Name: Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 1 s
Description: Aprende a medir la función de células T reguladoras mediante un ensayo de supresión in vitro en humanos. Este método permite identificar desequilibrios inmunológicos en individuos con riesgo de diabetes tipo 1.

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Este estudio fue apoyado por Max McGee Centro Nacional de Investigación para Menores Diabetesat Colegio Médico de Wisconsin y el Instituto de Investigación de Niños de Wisconsin. Los financiadores no participó en el diseño del estudio, la recopilación de datos y análisis, o la preparación del manuscrito.

1. Antes de la creación de un ensayo de supresión, es necesario cuentas de abrigo tosylactivated con anti-CD3 humano (clon UCHT1, 1μg/ml concentración final) para la estimulación de células y después comprobar si las cuentas están recubiertas de manera eficiente mediante la creación de un ensayo in vitro de la proliferación de uso humano las células T <ol><li> Tomar 1 ml de M-450 cuentas de tosylactivated vial original, lugar en soporte magnético y espera hasta que todas las cuentas se han adherido a la pared del tubo. Retire el tubo de amortiguación, mientras que todavía está en el soporte magnético. Tome el tubo del soporte magnético y añadir 1 ml de buffer1, colocar el tubo en soporte magnético y retire el tubo de buffer1 mientras está en el soporte magnético, cuentas resuspender en 1 ml de buffer1 y añadir 40μl de anti-CD3 humano, agitando a 37 º C durante 15 minutos, añadir 0,1% w / v BSA y continuar agitando durante 16 horas siguientes. </li><li> Lavado de los granos en buffer2 dos veces durante 5 minutos a 2-8 ° C y una vez en buffer3 durante 5 minutos a 2-8 ° C con soporte magnético como se explicó anteriormente, quitar el tampón y volver a suspender las bolas en 1 ml de buffer2, las cuentas son 4x10 8 / ml concentración final y listo para usar. </li><li> Alícuota de 50.000 y 25.000 PBMC / y por triplicado en una placa de 96 pocillos y añadir un número variable de CD3 revestida de piedras (4x10 8 cuentas / ml, CD3 1μg/ml, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 gotas / celular ) con el fin de determinar el número óptimo de cuentas por celda. Después de 72 horas en cultivo, añadir 1μCi [3H]-timidina y continuar la incubación a 37 ° C durante las 16 horas siguientes. Las células de la cosecha en la placa de la cosecha multipantalla (Millipore), añadir líquido de centelleo y leer cuentas por minuto (cpm) / y con mejores NXT Count (Packard, CT). Use las gotas / proporción de células en CPM están por encima de 5000, pero 15.000 menos que para evitar la sobre-estimulación de células T reguladoras, que podrían perder la función supresora. Por lo general, la proporción de 3 bolas / celular estimula la respuesta y las células T reguladoras en todos los grupos sometidos a prueba hasta el momento 1-4. </li></ol> 2. PBMC aislamiento de toda la sangre de donantes sanos o de leukopacks humanos o de la capa leucocitaria (BC) por lo general tomado de voluntarios sanos y disponibles de forma gratuita desde los Centros de Transfusión de Sangre (Figura 1) <ol><li> Diluir la AC (~ 50 ml) 1:06 con PBS (añadir 250 ml). Ahora no es el volumen total de 300ml. Poco a poco la capa de 25ml de BC diluida en la parte superior de 15 ml de Ficoll-Paque PLUS añadido a 50 ml tubos Falcon, sin alterar las capas. Centrifugar a 800xg (1400 rpm en una centrífuga Sorvall con rotor basculante SH-3000) durante 30 minutos a 4 ° C, con frenos de apagado. </li><li> Recoger cuidadosamente la capa de PBMC (fase intermedia) y la transferencia a un nuevo máximo de 50 ml tubos Falcon. Lávese las PBMC mediante la cumplimentación de los tubos hasta 50 ml con DPBS. Recoger 2 gránulos de las células en un tubo. Centrifugar a 400xg durante 10 min a 4 ° C. Repita la etapa de lavado dos veces, cada vez que la combinación de 2 gránulos de las células en un solo tubo. Combine todos los gránulos de las células en un solo tubo de 50 ml. </li><li> Contar con PBMC usando Trypan exclusión de