Name: Cortical de actina de flujo en células T cuantificados por espacio-temporal de correlación Imagen Espectroscopia de Estructurado Iluminación Microscopía de datos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprenda a cuantificar la dinámica del flujo de actina cortical en células T mediante espectroscopía de correlación espacio-temporal de imágenes. Este método combina resolución nanométrica con compatibilidad en células vivas para estudiar la sinapsis inmunológica.

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D.M.O. reconoce la beca n.º 337187 del Consejo Europeo de Investigación y la beca Marie-Curie de integración profesional n.º 334303. P.W.W. reconoce el programa Discovery Grant del Consejo de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá.

Nota: Etapas 1 y 2 tienen lugar antes del día de las imágenes; asegurar que todos los medios de comunicación y los suplementos a utilizar antes o el día de la proyección de imagen se equilibran. Equilibrado se consigue mediante el calentamiento de los medios de comunicación y los suplementos a 37 ° C en una incubadora con 5% de CO 2. Todas las etapas de trabajo de cultivo celular y cubreobjetos de chapado se llevan a cabo en condiciones estériles en una campana de flujo laminar. La transfección 1. celular <ol><li> Transfectar las células T para obtener imágenes 24 hr antes del experimento con un plásmido que codifica una fusión fluorescente construir para el etiquetado GFP F-actina y formación de imágenes. Nota: Las células deben dividirse las 24 horas antes de la transfección (48 horas antes de la proyección de imagen) para asegurar las células están en óptima salud y en su fase de crecimiento logarítmico. <ol><li> Colocar 5 ml de suplemento de RPMI (RPMI 1640 más del 10% de FBS y 1% Pen-Strep (opcional)) en un solo pocillo de una placa de 6 pocillos en la incubadora se equilibre. </li><li> Pellet 2 x 10 7 células T cultoured a 37 ° C 5% de CO 2 en el suplemento RPMI usando un tubo de centrífuga a 327 xg durante 5 min y lavar en un volumen igual de medio de electroporación pre-calentado. Nota: medio electroporación es un medio de suero reducido que contiene tampones y suplementos (ver consumibles). </li><li> Después de volver a la granulación a 327 xg durante 5 min, resuspender las células en 500 l de medios de electroporación y se añade lentamente a una cubeta, añadir 5 g de plásmido en dH 2 O de grado PCR para el etiquetado de F-actina. </li><li> Golpee suavemente la cubeta en el espacio de trabajo de la campana para asegurar la eliminación de las burbujas de aire en los medios de comunicación, que pueden causar la formación de arcos de la electricidad y para distribuir las células uniformemente dentro de los medios de comunicación. </li><li> Encienda el aparato de electroporación y el voltaje ajustado a 300 V y la capacitancia a 290 Ω. Muestra electroporar utilizando un decaimiento exponencial durante 20 ms. Nota: Optimización puede ser necesaria para las diferentes células y diferentes construcciones de plásmidos. </li><li> Una vez que el protocolo de transfección escompletos, almacenar células en hielo durante 1 min antes de continuar. </li><li> Transferir cuidadosamente las células de la cubeta a la placa de 6 pocillos que contiene 5 ml de suplemento de RPMI equilibrada desde el paso 1.1.1. </li><li> Se incuban las células O / N a 37 ° C + 5% de CO 2. </li></ol></li></ol> 2. Cubreobjetos Coat y Pre-caliente Suplemento Imaging <ol><li> Cubreobjetos capa con anticuerpos para inducir la estimulación de células T. <ol><li> Escudo cada cámara de un cubreobjetos 8 pocillos con 1 mg / ml αCD3 y αCD28 en 200 l de PBS. </li><li> Almacenar a 4 ° CO / N. Alternativamente, cubreobjetos capa 2 horas antes de la proyección de imagen y mantienen en una incubadora a 37 ° C para reducir la deriva durante el proceso de formación de imágenes, minimizando los cambios de temperatura en el cubreobjetos. </li></ol></li><li> Crear una muestra de prueba cubreobjetos con microesferas fluorescentes 0,1 micras sub-difracción. <ol><li> Vortex solución madre de los granos para evitar grumos. </li><li> En una nueva, cubreobjetos limpio de le mismo tipo que los utilizados en el paso 2.1.1, pipeta de 5 l de microesferas fluorescentes solución madre sobre la superficie (según las instrucciones del fabricante). </li><li> Corre solución de microesferas sobre el cubreobjetos con punta de la pipeta. </li><li> Deje que se seque, luego aplique 200 l medio de montaje tales como PBS. Nota: el medio de montaje debe coincidir con la utilizada para muestras de células de imágenes. </li></ol></li><li> Equilibrar HBSS (+ 20 mM HEPES, en adelante denominado &quot;suplemento HBSS &#39;) en un tubo de centrífuga colocando en una incubadora O comprobar la validez de frío / N a 37 ° C + 5% de CO 2. Nota: la adición de HEPES es para amortiguar CO 2, si se utiliza una cámara de incubación con CO 2 de entrada saltarse esta suplementación. </li></ol> 3. Microscopio Set-up <ol><li> Encienda la incubadora de etapa superior del microscopio y lugar suficiente agua destilada TIRF-SIM en el depósito del microscopio para cubrir la totalidad de la base del elemento de calefacción. Deje que el agua Equilibrate a 37 ° C. Añadir el collar de calentamiento a la lente objetivo, también se establece en 37 ° C. Nota: Debido a la sensibilidad de la puesta a punto, estos pasos se llevan a cabo la noche anterior para los componentes ópticos están a una temperatura estable antes de la imagen. </li><li> Coloque el TIRF 488 bloque de rejilla compatible en