescentes antes de ser fusionadas. Para el análisis, un parámetro crítico que influye en la calidad de la imagen es la alineación del láser y la limpieza del objetivo. Tras alinear el láser y enfocar en la posición Z utilizada para la adquisición de imágenes, retire la muestra y limpie todo el aceite del objetivo.

El aceite residual provocará difracción de la luz láser y manchas en el perfil del haz. La microscopía turf puede utilizarse para visualizar la distribución de homólogos de actina y enzimas de la pared celular en células bacterianas. En este resultado representativo, células de Bacillus subtilis que expresan fusiones GFP del homólogo de actina Mbl o de la transpeptidasa PbpH fueron observadas mediante microscopía turf y fluorescencia epifluorescente convencional.

Las imágenes aquí presentadas representan proyecciones promedio de una serie temporal para indicar el área cubierta por los parches móviles de MBL. Se monitorearon con diferentes modos de imagen. El contorno azul en la imagen superpuesta indica el límite celular visualizado a partir de una imagen de campo brillante.

La transpeptidasa PBPH expresada semanalmente se localiza en parches corticales que apenas son visibles mediante fluorescencia epi, pero que pueden distinguirse claramente mediante iluminación turf. La penetración reducida puede observarse mejor en la señal P-B-P-H-G-F-P en la SEPTA indicada por las flechas, que aparece como líneas en fluorescencia epi, pero como puntos en turf. Este siguiente conjunto de imágenes muestra una comparación entre la fluorescencia epi y la iluminación turf del componente del complejo TOR, bit 61 en Saccharomyces visi.

Esta proteína se expresa débilmente y forma pequeños parches corticales con solo unas pocas copias de proteína por parche. En fluorescencia epi, solo unos pocos parches son visibles por encima del fondo intenso, mientras que en turf los parches pueden visualizarse con una relación señal-ruido muy buena. Una mejora adicional del contraste de la imagen puede obtenerse mediante diversos pasos de procesamiento de imágenes, tales como la sustracción de imágenes difuminadas por Gauss o medianas, mientras que la sustracción del fondo local elimina el ruido y realza las estructuras de alta intensidad.

Esto a menudo ocurre a costa de una pérdida de estructuras finas y una amplificación exagerada de las regiones de alta intensidad. Como indica la flecha, un procedimiento superior es la desconvolución 2D, que puede realizarse con paquetes de software gratuitos o comerciales. El aumento del contraste tras la desconvolución se ilustra mediante esta película cronológica de GFP RAs dos que muestra alternativamente imágenes brutas y desconvolutas del césped.

Dado que la proteína GFP RAs dos se desplaza rápidamente, son importantes los tiempos de adquisición breves para resolver su comportamiento dinámico. El procesamiento de imágenes es especialmente relevante para los análisis de colocalización, como se ilustra en esta película de doble color con intervalos de tiempo de las proteínas de levadura FET 3G FP y PMA uno RFP.

Los primeros 10 cuadros representan imágenes en bruto y los cuadros restantes son imágenes mejoradas. Para hacer posible el análisis, es fundamental maximizar el contraste y agudizar las imágenes en bruto borrosas. Turf y frap ofrecen una combinación potente para estudiar la dinámica de las proteínas corticales. El uso de esta técnica en células de B subtlest que expresan G-F-P-M-B-L descartó el treadmilling como el mecanismo responsable de la motilidad observada en los parches que contienen MBL.

El gráfico de chm del parche móvil y el perfil de intensidad a lo largo del gráfico de chm indicado por la línea punteada se muestran de manera similar al frap de césped de la membrana plasmática de levadura. Un PMA de TPAs reveló las lentas reorganizaciones de las proteínas de la membrana plasmática de levadura, que se distribuyen en dominios tipo red que cubren toda la superficie celular tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para investigaciones en el campo de la biología celular bacteriana para explorar el mecanismo de síntesis de la pared celular en BA subtilis.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo adquirir imágenes de tipo césped de microorganismos como levaduras y bacterias, y cómo esta técnica puede ayudar en el estudio de las propiedades dinámicas de las proteínas corticales.