prueba azul. Hacer una dilución 1:10 en azul tripán añadiendo 20μl de PBMC a 180μl de azul de tripano mancha. Mezclar bien y tomar 20μl a contar en hemocitómetro de inmediato. Contar el número de todas las células teñidas de azul y sin mancha y está ubicado en dos manzanas cada uno con 16 plazas más pequeñas. Tomar la media de ambas y se multiplica por 10. Divida este número por 100 para obtener el número de PBMC / ml. Porcentaje de células viables calcular como [1 - (número de células de color azul / número de células totales) x 100]. Proceder en caso de viabilidad es ≥ 95%. </li></ol> 3. MACS pre-tipo de células T CD4 <ol><li> Antes de continuar, la transferencia de 1 ml de PBMC en un nuevo tubo, añadir 4 ml de los medios de comunicación para preparar a las células de la irradiación con 5000rad-estos serán células presentadoras de antígeno (APC). </li><li> Centrifugar el resto de las células en 250xg en PBS/2mM EDTA/0.5% de tampón BSA durante 10 min a 4 ° C. Retirar las células sobrenadante y resuspender en 4 ml de buffer PBS/2mM EDTA/0.5% BSA. </li><li> Agregar 200μl de MACS microbolas anti-CD4 e incubar a 4 ° C durante 20 minutos. </li><li> Lave mediante la adición de 40 ml de buffer PBS/2mM EDTA/0.5% BSA y centrifugar a 250xg durante 10 minutos a 4 ° C. Elimínese el líquido sobrenadante y resuspender en 8 ml de desgasificado, la temperatura ambiente PBS/2mM EDTA/0.5% de tampón BSA. </li><li> Filtro por separado la suspensión de células con separación de Pre-filtros antes de su carga en una columna de LS. </li><li> Dividir la suspensión celular y la capa de 4 ml cada columna LS más de calibrado (con 3 ml de deggassed PBS/2mM EDTA/0.5% de tampón BSA). LS columna se fija en el separador MidiMACS. Antes de la suspensión celular se agota, o bien volver a ejecutar el caudal contínuo o añadir 3 ml de la temperatura ambiente deggassed PBS/2mM EDTA/0.5% de tampón BSA y dejar que el buffer que se recorra. Agregar más buffer hasta que salga clara. </li><li> Pipeta de 5 ml de búfer deggassed en la columna LS, LS eliminar la columna del separador MidiMACS y el lugar en un nuevo tubo estéril de recogida 15ml dejar correr ~ 1.0 ml a través. Poner el pistón en la columna y empuje lentamente el resto de lavolumen fuera. </li><li> Haga lo mismo con las dos columnas LS y combinar las dos fracciones de células CD4 +. Agregue hasta 50 ml de PBS las células y el recuento. Rendimiento esperado es de hasta 5x10 8 células. Centrifugar a 400xg durante 10 minutos y suspender las células en 2 ml y PBS/2mM EDTA/0.5% de tampón BSA. </li></ol> 4. Fluorescentes clasificación de células activadas (FACS) de aislamiento (Figura 2) <ol><li> Hacer un cóctel de anticuerpos a los marcadores de CD a los siguientes marcadores de superficie celular (mantener protegido de la luz): 20 l de anti-humano CD8-FITC (clon del EPR-T8), 20 l de anti-CD14 humano-FITC (clon M5E2; receptor de LPS), 20 l de anti-CD32 humano-FITC (clon FLI8.26; FcγR de tipo II) y 6 l de anti-CD116 humana-FITC (clon M5D12, GM-CSFRα cadena) y, en su defecto, añadir 40μl contra -CD4 humano APCCy7 (clon RPA-T4). </li><li> Tome 5μl de la suspensión celular y se tiñen con 2 ml de cóctel 2μl mancha, lo que es un tubo para determinar el umbral (Fluorocromo Minus One FMO) 5. </li><li> Añadir 50 l de anti-CD25 humano-PE (clon M-A251, IL-2Rα) para el cóctel de la mancha, y añadir el cóctel de suspensión de células y se incuba a 4 ° C 30 minutos. Lavar las células en tampón PBS, centrifugar a 400xg durante 10 minutos y suspender las células a una concentración de 10 7 células / ml. </li><li> Prepare las células y las células no teñidas o cuentas teñidas con un solo fluorocromo para su uso como control de compensación de clasificación de células en FACS Aria (BD Biosciences, San José, NJ). </li><li> Adquirir las células en el tubo de FMO, que permitirá al usuario establecer el umbral para la clasificación de células CD25 + T (Figura 2a). Establecer una puerta alrededor de FITC células negativas para excluir FITC de células positivas que comprende los monocitos, los macrófagos