la trayectoria de la luz del microscopio y seguro en su lugar. <ol><li> Cambie el modo de canal y el cable de fibra a la posición &#39;Individual&#39; en el escenario cama láser y microscopio, respectivamente, para acoplarse a la trayectoria óptica correcta para el modo TIRF-SIM. Nota: Saltarse este paso dará lugar a un error (Figura 1 A) dentro de la ventana del software. </li></ol></li><li> Encienda todos los componentes del microscopio y la computadora y abrir el software de control de la adquisición. <ol><li> Abra el panel de OC, Ti Pad, N-SIM Pad y ND Adquisición ventanas (Figura 1B). En el &#39;Panel de OC&#39; seleccione la opción &#39;TIRF 488&#39; (Figura 2B, flecha amarilla). </li&gt; <li> En la ventana N-SIM Pad, seleccione el &#39;TIRF-SIM &quot;y ajustes&#39; Moving &#39;(Figura 2C, flechas amarillas). Seleccione el botón de configuración (Figura 1C, caja amarilla) y seleccione &#39;TIRF 488 (de 100x TIRF 488 nm)&#39; en el menú desplegable, de favoritos Aplicar &#39;y&#39; OK &#39;. </li><li> Establezca los ajustes de la cámara dentro de los &#39;ajustes&#39; DU897 a: Velocidad de cuadros 50 ms, modo de lectura, EM Ganancia 3 MHz a 14 bits, y EM Ganancia multiplicador 300 con una ganancia de conversión de 1 (Figura 1C, caja verde). Nota: Véase representativos Resultados para consideraciones de velocidad de cuadro. </li><li> Calibrar la iluminación del microscopio para TIRF-SIM seleccionando el objetivo 100x 1,49 NA CFI Apocromático TIRF, en la &#39;N-SIM Pad&#39; gire a la potencia del láser 488 nm a 10%. Nota: tamaño de píxel de las imágenes en bruto es 60 nm, con un campo de 512 x 512 pixel de vista. </li><li> Limpie la lente del objetivo utilizando tejido de lentes para eliminar el polvo y el aceite. </li></ol></li&gt; <li> Encuentra el plano focal TIRF-SIM. <ol><li> Comience con el objetivo de la posible plano z más bajo. Coloque una gota de aceite de la lente del objetivo y añadir la muestra de microesferas fluorescentes desde el paso 2.2 de la platina del microscopio. </li><li> Seleccione la función Perfect Sistema de enfoque (PFS), ubicado en el cuerpo del microscopio. </li><li> Mueva lentamente el objetivo a través del plano z hasta que el botón PFS deja de parpadear para confirmar el plano focal se ha alcanzado. </li><li> Cambie a la vista &#39;en vivo&#39; en el software de control y la imagen de las microesferas para ajustes finales realizados mediante el uso de la rueda de micro-manipulador PFS. </li></ol></li><li> Observe la iluminación uniforme sin emisión de fluorescencia fuera de foco por encima de la onda evanescente 75 nm. Nota: Confirme iluminación estructurada se cumple mediante la observación de un patrón de iluminación fluctuante de la muestra de microesferas fluorescentes. </li><li> Mida la muestra de microesferas fluorescentes y cuantificar la resoluc de imagen mejoradaión observando la anchura a media altura (FWHM) del perfil de intensidad. <ol><li> Abra el software Analizar (v4.20.01), con el módulo de NIS-N-SIM Análisis instalada y seleccione &quot;Aplicaciones&quot; -&gt; &quot;ventana demostración N-SIM&quot;. </li><li> Con el contraste de modulación de iluminación (IMC) y supresión de ruido de alta resolución (HRNS) se establece en 1 para conjuntos de datos TIRF-SIM (Figura 2), reconstruir la imagen de la muestra de microesferas para generar una imagen reconstruida de 1.024 x 1.024 píxeles con un tamaño de píxel de 30 Nuevo Méjico. </li><li> Con la herramienta perfil de la línea con un ancho de 1 píxel (Figura 3A, caja amarilla), trazar una línea a través del centro de un solo microesfera. </li><li> Seleccione el botón FWHM (Figura 3B, caja amarilla) y haga clic en los máximos de intensidad de la distribución de Gauss, seguido por su minima intensidad. </li><li> Confirmar la FWHM de la microesfera está en el intervalo de 100 nm (Figura 3C). Nota: la resolución achCuando la imagen muestras biológicas ieved variarán dependiendo de la relación señal a ruido de la eficiencia del etiquetado y la fluorescencia de fondo. </li></ol></li></ol> 4. Preparación de muestras para Imaging <ol><li> Preparación Coverslip. <ol><li> Recuperar cubreobjetos recubiertos de αCD desde el paso 2.1 de la nevera o incubadora y eliminar PBS que contenía αCD3 y αCD28 de cada pocillo. </li><li> Añadir 200 l de HBSS suplemento pre-calentado desde el paso 2.3 a cada pocillo de la cubreobjetos. Lavar y quitar para asegurar una mínima αCD3 y αCD28 se deja en solución. Añadir otros 200 l de HBSS el suplemento a los pocillos de cubreobjetos. </li><li> Limpie la parte inferior del cubreobjetos con papel para lentes para eliminar el aceite y las partículas. </li></ol></li><li> Posición cubreobjetos sobre la platina del microscopio y encontrar el plano focal TIRF del cubreobjetos usando el plano z PFS como se encuentra en el paso 3.4. </li><li> Preparación de las células. <ol><li> Pipetear 200 l de la con los medios de comunicacióncontienen células transfectadas del paso 1.1.8 en un tubo de microcentrífuga. </li><li> Células de pellets en un micro-centrifugar a 268 xg durante 20 segundos y retirar medios celulares. </li><li> Resuspender las células en 200 l precalentado suplemento HBSS desde el paso 2.3. </li></ol></li></ol> 5. Las células Imaging <ol><li> Tome suplemento de HBSS que contiene células al microscopio y la pipeta suavemente 200 l en uno de los pozos. </li><li> Si bien se mantiene en el plano focal TIRF en el cubreobjetos (en el modo SLP), utilice el ocular microscopios de epifluorescencia y la iluminación para rastrear células fluorescentes