Identificación de subconjuntos de células T reguladoras de ganglios linfáticos drenantes pancreáticos murinos

Las células T reguladoras, o Tregs, son una subpoblación especializada de células T que ejerce efectos inmunosupresores para mediar la homeostasis del sistema inmunitario. Las Tregs expresan los marcadores de superficie celular CD4, CD25 y Neuropilin 1, Nrp1 y los factores de transcripción nuclear forkhead box P3, Foxp3 y Helios.

Para aislar las Tregs de los ganglios linfáticos de drenaje pancreático de ratón, o PDLN, coloque una malla metálica sobre un tubo cónico. Coloque las PDLN en la malla y muela el tejido para disociarlo mecánicamente. Agregue un medio adecuado sobre la malla, enjuagando las células en el tubo.

Centrifugar, eliminando las células muertas y los restos celulares. Vuelva a suspender las células viables en el medio. Pasar las células a través de una tapa de filtro celular colocada en un tubo de fondo redondo para obtener una suspensión homogénea de una sola célula, eliminando cualquier grupo celular restante.

Agregue anticuerpos anti-CD4, anti-CD25 y anti-Nrp1 conjugados con fluorocromo. Los anticuerpos anti-CD4 y anti-CD25 se unen a sus respectivos antígenos de superficie celular en Tregs. Simultáneamente, el anti-Nrp1 se une a los receptores Nrp1.

Tratar las células con un tampón de fijación de permeabilización adecuado, fijando las células y permeabilizando las membranas celulares y nucleares. Agregue anticuerpos conjugados con fluorocromo dirigidos a Foxp3 y Helios.

Las membranas permeabilizadas permiten que los anticuerpos entren en las células y se unan a sus respectivos objetivos intranucleares. Analizar las células mediante citometría de flujo.

Las Tregs se caracterizan por la expresión positiva en la superficie celular de CD4, CD25 y Nrp1, junto con los factores de transcripción nuclear Foxp3 y Helios.

Primero, coloque un tubo cónico de 15 mililitros en una rejilla. Coloque una malla metálica estéril de 250 micrómetros sobre el tubo. Enjuague la malla con 1 mililitro de RPMI. Luego, transfiera los ganglios linfáticos a la malla metálica y use un par de pinzas para molerlos a través de la malla. Aplique 1 mililitro de RPMI en la malla para enjuagar las células en el tubo. Repita este proceso de transferir y moler los ganglios linfáticos tres veces para cada muestra y luego, retire la malla.

Centrifugar los tubos a 433 x g y a 4 grados centígrados durante 5 minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en aproximadamente 5 mililitros de RPMI, luego, llene los tubos con RPMI. Repita este proceso desde la centrifugación de las muestras hasta el llenado del tubo con RPMI una vez.

Centrifugar los tubos nuevamente a 433 x g y a 4 grados centígrados durante 5 minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento celular en 2 mililitros de RPMI. Transfiera 2 mililitros de la suspensión celular a tubos de fondo redondo de 5 mililitros con tapas de filtro celular.

Primero, centrifugar la suspensión celular de las muestras de PDLN a 433 x g y a 4 grados centígrados durante 5 minutos. Deseche el sobrenadante. Tiñe las células con anticuerpos de superficie, como se describe en el protocolo de texto, e incuba los tubos en hielo durante 40 minutos.

A continuación, agregue 200 microlitros de tampón FACS a cada tubo. Centrifugar a 433 x g y a 4 grados centígrados durante 5 minutos, y desechar el sobrenadante. Repita este proceso: agregue el tampón, centrifugue y deseche el sobrenadante una vez. Vuelva a suspender el sedimento celular en 500 microlitros de tampón de fijación de permeabilización para fijar y permeabilizar las células.

Transfiera los tubos a un refrigerador a 4 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, centrifugar la suspensión celular de las muestras de PDLN a 433 x g y a 4 grados centígrados durante 5 minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento celular en 500 microlitros de tampón de lavado de permeabilización. Centrifugar las células nuevamente a 433 x g y a 4 grados centígrados durante 5 minutos, y desechar el sobrenadante.

Tiña las células con anticuerpos intracelulares, como se describe en el protocolo de texto. Incube los tubos en hielo durante 1 hora. Después de esto, agregue 500 microlitros de tampón de lavado de permeabilización a cada tubo. Centrifugar a 433 x g y a 4 grados centígrados durante 5 minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en 500 microlitros de tampón de lavado de permeabilización.

Centrifugar una vez más a 433 x g a 4 grados centígrados durante 5 minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento celular en 300 microlitros de tampón FACS. Luego, analice las células en un citómetro de flujo como se describe en el protocolo de texto.