y los linfocitos CD4 + otros-no de las células T (Figura 2b). </li><li> En un gráfico diferente, dibuja puertas para CD25, CD25low y CD25high células T Tregs (1% de las células que expresan el mayor número de CD25) (Figura 2c). Subconjuntos de células suelen mostrar alta pureza (Figura 2d, 2e y 2f). </li><li> Centrifugar los tubos de recogida de las células en 400xg durante 10 minutos y mantenerse en hielo hasta placas. </li></ol> 5. Establecer el cultivo de células en placa de 96 pocillos (esquema adjunto como Tabla 1) en 200μl/well <ol><li> 50μl alícuota de CD3 revestida de piedras (1 mg / ml), calculado a 3 perlas / células de respuesta en un pozo, se resuspendieron en medio completo con agregados de 10% de suero humano AB en el fondo en U 96 y placas. (Por ejemplo, para hacer que los medios de comunicación de 2 ml con CD3 recubierto, tomar 7.5μl de stock de CD3 revestida de piedras de final de la concentración de 4x10 8 / ml y se diluye en 2 ml de los medios de comunicación, cada 50μl contendrá 75.000 beads-3beads/cell). </li><li> Diluir APC irradiado a la concentración celular de 5x10 5 / ml y añadir 50μl (contendrá 2,5 x 10 4 células) en cada pocillo con el estímulo añadido previamente, incluidos los pozos etiquetados como "células T reguladoras sólo", "APC sólo" y "medios de comunicación sólo" en la tabla 1. </li><li> Añadir 2,5 x 10 4 / así CD4CD25-o las células T CD4CD25low por triplicado siguiendo el diseño en la Tabla 1. </li><li> Añadir Tregs de co-cultivos (fila B, Tabla 1) en la proporción de 1:10 (2500 células Treg) y los pozos de la etiqueta "sólo Tregs" e incubar la placa a 37 ° C en la incubadora de CO 2 con un 5% de CO 2 , en la humedad saturada durante 72 horas. </li><li> Pulso de los pozos con 1μCi [3H]-timidina y continuar la incubación a 37 ° C durante 16 horas siguientes. </li></ol> 6. La recolección y conteo <ol><li> Las células de la cosecha en la placa de la cosecha multipantalla con Packard Filtermate cosechadora o un sistema alternativo. </li><li> Añadir líquido de centelleo (Microscint 20), cubrir la cosecha plato con cubierta de plástico transparente en la preparación para el paso final. </li><li> Lea cuentas por minuto (cpm) / y con mejores NXT Count (Packard, CT) o un sistema alternativo. </li></ol> 7. Informática porcentaje de supresión <ol><li> Como las células se cultivaron por triplicado, el promedio se calcula para cada condición. Si el coeficiente de variación es&gt; 30%, el valor atípico es eliminado y cpm sólo a partir de dos pozos se promedian. Porcentaje de la supresión se obtiene calculando [(sc) / s] x 100%, donde s = cpm en la cultura única y c = cpm en co-cultivo. </li><li> Como ingenuo (CD25) e in vivo activado (CD25low) las células T efectoras se colocan como células T de respuesta, la diferencia en la capacidad de células T reguladoras para suprimir cada uno de estos subconjuntos es capturado y utilizado como un indicador pronóstico potencial funcional basado en la premisa que las células activadas son más difíciles de suprimir. </li></ol> 8. Los resultados representativos: Una gran variabilidad en los métodos utilizados y los resultados derivados del análisis in vitro de la supresión humanos nos llevó a realizar un estudio exhaustivo de las condiciones que influyen en el ensayo 1. Hemos desarrollado un ensayo que prueba no sólo la función Treg, sino también su pureza, teniendo en cuenta la baja relación entre Tregs: Teffs (1:10), que determinó anteriormente 6. Además, se diferencian en células T reguladoras ªEIR capacidad de reprimir con éxito ingenuo e in vivo de células T activadas, incluso en sujetos sanos, como se muestra en la Figura 3 y en nuestros estudios anteriores 2,4, que se vuelve más importante si el balance inmunológico está comprometido, al igual que en los sujetos con riesgo de desarrollar DT1 . La prueba funcionó muy bien en el estudio donde se comparó la función supresora de los recursos naturales (nTregs), inducible (iTregs) e in vitro nTregs ampliado, lo que nos permite comparar su función entre los controles sanos, de