se aproximan a la cubreobjetos. </li><li> Una vez que las células de la tierra en el cubreobjetos, cambie al modo &#39;Live&#39; en la N-SIM cojín para que la imagen en el monitor y compruebe las células están en el foco en la pantalla del ordenador. </li><li> Para registrar los tiempos de los cursos, abra la ventana ND Adquisición y seleccione la pestaña &#39;Time&#39;, haga clic en &quot;Añadir&quot; y establecer &#39;Intervalo&#39; en Sin demora, &#39;Duración&#39;a 10 minutos, &#39;Loops&#39; se establece en 1. Nota: La duración puede ser cambiado dependiendo del proceso de interés; el software STICS puede extraer resultados cuantitativos con pilas de imágenes de ≈10 marcos cuando fue capturado con &#39;No Delay&#39;. </li><li> Con los ajustes de adquisición idénticos a la muestra de cuentas, iniciar la grabación de datos seleccionando &quot;Ejecutar ahora&quot; en la ventana ND Adquisición. </li></ol> 6. Imágenes Reconstructora SIM <ol><li> Después de imágenes, abra el software Analizar (v4.20.01), con el módulo de NIS-N-SIM Análisis instalada y seleccione &quot;Aplicaciones&quot; -&gt; &quot;ventana demostración N-SIM&quot;. </li><li> Con el contraste de modulación de iluminación (IMC) y la supresión de ruido de alta resolución (HRNS) establece en 1 para los conjuntos de datos TIRF-SIM (Figura 2), la reconstrucción de una (o múltiple con la función por lotes) Archivo SIM prima para producir una imagen SIM reconstruida. </li><li> Confirmar el archivo reconstruida tiene un tamaño de píxel de 30 nm, se indica en elbarra de estado de la imagen. Nota: Tamaño de píxel no afecta análisis STICS pero debe ser al menos 2x menor dimensión que la resolución espacial PSF con el fin de garantizar la correlación espacial entre los píxeles. </li><li> Exportar los datos como archivos .tiff, listos para el análisis STICS. </li></ol> Análisis 7. STICS <ol><li> Descargue y extraiga el STIC (C) S paquete de software Matlab (laboratorio de Wiseman, disponible como información complementaria). El stics_vectormapping.m guión es el núcleo de un solo análisis STICS canal y las primeras 30 líneas de código se utilizan para definir los parámetros de entrada como se define en la sección 2.1 del manual. Abrir este script y definir los parámetros de entrada para el análisis de datos TIRF-SIM. Se sugiere añadir también la carpeta S STIC (C) con subcarpetas a la máquina ruta local Matlab, como se detalla en el apéndice del manual. <ol><li> Definir los parámetros de entrada para el análisis de datos mediante la edición de las líneas correspondientes del código </li><li> Para llevar a cabo analisis de los datos TIRF-SIM para generar 1 de vectores mapa, establezca los parámetros temporales a subregión temporal en la línea 31 hasta el número máximo de fotogramas y el cambio temporal en la línea de 32 a 1. Para obtener una serie temporal de mapas vectoriales variar estos parámetros . </li><li> Para el filtro de eliminación inmóvil, establezca el parámetro &#39;filtrado&#39; (línea 23) a &#39;Promedio móvil&#39; y establecer el parámetro &#39;MoveAverage&#39; (línea 24) a 21. Nota: Este ajuste se ha demostrado que funciona más lento señales de fluorescencia grandes en movimiento y, ya que se basa en la sustracción de marcos de serie de la estructura que se está analizando. </li><li> Cambio líneas 33-38 para establecer el nombre de los archivos de salida y los títulos de los mapas vectoriales de salida, así como la ruta del directorio de salida y definir en qué formato el mapa vectoriales imágenes se deben guardar. </li></ol></li></ol><table><tbody><tr><td> Tamaño de píxel (micras) </td><td> 0,03 micras </td><td> Línea 19 </td></tr><tr><td> Velocidad de cuadro (s) </td><td> 1 segundo </td><td> Línea 20 </td></tr><tr><td> El tiempo máximo de retardo (frames) </td><td> 20 cuadros </td><td> Línea 21 </td></tr><tr><td> Tamaño Subregión (píxeles) </td><td> 8 píxeles </td><td> Línea 29 </td></tr><tr><td> Espaciamiento Subregión (píxeles) </td><td> 1 pixel </td><td> Línea 30 </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Abra los run1ChannelSTICS secuencia de comandos en la ventana Matlab Editor. Cargue la serie de imágenes mediante la ejecución de las líneas 1-23 de este script. Nota: Este script se puede utilizar para cargar y pre-proceso de series de imágenes, trazar los mapas vectoriales e histogramas de velocidad y ejecutar un proceso por lotes para muchos archivos. Si es necesario, recortar la imagen de una región de interés mediante el uso de la línea 24-26 de este script. <ol><li> Ejecutar líneas 29-35 de run1ChannelSTICS para iniciar el análisis STICS. Cuando se le solicite, seleccione un polígono para indicar una región específica de interés (ROI), si se desea. Asegúrese de que la ROI no se solapa con el borde de la celda, como se producen artefactos de límite cuando STICS analiza estas reregiones. </li><li> Ejecutar líneas 38-52 para mostrar los mapas de vectores. Para trazar el histograma magnitud de la velocidad, correr las líneas 53-72. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Esta técnica permitirá a los investigadores a imagen y cuantificar previamente detalles irresolubles en células que expresan la fluorescencia. En nuestros resultados nos muestran que la F-actina fluye en una forma simétrica de la periferia de la célula hacia el centro de la celda en la célula T es. Estos resultados son consistentes con los resultados anteriores de la línea 1D datos de perfil quimógrafo 13 y se extienden la capacidad de análisis de datos 2D y super-resolución. La t...

