Una técnica in vitro para el estudio de tratamientos antimicrobianos sobre agregados bacterianos

Para estudiar el impacto de los antimicrobianos en los agregados bacterianos, tome el cultivo de Pseudomonas aeruginosa en un medio de crecimiento que promueve la formación de agregados, simulando el crecimiento durante la infección.

Las bacterias modificadas expresan una proteína fluorescente para la detección de agregados bajo un microscopio de fluorescencia. Imagen en tres dimensiones para calcular el volumen de los agregados, o la biomasa bacteriana, y visualizar el aumento de la biomasa a lo largo del tiempo, lo que indica el crecimiento bacteriano.

Agregue colistina, un péptido antimicrobiano catiónico, a una concentración subletal que mata las bacterias susceptibles mientras selecciona las tolerantes a los antibióticos.

La colistina se une a los lipopolisacáridos cargados negativamente, o LPS, en la membrana externa bacteriana, desplazando los puentes catiónicos que estabilizan la monocapa de LPS, dañando la integridad de la membrana.

La colistina ingresa al periplasma y se une al LPS en la membrana celular, interrumpiendo la membrana y dando como resultado la lisis celular. Como mecanismo contrario, las mutaciones genéticas específicas en un subconjunto de bacterias neutralizan la carga negativa de LPS. Esta modificación inhibe la interacción electrostática de la colistina catiónica con LPS menos aniónico, evitando la muerte celular.

Imagen para visualizar la disminución de la biomasa con el tiempo, indicando el impacto del antimicrobiano. Agregue yoduro de propidio o PI, un tinte fluorescente, que ingresa a través de la membrana dañada para unirse al ADN, etiquetando solo las células muertas.

Realice la clasificación de células activadas por fluorescencia, o FACS, separando las células susceptibles marcadas con PI y las células tolerantes a antibióticos marcadas con fluorescencia. Las células están listas para los ensayos posteriores.

Para obtener imágenes de los agregados de Pseudomonas aeruginosa mediante un microscopio de barrido láser confocal, al final de la incubación, designe tres pocillos de la placa de cultivo como réplicas de tratamiento con antibióticos en un pocillo como el "control sin tratamiento" y coloque la placa en la platina calentada del microscopio.

Seleccione un objetivo de inmersión en aceite de 63 veces y abra la pestaña Localizar para identificar los agregados bacterianos en el campo claro. Defina un área para obtener imágenes dentro de cada pocillo y use el módulo Posiciones para almacenar la posición del área. Establezca la longitud de onda de excitación en 488 nanómetros y la longitud de onda de emisión en 509 nanómetros.

En el módulo Adquisición, seleccione la opción Z-Stack para adquirir las imágenes y utilice el módulo Line Averaging para reducir la fluorescencia de fondo en el canal GFP dentro del volumen total de las imágenes Z-stack. Establezca la opción Serie temporal para capturar 60 cortes en cada pocillo a intervalos de 15 minutos durante 18 horas, y utilice la estrategia de enfoque definido para almacenar un plano focal para cada posición que se volverá a visualizar en cada punto de tiempo a lo largo del experimento.

4,5 horas después de configurar el experimento de imágenes, obtenga imágenes de cada posición para determinar la biomasa agregada dentro de cada uno de los cuatro pocillos antes de la adición del antibiótico. Después de seis horas, agregue suavemente antibiótico dos veces por debajo de la concentración inhibitoria mínima en el centro de cada pocillo, justo debajo de la interfaz aire-líquido, y haga clic en Iniciar experimento para comenzar las imágenes posteriores al tratamiento con antibióticos.

Para aislar las células vivas, al final del período de imágenes de 18 horas, etiquete las bacterias en cada pocillo con el volumen apropiado de yoduro de propidio, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Al final de la incubación, use un recipiente aislado para transferir la placa al citómetro de flujo y configure el citómetro para detectar GFP y yoduro de propidio usando una boquilla de 70 micrones. Luego, ejecute alícuotas de 1 mililitro de cada sobrenadante de cultivo al caudal más bajo para clasificar los agregados viables de Pseudomonas aeruginosa positivos para GFP y no viables negativos para yoduro de propidio.