reciente aparición (RO) DT1 y larga (LS ) sujetos DT1. Llegamos a la conclusión de que los sujetos RO DT1 mejor que la capacidad de generar tanto funcional iTregs nTregs y ampliado en comparación con sujetos de control LS T1D y sano 7. Por lo tanto, este ensayo puede ser utilizado como una herramienta excelente en el reconocimiento tanto de un estado temprano y tardío de un desequilibrio inmunológico. Esquema 1 Presentación esquemática de los pasos involucrados en la represión en el ensayo in vitro <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Pasos del ensayo de supresión in vitro presentados con fotografías <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Estrategia de apertura de puerta en el aislamiento de células FACS. a) CD25 umbral + se ajustó de acuerdo a Fluorocromo Minus One (FMO), b) las células fueron cerradas como FITC-negativos, c) FITC-negativos células fueron aún más cerrada y se recoge en CD + CD25, CD + CD25low y CD + CD25high ( Tregs) se muestra con porcentajes, d) FACS ordenados Tregs después de la clasificación, e) FACS ordenados CD + CD25low después de la clasificación, y f) FACS ordenados CD4 + CD25 de las células T después de la clasificación <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Los resultados representativos de los sujetos sanos a) Los resultados representativos de cuentas por minuto (cpm) de los sujetos sanos presentan como un solo cultivo para todos los subconjuntos de células implicadas (ingenuo-CD25-en vivo-activa CD25low, células presentadoras de antígeno-APC y regulación de las células T-Treg), así como co-cultivos de células T de respuesta (CD25-o CD25low) y células T reguladoras. b) El porcentaje de supresión de cada uno de CD25-y CD25low respuesta por las células T autólogas Tregs se presenta para los controles sanos (n = 4). Supresión se calcula como [(sc) / s] x 100%, donde s = cpm en la cultura única y c = cpm en co-cultivo. Aunque ligera diferencia en la capacidad de las células T reguladoras para suprimir la respuesta de células T se dio cuenta, no fue significativa (prueba t pareada p = 0,08). C) Se presentan cpm en temas de riesgo de cada cultura individual, incluyendo CD25-y CD25low como respuesta las células T, así como APC y Tregs, y co-culturas donde se siembra cada subconjunto de respuesta de células T con células T reguladoras (CD25-/Tregs y CD25low/Tregs). d) Porcentaje de la supresión de cada uno de CD25-y las células T de respuesta CD25low autólogo Tregs se presenta en sujetos de riesgo (n = 4). La diferencia en la capacidad de las células T reguladoras para suprimir CD25-en comparación con las células T CD25low respuesta fue significativa (prueba t pareada p = 0,04). Tabla 1. Esquema de puesta en marcha de ensayo de supresión in vitro <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1.3 </td><td> 6.4 </td><td> 9.7 </td><td> 10-12 </td></tr><tr><td> A </td><td> CD4CD25- </td><td> CD4CD25low </td><td> los medios de comunicación sólo </td><td> los medios de comunicación sólo </td></tr><tr><td> B </td><td> CD4CD25-/ Tregs </td><td> CD4CD25low / Tregs </td><td> Tregs sólo </td><td> APC sólo </td></tr><tr><td> C </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> D </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> F </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> G </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> H </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

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Como la única característica única de células T reguladoras, la función de supresión debe ser probado de forma fiable y uniforme entre los sujetos en las diferentes fases de desarrollo de la enfermedad dentro de la misma y entre los diferentes estudios. Le ofrecemos los detalles de la prueba de supresión desarrollado en nuestro laboratorio como nuestra contribución a la normalización de este ensayo. En nuestro estudio de optimización extensa, hemos determinado que la estimulación de células T con anti-CD3 humana revesti...