El objetivo del experimento es a la imagen y caracterizar el flujo molecular de filamentous- (F-) de actina en las células T de estar, más allá del límite de difracción con el fin de establecer la dirección del flujo y la magnitud durante la sinapsis inmunológica (IS) formación. Esta técnica se llevará a cabo usando un microscopio de iluminación estructurada (SIM) en el modo de fluorescencia total reflexión interna (TIRF), la formación de imágenes de células T Jurkat que forman una sinapsis artificial sobre la activación cubreobjetos recubiertos con anticuerpos anti-CD28 anti-CD3 y. Las formas se encuentra entre una célula T y su objetivo; una célula presentadora de antígeno (APC) al receptor de células T (TCR) 1,2 activación. Como este es el primer paso para determinar si el sistema inmune adaptativo genera una respuesta inmune a una infección, las consecuencias de la capacidad de respuesta a los estímulos incorrecta puede causar una serie de enfermedades. La importancia de la interacción de células T-APC está bien documentada, sin embargo, el papel (s) del madura es después si inicial TCRinternalización gnal son todavía ser plenamente comprendido. Como se cree que el citoesqueleto para ayudar a dos procesos ligados a la activación de TCR (el movimiento de las moléculas en la membrana plasmática y el control de las moléculas de señalización dependientes de la actina del citoesqueleto 3,4), la comprensión de cómo el citoesqueleto reorganiza espacial y temporalmente se dilucidar los pasos de la reorganización molecular durante la formación de sinapsis. Se cree que el flujo retrógrado de F-actina de corral racimos de TCR hacia el centro de la sinapsis inmunológica, se cree que esta translocación a ser vital para dejar de señal y el reciclado; ayudar al delicado equilibrio de la activación de las células T 5. Mientras que la microscopía de fluorescencia estándar es una herramienta flexible que sigue ofreciendo una visión sobre muchos eventos biológicos, incluyendo interacciones célula-célula, está limitado por la capacidad del sistema para resolver con precisión múltiples fluoróforos que residen más cerca que el diffrlímite de acción (≈200 nm) uno del otro. Como muchos eventos moleculares dentro de las células involucran poblaciones densas de moléculas y exhiben reordenamiento dinámico, ya sea en reposo o con la estimulación específica, microscopía óptica convencional no proporciona una imagen completa. El uso de imágenes de súper resolución ha permitido a los investigadores para eludir el límite de difracción usando una variedad de técnicas. Microscopía sola molécula de localización (SMLM), tales como palma y 6,7 STORM tiene la capacidad de resolver la ubicación de las moléculas hasta una precisión de alrededor de 20 nm, sin embargo, estas técnicas se basan en largos tiempos de adquisición, la construcción de una imagen sobre muchos marcos . Generalmente esto requiere muestras sean fijos o estructuras para exhibir baja movilidad fluoróforos tan solo no están mal interpretado como múltiples puntos. Si bien el agotamiento de la emisión estimulada (STED) de imágenes permite super-resolución a través de muy selectivo de excitación confocal 8, el escaneo requeridoenfoque puede ser lento sobre los campos de células enteras de vista. STED también demuestra fototoxicidad significativa para resoluciones más altas debido al aumento de la potencia del haz de agotamiento. Microscopía de iluminación estructurada (SIM 9) ofrece una alternativa a estos métodos, capaces de duplicar la resolución de un microscopio de fluorescencia estándar y es más compatible con imágenes de células vivas que las técnicas actuales SMLM. Utiliza los poderes de láser más bajos, en un sistema de gran campo para los campos de células enteras de vista; proporcionando una mayor velocidad de adquisición, y es compatible con el etiquetado fluoróforo estándar. La naturaleza de campo amplio de SIM también permite la utilización de fluorescencia total reflexión interna (TIRF) para la excitación altamente selectivo, con profundidades de penetración en la dimensión axial de &lt;100 nm. Espectroscopia de correlación de imagen (ICS) es un método de correlación de las fluctuaciones en la intensidad de fluorescencia. Una evolución del ICS; Im espacio-temporaledad correlación de espectroscopia (STICS 10) correlaciona señales fluorescentes intracelulares en tiempo y espacio. Al correlacionar las intensidades de píxeles y la zona píxeles en marcos rezagados a través de una función de correlación, se obtiene información sobre las velocidades de flujo y direccionalidad. Para asegurar objetos estáticos no interfieren con el análisis STICS, un filtro de objetos inmóviles se implementa, que funciona restando una media móvil de las intensidades de los píxeles. La técnica que aquí se presenta se cree que es la primera demostración de la espectroscopia de correlación de imágenes que se aplica a los datos de microscopía de super-resolución para cuantificar el flujo molecular en células vivas 11. Este método mejora en las imágenes de difracción limitada del flujo de F-actina a través de análisis STICS 12 y se adaptaría a los investigadores que deseen determinar el flujo molecular bidimensional en células vivas, a partir de los datos adquiridos con resoluciones espaciales más allá del límite de difracción de la luz.

