Detección de la adherencia bacteriana a las células huésped mediante imágenes de fluorescencia

Tome una placa de pocillos múltiples que contenga una monocapa de células epiteliales adherentes susceptibles a la adherencia bacteriana.

Agregue un número variable de Pseudomonas aeruginosa marcada con proteínas fluorescentes, una bacteria patógena, para lograr la proporción deseada de bacterias a células epiteliales.

Centrifugar para acercar las bacterias a las células epiteliales, facilitando las interacciones.

Los pili tipo IV, fibras proteicas de las bacterias, desempeñan un papel fundamental al unirse a glicolípidos específicos en las células epiteliales, mediando la adherencia bacteriana a las células huésped.

Después de la incubación, lavar con un tampón para eliminar las bacterias no adherentes. Fije las células para preservar la estructura celular.

Agregue DAPI, una tinción fluorescente que se une fuertemente a las regiones de ADN ricas en A-T, tiñendo el núcleo. Cubra las celdas con tampón para evitar que se sequen

.

Adquiera imágenes de las bacterias marcadas con GFP unidas a células epiteliales con núcleo teñido con DAPI. Enumere las bacterias adherentes en una sola célula epitelial.

El aumento de bacterias adherentes por célula huésped de una manera dependiente de la dosis, permite la cuantificación de las interacciones huésped-patógeno.

Para el ensayo de adherencia bacteriana, lave las monocapas de células A549 previamente cultivadas tres veces agregando 100 microlitros de PBS tibio a cada pocillo y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo. Luego, deseche PBS. Alternativamente, después de agregar PBS, espere diez segundos y luego, retire PBS con vacío.

Para determinar la cinética de la asociación bacteriana, superponga las células con 100 microlitros de concentraciones deseadas de suspensión bacteriana con diferente multiplicidad de infección. Gire las bacterias e incube las células A549 infectadas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante una hora más. Elimine las bacterias no unidas lavando las monocapas cinco veces con PBS tibio como se demuestra.

A continuación, fije las células agregando 100 microlitros de formaldehído al 4% en todos los pocillos de una placa de 96 pocillos en el hielo. Después de 15 minutos, lave la placa tres veces con PBS para eliminar la solución de fijación, tiñendo los núcleos con 50 nanogramos por mililitro de tinción DAPI durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Después de lavar las células con PBS, cubra las células A549 infectadas con 100 microlitros de PBS para evitar que se sequen, y luego, guarde la placa a 4 grados centígrados hasta por dos días en la oscuridad o proceda a obtener imágenes.