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo o instrumento </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Ficoll-Paque PLUS </td><td> Amersham Pharmacia Biotech </td><td> 17-1440-03 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS-1X </td><td> Gibco </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> Azul de tripano </td><td> Invitrogen </td><td> 15250-061 </td><td></td></tr><tr><td> anti-CD4 microbolas </td><td> Miltenyi </td><td> 130-045-101 </td><td></td></tr><tr><td> Separación de los pre-filtros </td><td> Miltenyi </td><td> 130-041-407 </td><td></td></tr><tr><td> LS columna </td><td> Miltenyi </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 15575-020 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4287 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD4 humano APCCy7 (clon RPA-T4) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557852 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humano CD25-PE (clon M-A251, IL-2Rα) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555432 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humano CD8-FITC (clon RPA-T8) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555366 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humano CD14-FITC (clon M5E2; receptor de LPS) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555397 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humano CD32-FITC (clon FLI8.26; FcγR de tipo II) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555448 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humano CD116-FITC (clon M5D12, GM-CSFRα cadena) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554532 </td><td></td></tr><tr><td> Dynalbeads M-450 tosylactivated </td><td> Invitrogen </td><td> 140-13 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD3 humanos </td><td> Ancell </td><td> 144-024 </td><td></td></tr><tr><td> Buffer1 </td><td> Casero </td><td></td><td> 0,1 M Na 2 B 4 O 7 pH7.6 </td></tr><tr><td> Buffer2 </td><td> Casero </td><td></td><td> PBS/2mM EDTA / 0,1% BSA pH 7,4 </td></tr><tr><td> Buffer3 </td><td> Casero </td><td></td><td> 0,2% de BSA pH 8,5 Tris/0.1 </td></tr><tr><td> Completa los medios de comunicación RPMI </td><td> Casero </td><td></td><td> Medio RPMI 1640 glutamina 2 mM L-5 mM HEPES 100 U / mg / ml penicilina / strept 0,5 mM piruvato sódico </td></tr><tr><td> [3 H] timidina </td><td> Perkin Elmer </td><td> NET027Z005MC </td><td></td></tr><tr><td> humanos agrupados suero AB </td><td> Atlanta Productos Biológicos </td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td> Placa de la cosecha multipantalla </td><td> Millipore </td><td> MAHFC1H60 </td><td></td></tr><tr><td> Microscint 20 </td><td> Perkin Elmer </td><td> 6013621 </td><td></td></tr></tbody></table>

humano in vitro supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Las células T reguladoras (Tregs) son mediadores críticos de la tolerancia inmunológica a antígenos propios. Además, son reguladores esenciales de la respuesta inmune después de una infección. A pesar de los esfuerzos para identificar marcadores de superficie única en Tregs, la única característica única es su capacidad para suprimir la proliferación y la función de las células T efectoras. Si bien es claro que sólo en los ensayos in vitro se pueden utilizar en la evaluación de la función Treg humanos, esto se vuelve problemático cuando se evalúen los resultados de los estudios transversales en las células sanas y células aisladas de pacientes con enfermedades autoinmunes (como la diabetes tipo 1-DT1) necesitan para ser comparados. Hay una gran variabilidad entre laboratorios en el número y tipo de células T de respuesta, la naturaleza y la fuerza de la estimulación, Treg: ratios de respuesta y el número y tipo de células presentadoras de antígeno (APC) que se utiliza en humanos en ensayos de supresión in vitro. Esta variabilidad hace que la comparación entre los estudios de medición de la función Treg difícil. El campo de las necesidades de Treg un ensayo de supresión estándar que funcione bien con los sujetos sanos y aquellos con