<table><tbody><tr><td>Consumibles:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jurkat E6.1 celdas</td><td>APCC</td><td>ATTC TIB-152</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Life Technologies</td><td>21875-091</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F7524-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Strepromicina&nbsp;</td><td>Tecnologías de la Vida</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>&nbsp; Life Technologies</td><td>14025-050</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>#1.5 cubreobjetos Labtek de 8 pocillos</td><td>NUNC, Labtek</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>LifeAct GFP construct</td><td>Ibidi</td><td>60101</td><td></td></tr><tr><td>OptiMem</td><td>Life Technologies</td><td>51985-042</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD3</td><td>Cambridge Bioscience</td><td>317315</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD28</td><td>BD Bioscience / Insight Biotechnology</td><td>555725</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>20012-019</td><td></td></tr><tr><td>Aceite</td><td></td><td></td><td></td> de lente</tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Comentarios</fuerte</td></tr><tr><td>><fuerte>Equipo:</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulsar Xcell System</td><td>BioRad</td><td>165-2660</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta (0,4 cm)</td><td>Centrífuga BioRad</td><td>165-2088</td><td></td></tr><tr><td>(5810R)</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5805 000.327</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga (Heraeus)</td><td>Biofuge pico 75003235</td><td></td><td></td></tr><tr><td>placa de 6 pocillos</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de etapa</td><td>Tokai Hit</td><td>INUH-TIZSH</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Nikon N-SIM</td><td>Nikon</td><td>Contactar empresa</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Nikon Software de análisis</td><td>Nikon</td><td>Empresa de contacto</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora ( 190D)</td><td>LEEC</td><td>Empresa</td><td></td> de contacto</tr></tbody></table>

