Cortical de actina de flujo en células T cuantificados por espacio-temporal de correlación Imagen Espectroscopia de Estructurado Iluminación Microscopía de datos

El objetivo general de este experimento es cuantificar la dinámica de la actina cortical mediante espectroscopia de correlación de imágenes después de la adquisición por reflexión interna total, imágenes de iluminación estructurada o simulación de césped. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo biofísico, como qué papel tiene el flujo cortical de actina en la regulación de las interacciones en la sinapsis inmunológica. La principal ventaja de la técnica es que combina la resolución a escala nanométrica con la compatibilidad con el estilo de vida, lo que permite observar y analizar procesos a menor escala en comparación con las técnicas convencionales de microscopía de instancia.

El encargado de demostrar esta técnica será George Ashdown, un estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para una muestra de prueba, agregue cinco microlitros de una solución madre de microesferas fluorescentes de subdifracción de 100 nanómetros de diámetro a la superficie de un cubreobjetos nuevo sin recubrimiento. A continuación, extienda la solución de microesferas sobre el cubreobjetos con la punta de una pipeta y deje que se seque.

Agregue 200 microlitros de medio de montaje al deslizamiento de la cubierta de prueba para prepararse para que comiencen las imágenes, encienda la incubadora para el calentador de etapa del sistema SIM de césped y llene el depósito con agua destilada para cubrir completamente la base del elemento calefactor. Deja que el agua se equilibre a 37 grados centígrados. Conecte el collar calefactor a la lente del objetivo y ajústelo a 37 grados centígrados.

A continuación, fije el bloque de graduación compatible con turf 4 88 en la trayectoria de luz del microscopio para asegurarse de que se activa la trayectoria óptica correcta. Cambie el modo de canal en la cama láser a la posición única. Repita esta acción para el cable de fibra en la platina del microscopio.

Espere ver un error en la ventana del software si no se realizan estos pasos. Una vez configurado el modo, baje el objetivo al plano Z más bajo y coloque una gota de aceite sobre él. Coloque el cubreobjetos de la muestra de prueba con las microesferas fluorescentes en la platina del microscopio.

A continuación, seleccione el sistema de enfoque perfecto o la función PFS en el cuerpo del microscopio. Mueva el objetivo gradualmente hacia arriba a través del plano Z y deténgase cuando el botón PFS deje de parpadear, lo que indica que se ha alcanzado el plano focal en el software de control. Cambie a la vista en vivo para obtener imágenes de las microesferas en la pantalla.

Realice ajustes finos en el enfoque utilizando la rueda manipuladora de micro PFS. Observe una iluminación uniforme sin emisión fluorescente desenfocada por encima de la onda aromática de 75 nanómetros. Finalmente, confirme que la iluminación estructurada se logra observando un patrón de iluminación fluctuante de la muestra de microesferas fluorescentes para la estimulación de células T en las cámaras de un ocho.

Cubra bien el cubreobjetos con 200 microlitros de mezcla de anticuerpos anti CD 3 y anti CD 28 e incube el cubreobjetos durante dos horas a 37 grados centígrados. Después de lavar el cubreobjetos como se describe en el protocolo de texto, colóquelo en la platina del microscopio y luego busque el plano focal del césped. A continuación, pipetee suavemente 200 microlitros de células T transfectadas en uno de los pocillos del cubreobjetos.

Utilice la epifluorescencia para rastrear las células transfectadas con actina GFP a medida que aterrizan en el cubreobjetos. Una vez que las celdas se hayan asentado, cambie al modo en vivo usando el N SimPad y verifique que las celdas en el monitor estén enfocadas. Para registrar un curso de tiempo, abra la ventana de adquisición ND y seleccione la pestaña de tiempo.

A continuación, haga clic en añadir y establezca el intervalo en sin retraso. Establezca la duración en 10 minutos. Finalmente, comience a registrar los datos seleccionando Ejecutar ahora en la ventana de adquisición ND.

Para reconstruir las imágenes, primero abra el software de análisis que contiene el módulo de análisis correcto. Haga clic en aplicaciones y luego seleccione la ventana mostrar fin de sim. Establezca la iluminación, la modulación, el contraste y la supresión de ruido de alta resolución en uno y reconstruya el conjunto de datos SIM del césped para producir una imagen SIM completa desde la barra de estado de la imagen.

Confirme que el tamaño de píxel es de 30 nanómetros y, a continuación, exporte los datos como archivos TIF para el análisis de stick. Después de descargar y extraer el paquete de software sticks MATLAB, abra el script. A continuación, defina los parámetros de entrada como se describe en el protocolo de texto para el filtro de eliminación inmóvil.

En la línea 23, establezca el parámetro de filtrado en media móvil y en la línea 24, utilice 21 como parámetro de media móvil para generar un mapa vectorial. Establezca la subregión temporal en la línea 31 en el número máximo de fotogramas, en este caso 63. Luego, en la línea 32, establezca el desplazamiento temporal en uno en las líneas 33 a 35.

Introduzca los nombres de los archivos de salida, los títulos de los mapas vectoriales de salida y la ruta del directorio de salida. A continuación, defina el formato en el que se deben guardar las imágenes del mapa vectorial. En este caso, png.

En la ventana del editor de MATLAB, abra el script. Ejecute sticks de un canal y cargue la serie de imágenes ejecutando las líneas del uno al 23 del script. A continuación, ejecute las líneas 29 a 35 de los palos de un canal.

Para iniciar el análisis de stick, siga las indicaciones y seleccione un polígono para definir una región de interés o ROI si lo desea. Para mostrar los mapas vectoriales, recorra las líneas 38 a 52. A continuación, ejecute las líneas 53 a 72 para trazar el histograma de velocidad y magnitud que se muestra aquí es una célula T OT que expresa GFP etiquetada como actina F, de la que se obtuvieron imágenes con el protocolo turf sim.

Discutido en el texto cinco minutos después de que esta célula fue introducida en un cubreobjetos recubierto con anticuerpos anti CD 3 y anti CD 28 destinados a estimular la formación de sinapsis inmunológicas. Se tomó un curso temporal para que se pudiera visualizar el flujo molecular de la factina. El análisis posterior de estos datos utilizando este programa de palos permitió la cuantificación del flujo molecular de actina F como se muestra en este mapa vectorial correspondiente a la región encuadrada de la célula de la izquierda, que representa una porción de la periferia de la sinapsis.

La ampliación adicional de este mapa y la subregión de las células T aclara la direccionalidad y la velocidad del flujo de actina, que se pueden determinar a partir de la longitud del vector, así como del código de colores. Los datos de velocidad también se pueden trazar en un histograma, lo que permite un análisis estadístico. En conjunto, estos resultados muestran que en la sinapsis inmunológica la actina F fluye de manera simétrica desde la periferia hacia el centro celular. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo adquirir ts en datos y analizar la dinámica de actina cortical utilizando espectroscopia de correlación de imágenes.

Aunque este método se puede utilizar para obtener información sobre el flujo de actina durante la migración de las células T, también se puede utilizar en otros sistemas en los que se cree que el flujo molecular es importante, como la migración celular.