enfermedades autoinmunes. Hemos desarrollado un ensayo de supresión in vitro que muestran muy poca variabilidad intra-ensayo en la estimulación de células T aisladas de voluntarios sanos en comparación con sujetos con base destrucción autoinmune de las células pancreáticas β-. El objetivo principal de esta obra es describir un ensayo in vitro supresión humanos que permita la comparación entre grupos de sujetos diferentes. Además, este ensayo tiene el potencial para delinear una pequeña pérdida en la función nTreg y anticiparse a una mayor pérdida en el futuro, por lo tanto la identificación de los sujetos que podrían beneficiarse de la terapia inmunomoduladora preventivas 1. A continuación, ofrecemos una descripción detallada de los pasos involucrados en este procedimiento. Esperamos contribuir a la estandarización de la prueba de supresión in vitro utilizado para medir la función Treg. Además, le ofrecemos este ensayo como una herramienta para reconocer un estado inicial de desequilibrio inmunológico y un biomarcador potencial funcional de DT1.

Tregs son supresores potentes del sistema inmune. Hay una falta de marcadores de superficie única para definir, por lo tanto, las definiciones de células T reguladoras son principalmente funcionales. A continuación se describe un optimizado<em&gt; In vitro</em&gt; Prueba capaz de identificar el desequilibrio inmunológico en personas en riesgo de desarrollar DT1.

Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico

Las células T reguladoras (Tregs) son mediadores críticos de la tolerancia inmunitaria a los autoantígenos. Además, son reguladores cruciales de la respuesta inmunitaria...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar un ensayo de supresión humano in vitro para medir la función de las células Treg y potencialmente anticipar una futura pérdida de su función. Esto se logra primero preparando y probando perlas codificadas, que se utilizarán como estimuladores celulares. El segundo paso consiste en aislar células T puras CD4 positivas CD25 negativas, células T CD4 positivas CD25 bajas activadas in vivo y células T reguladoras CD4 positivas CD25 altas N para irradiar PP BMCs que se usarán como células presentadoras de antígenos o APCs.A continuación, se establecen cultivos simples de linfocitos T vírgenes o activados como células respondedoras con BMC procedentes de P como APC o cultivos mixtos en las mismas condiciones, pero añadiendo las células Treg en una proporción de uno a diez. El paso final consiste en recoger las células y medir su proliferación mediante la incorporación de timidina tritiada. Los resultados obtenidos finalmente pueden demostrar diferencias en la supresión de las respuestas de linfocitos T vírgenes frente a las de linfocitos T activados in vivo.Me llamo Jeff Woodcliff. Las células T reguladoras no expresan marcadores únicos en la superficie celular. Por lo tanto, para medir de manera confiable su función, deben aislarse utilizando técnicas que ofrezcan la mejor separación posible.La principal ventaja de utilizar la clasificación de células activadas por fluorescencia frente a otros métodos como el aislamiento máx, es que fax ofrece poblaciones celulares puras que pueden lograrse. La función celular luego puede evaluarse de manera confiable en ensayos de supresión in vitro, como se demuestra aquí. Aunque este método puede proporcionar información sobre la función de las células Treg en sujetos sanos y relacionados con la diabetes tipo uno. También puede aplicarse a otras enfermedades autoinmunes, como artritis reumatoide humana, lupus sistémico, eritematoso, esclerosis múltiple y otras. Para recubrir las perlas activadas con taal con anti-CD3 humano.Añada un mililitro de las perlas M cuatro 50 activadas procedentes del vial original a un tubo de 1,5 mililitros y coloque el tubo en un soporte magnético hasta que todas las perlas se adhieran a la pared del tubo. A continuación, elimine el tampón de las perlas aspirándolo con una pipeta mientras el tubo permanece en el soporte magnético. Luego, retire el tubo del