cortical de actina de flujo en células t cuantificados por espacio-temporal de correlación imagen espectroscopia de estructurado iluminación microscopía de datos

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

-Actina filamentosa juega un papel crucial en la mayoría de los procesos celulares, incluyendo la motilidad y, en las células inmunes, la formación de una interacción célula-célula clave conocida como la sinapsis inmunológica. F-actina También se especula que desempeñan un papel en la regulación de las distribuciones moleculares en la membrana de las células incluyendo la dinámica de vesículas sub membranosa y la agrupación de proteínas. Si bien las técnicas de microscopía de luz estándar permiten observaciones generalizadas y difracción de limitarse a realizar, muchos eventos celulares y moleculares, incluyendo clustering y el flujo molecular se producen en las poblaciones en longitud escalas muy por debajo de la capacidad de resolución del microscopio óptico estándar. Mediante la combinación de fluorescencia total reflexión interna con el súper resolución de imagen método estructurado iluminación microscopía, se registró el flujo molecular bidimensional de F-actina en la sinapsis inmunitaria de las células T. Espacio-temporal espectroscopia de correlación de imágenes (STICS) y luego se aplicó, que genera resul cuantificablets en forma de histogramas de velocidad y mapas vector que representa la direccionalidad del flujo y la magnitud. Este protocolo describe la combinación de las técnicas de imagen y STICS super-resolución para generar vectores de flujo a nivel sub-difracción de detalle. Esta técnica se utilizó para confirmar un flujo de actina que es simétricamente retrógrada y centrípeta lo largo de la periferia de las células T en la formación de sinapsis.

Ajustes del microscopio Después de lograr con éxito todos los pasos del investigador tendrá iluminación estructurada logrado (SIM) de imágenes del flujo de F-actina en una sinapsis de las células T (Video 1), y se cuantifica este flujo molecular mediante espectroscopia de correlación de imágenes espacio-temporal (Figura 4 11). Antes de grabar las imágenes, asegúrese de la iluminación de la muestra e...

Para investigar las velocidades de flujo y la direccionalidad de la actina filamentosa en la sinapsis inmunológica de las células T, se combinan imágenes de superresolución de células vivas con fluorescencia de reflexión interna total y se cuantifican con espectroscopía de correlación de imágenes espacio-temporales.

Cortical de actina de flujo en células T cuantificados por espacio-temporal de correlación Imagen Espectroscopia de Estructurado Iluminación Microscopía de datos

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

El objetivo general de este experimento es cuantificar la dinámica del actina cortical mediante espectroscopía de correlación de imágenes tras la adquisición por reflexión interna total, iluminación estructurada o imagen turf sim. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo biofísico, como qué papel desempeña el flujo de actina cortical en la regulación de las interacciones en la sinapsis inmunológica. La principal ventaja de la técnica es que combina una resolución a escala de nanómetros con compatibilidad vital, lo que permite observar y analizar procesos a una escala menor en comparación con las técnicas convencionales de microscopía de instancias.Este procedimiento será demostrado por George Ashdown, un estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para una muestra de prueba, agregue cinco microlitros de una solución stock de microesferas fluorescentes subdifractivas de 100 nanómetros de diámetro a la superficie de un cubreobjetos fresco y sin recubrir. Luego, extienda la solución de microesferas sobre el cubreobjetos con la punta de una pipeta y deje secar.Añada 200 microlitros de medio de montaje a la cubierta de prueba para preparar la adquisición de imágenes; encienda el incubador para el calentador de la platina del sistema turf SIM y llene el depósito con agua destilada para cubrir completamente la base del elemento calefactor. Deje que el agua alcance el equilibrio a 37 grados Celsius. Conecte el collar calefactor al objetivo y ajústelo a 37 grados Celsius.Luego asegure el bloque graduado compatible con turf 4 88 en la trayectoria del haz del microscopio para garantizar que se active la trayectoria óptica correcta. Cambie el modo de canal en la cama láser a la posición única. Repita esta acción para el cable de fibra en la platina del microscopio.Se espera que aparezca un error en la ventana del software si no se realizan estos pasos. Después de establecer el modo, baje el objetivo al plano Z más bajo y coloque una gota de aceite sobre él. Coloque el cubreobjetos de la muestra de prueba con las microesferas fluorescentes sobre la platina del microscopio.Luego, seleccione el sistema de enfoque perfecto o la función PFS en el cuerpo del microscopio. Mueva gradualmente el objetivo hacia arriba a través del plano Z y deténgase cuando el botón PFS deje de parpadear, lo que indica que se ha alcanzado el plano focal en el software de control. Cambie a la vista en vivo para observar las microesferas en la pantalla.Realice ajustes finos del enfoque utilizando la rueda del micromanipulador PFS. Observe una iluminación uniforme sin emisión fluorescente desenfocada por encima de la onda de olor de 75 nanómetros. Finalmente, confirme que se ha logrado la iluminación estructurada observando un patrón de iluminación fluctuante en la muestra de microesferas fluorescentes para la estimulación de linfocitos T en las cámaras de un ocho.Cubra la laminilla con 200 microlitros de la mezcla de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 e incube la laminilla durante dos horas a 37 grados Celsius. Después de lavar la laminilla según se describe en el protocolo del texto, colóquela en la platina del microscopio y luego encuentre el plano focal del césped. A continuación, pipetee suavemente 200 microlitros de linfocitos T transfectados en uno de los pocillos de la laminilla.Utilice fluorescencia epi para rastrear las células transfectadas con actina GFP a medida que se adhieren al cubreobjetos. Una vez que las células se hayan asentado, cambie al modo en vivo utilizando el N SimPad y verifique que las células en el monitor estén enfocadas. Para registrar un curso temporal, abra la ventana de adquisición ND y seleccione la pestaña de tiempo.Luego, haga clic en agregar y configure el intervalo sin demora. Establezca la duración en 10 minutos. Finalmente, comience a registrar los datos seleccionando Ejecutar ahora en la ventana de adquisición de ND.Para reconstruir las imágenes, primero abra el software de análisis que contenga el módulo de análisis correcto. Haga clic en aplicaciones y luego seleccione la ventana mostrar sim final. Establezca el contraste de modulación de iluminación y la supresión de ruido de alta resolución en uno, y reconstruya el conjunto de datos SIM de césped para producir una imagen SIM completa desde la barra de estado de la imagen.Confirme que el tamaño del píxel sea de 30 nanómetros y luego exporte los datos como archivos TIF para el análisis de sticks. Después de descargar y extraer el paquete de software sticks para MATLAB, abra el script. A continuación, defina los parámetros de entrada según se indica en el protocolo escrito para el filtro de eliminación inmóvil.En la línea 23, configure el parámetro de filtrado como promedio móvil y en la línea 24, utilice 21 como parámetro del promedio móvil para generar un mapa vectorial. Establezca la subregión temporal en la línea 31 al número máximo de fotogramas, en este caso 63. Luego, en la línea 32, configure el desplazamiento temporal a uno en las líneas 33 a 35.Introduzca los nombres de los archivos de salida, los títulos de los mapas vectoriales de salida y la ruta del directorio de salida. Luego defina el formato en el que deben guardarse las imágenes del mapa vectorial. En este caso, png.En la ventana del editor de MATLAB, abra el script. Ejecute el programa de un canal y cargue la serie de imágenes ejecutando las líneas del 1 al 23 del script. A continuación, ejecute las líneas del 29 al 35 del programa de un canal.Para comenzar el análisis de los vectores, siga la indicación y seleccione un polígono para definir una región de interés o ROI, si así lo desea. Para mostrar los mapas vectoriales, ejecute las líneas 38 a 52. Luego, ejecute las líneas 53 a 72 para trazar el histograma de magnitud de velocidad que se muestra aquí, correspondiente a una célula T OT que expresa GFP marcado para F actina, la cual fue imagenada con el protocolo turf sim.Se analizó en el texto cinco minutos después de que esta célula se introdujera en un portaobjetos recubierto con anticuerpos anti CD tres y anti CD 28 destinados a estimular la formación de sinapsis inmunológicas. Se realizó un curso temporal para visualizar el flujo molecular de la actina F. El análisis posterior de estos datos mediante el programa sticks permitió cuantificar el flujo molecular de la actina F, como se muestra en este mapa de vectores correspondiente a la región delimitada por el cuadro en la célula de la izquierda, que representa una porción del periferia de la sinapsis.Un mayor aumento de este mapa y de la subregión de linfocitos T aclara la direccionalidad y la velocidad del flujo de actina, que puede determinarse a partir de la longitud del vector así como del código de colores. Los datos de velocidad también pueden representarse en un histograma, lo que permite un análisis estadístico. En conjunto, estos resultados muestran que en la sinapsis inmunológica, la actina F fluye de manera simétrica desde la periferia hacia el centro celular. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo adquirir datos ts y analizar la dinámica de la actina cortical mediante espectroscopía de correlación de imágenes.Aunque este método puede utilizarse para obtener información sobre el flujo de actina durante la migración de linfocitos T, también puede emplearse en otros sistemas donde se considere importante el flujo molecular, como en la migración celular.