soporte magnético y añada un mililitro del tampón uno.Coloque el tubo en el soporte magnético una y otra vez. Retire el tampón mientras el tubo está en el soporte magnético. Resuspenda, suspenda las perlas en un mililitro de tampón una vez más.Esta vez agregue 40 microlitros de anticuerpo anti-humano CD3 también. Agite las perlas y el anticuerpo a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Luego agregue BSA al 0,1 % peso por volumen y continúe agitando durante las próximas 16 horas.A continuación, lave las perlas dos veces con el tampón dos incubando las perlas en un mililitro de tampón dos durante cinco minutos a dos a ocho grados Celsius, y luego elimine el tampón mientras el tubo está en el soporte magnético. A continuación, lave las perlas una vez más en las mismas condiciones estériles.Esta vez, utilizando un mililitro de tampón tres, pruebe la eficiencia del recubrimiento con anticuerpo añadiendo un número variable de microesferas recubiertas con CD tres por célula para determinar la proporción óptima y cite ALI 50,020 a 5,000 PBMC por pocillo en triplicado en una placa de 96 pocillos. Tras 72 horas de cultivo a 37 grados Celsius, añada un microcurie de timidina tritiada y continúe la incubación durante las siguientes 16 horas. Recolecte las células en una placa de recolección multipantalla o similar.Añada líquido de centelleo y lea las cuentas por minuto o CPM por pocillo. Utilizando un contador de centelleo tipo top count N XT, o similar, determine la relación de microesferas por célula usando aquella que dé una CPM consistentemente superior a 5.000, pero inferior a 15.000 según nuestra experiencia. Una relación de tres microesferas por célula suele proporcionar la estimulación óptima tanto para células respondedoras como para células Treg en todos los sujetos humanos analizados.Llene un tubo cónico de 50 mililitros con 15 mililitros de FAL Plus. Luego realice una dilución uno a seis de 50 mililitros de capa leucocitaria agregando 250 mililitros de PBS al tubo de sangre. Añada cuidadosamente 25 mililitros de la capa leucocitaria diluida encima del Fial Pack sin alterar las capas.Centrifugar a 800 × g durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Con la desaceleración desactivada, recoger cuidadosamente la capa de PBMC, que es la fase intermedia blanca entre el vial y el tampón. Si es necesario, raspar las células de la pared del tubo.Espere unos minutos y recójalos nuevamente de la fase intermedia. Transfiera las células a tubos nuevos de 50 mililitros y lávelas llenando los tubos con PBS para formar el pellet. Los PBMCs.Repita el paso de lavado dos veces cada vez. Combine dos pellets celulares en un solo tubo y, finalmente, reúna todos los pellets celulares en un único tubo de 50 mililitros. Luego, utilice 20 microlitros de las células en suspensión para determinar la viabilidad celular mediante la exclusión con azul de tripano.Pruebe generar APCs transfiriendo un mililitro de los PBMC viables a un nuevo tubo. Luego agregue cuatro mililitros de medio e irradie las células con 5.000 rads. Complete el tubo que contiene el resto de los PBMC con tampón PBS. Luego, después de centrifugar las células a 250 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius, deseche el sobrenadante y resuspenda las células en cuatro mililitros de la misma mezcla.Luego, agregue 200 microlitros de microesferas máximas anti-CD4 a los PBMC e incube la mezcla de células y microesferas a cuatro grados Celsius durante 20 minutos. Después de la incubación, lave las células con 40 mililitros de tampón PBS y luego centrifugue para obtener el sedimento celular. A continuación, deseche el sobrenadante y resuspenda las células en ocho mililitros de tampón PBS desgasificado a temperatura ambiente.A continuación, utilice filtros de separación pres para filtrar y separar la suspensión celular. Luego divida el PBM CS en dos tubos de 15 mililitros. Añada cuatro mililitros de los P BMCs a cada tubo.Añada dos columnas gruesas a un separador minimax y coloque tubos de recolección debajo de cada