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

La compartimentación de las proteínas, ya sea dentro de la membrana plasmática o en lugares intracelulares es un mecanismo de regulación que pueden influir mucho en los resultados de señalización, por lo que, para comprender la señalización es importante estudiar el comportamiento espacial y temporal de las proteínas implicadas. Se describe aquí un sistema de microscopía TIRF base para estudiar la transducción de señal en las células T, pero es ampliamente aplicable.

Una técnica de microscopía TIRF en tiempo real, imágenes simultáneas de la TCR y sus proteínas asociadas de señalización

Este video describe TIRF, una técnica basada en microscopía de reflexión interna total para visualizar la dinámica de polimerización de actina y microtúbulos. El método permite obtener imágenes de alta resolución de la dinámica de acoplamiento de actina y microtúbulos en tiempo real, lo cual es esencial para comprender las diafonías celulares.

Microscopía TIRF para visualizar la dinámica de acoplamiento de actina y microtúbulos

Se describe un método de imágenes de células vivas que da una idea de la dinámica de proteínas durante el proceso de activación de células T. Se demuestra el uso combinado de la T-célula ensayo de difusión, microscopía confocal y análisis de imágenes para producir resultados cuantitativos para seguir la formación de complejos de señalización a través de la activación de células T.

En tiempo real de imágenes en vivo de las células T de señalización Formación de complejos

La comunicación entre celulares es fundamental para el control de diversas actividades fisiológicas dentro y fuera de la célula. En este trabajo se describe un protocolo para la medición de la naturaleza espacio-temporal de las secreciones de células individuales. Para ello, se utiliza un enfoque multidisciplinario que integra nanoplasmonic etiqueta libre de detección con imágenes de células vivas.

Una técnica-Label libre para el Imaging espacio-temporal de las secreciones sola célula

La inmunidad adaptativa está controlada por 'sinapsis inmunológicas' dinámicas formadas entre las células T y las células presentadoras de antígenos. Este protocolo describe métodos para investigar las células endoteliales, tanto como APC fisiológicas poco estudiadas como un nuevo tipo de "modelo de APC celular plana".

Un modelo de la célula endotelial planar for Imaging inmunológica Synapse Dinámica

Este documento describe un método para medir alorreactividad en una población mixta de células T usando flujo de imágenes citometría.

La medición de células T Alorreactividad recurriendo a imágenes de Citometría de Flujo

Aquí, describimos un completo flujo de trabajo para el análisis cualitativo y cuantitativo de la sinapsis inmunes entre las células de T humanas primarias y células presentadoras de antígeno. El método se basa en imágenes por citometría de flujo, que permite la adquisición y evaluación de varias imágenes de miles de células en un período relativamente corto de tiempo.

Análisis cualitativo y cuantitativo de la sinapsis inmune en el sistema humano utilizando imágenes de citometría de flujo

Este protocolo describe un método basado en la proyección de imagen para activar los linfocitos T con photoactivatable péptido-MHC, que precisa control espacio-temporal de la activación de células T.

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Presentamos un protocolo para el uso de microscopia de STED simultáneamente las estructuras de actina imagen, microtúbulos y proteínas microtubule plus final en las células de B que se han diseminado en cubreobjetos recubierto con anticuerpos contra el receptor de células B, un modelo para la fase inicial de formación de la sinapsis inmune.

Visualización de la actina y los microtúbulos citoesqueletos en la sinapsis inmune de células B mediante microscopía de emisión (STED) el agotamiento

El objetivo de este protocolo es mostrar cómo utilizar la microscopía de hoja de luz de celosía para visualizar la dinámica de receptores de superficie en células vivas. Aquí se muestran los receptores de células T en CD4+ células T primarias.

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Este protocolo es una guía para visualizar actina dinámica y microtúbulos utilizando un ensayo de microscopía de fluorescencia interna total (TIRF) in vitro .

Visualización de la dinámica de acoplamiento de actina y microtúbulos in vitro mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)

Aprenda a cuantificar la dinámica del flujo de actina cortical en células T mediante espectroscopía de correlación espacio-temporal de imágenes. Este método combina resolución nanométrica con compatibilidad en células vivas para estudiar la sinapsis inmunológica.

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