columna. A continuación, agregue tres mililitros de tampón PBS DGAs a cada columna; cuando no quede tampón, superponga cuidadosamente toda la solución celular de cuatro mililitros de cada tubo sobre las columnas antes de que la suspensión celular se agote por completo. Añada tres mililitros de tampón PBS DGAs a temperatura ambiente a cada columna y deje que el tampón pase a través de ellas hacia los tubos de recolección.Agregue más tampón hasta que salga claro. Pipetee cinco mililitros adicionales del tampón DGAs sobre las columnas LS y luego retire las columnas LS del separador minimax. Coloque las columnas en nuevos tubos colectores estériles de 50 mililitros.Deje salir medio mililitro y luego expulse lentamente el resto del volumen, que es aproximadamente cuatro mililitros. Ahora combine las dos fracciones positivas de CD4. A continuación, agregue hasta 50 mililitros de PBS al tubo y cuente las células después de centrifugarlas a 400 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.ReSuspender las células en dos mililitros de tampón PBS. Combinar los anticuerpos que se utilizarán para la tinción de superficie en un solo tubo: anti-CD14, CD32, CD116 y opcionalmente anti-CD4. Tomar una alícuota de la mezcla para teñir el tubo menos un fluorocromo.Prepare el tubo FMO transfiriendo cinco microlitros de la suspensión celular por mililitro a un tubo fax y tiña las células con dos microlitros de la mezcla de anticuerpos previamente preparada. A continuación, agregue células no tiñidas y cuentas recubiertas con IgG de ratón que se tiñan con un solo fluorocromo a nuevos tubos fax individuales para usarlos como controles de compensación para la clasificación celular. Luego, agregue 50 microlitros de CD25 humano anti-PE a la mezcla y añada la mezcla al resto de la suspensión celular.Incube los tubos a cuatro grados Celsius durante 30 minutos. Después de incubar las células con la mezcla de anticuerpos, agregue tampón PBS a las células y luego péletelas Resus. Suspenda el precipitado en tampón PBS a una concentración de 10 a la siete células por mililitro.Utilice el tubo FMO para establecer el umbral para la clasificación de linfocitos T positivos para CD25. Mediante esta estrategia de selección, primero establezca una compuerta alrededor de las células FITC negativas con el fin de excluir las células FITC positivas, que comprenden monocitos, macrófagos y todas las demás células no T positivas para CD4, como se muestra en esta figura. En un gráfico aparte, dibuje compuertas para linfocitos T CD25 negativos y CD25 bajos, y células Treg CD25 altas como se indica en esta figura.Tras el flujo, al clasificar los subconjuntos celulares, centrifugue los tubos de recolección y luego mantenga los linfocitos T sobre hielo hasta el momento de sembrarlos. Etiquete una placa de 96 pocillos con fondo en U como se muestra en la tabla. Suspenda una alícuota de 50 microlitros de perlas recubiertas con CD3, calculada para una concentración de tres perlas por célula respondedora por pocillo, en medio completo con 10% de suero humano AB agrupado en la placa de 96 pocillos, y luego diluya las APC previamente irradiadas en medio hasta una concentración de cinco veces 10 a la quinta células por mililitro.Añada 50 microlitros de las células a la placa de 96 pocillos y luego agregue 2,5 veces 10 a la cuatro células T CD4 positivas CD25 negativas o CD4 positivas CD25 bajas por pocillo en triplicado. Añada las Treg a la fila B y a los pocillos etiquetados como solo Treg en la co-cultura en una proporción de 1 a 10, como se muestra aquí. A continuación, incube la placa a 37 grados Celsius en un incubador con 5 %CO2 en humedad saturada durante 72 horas. Luego, pulse las células con un microcurio de timidina tritiada y continúe la incubación a 37 grados Celsius durante las siguientes 16 horas después de que la timidina haya sido incorporada en las últimas horas de la co-cultura.Utilice una cosechadora de filtro mate para cosechar las células en una placa de cosecha con múltiples rejillas. Luego, cubra la placa de cosecha con una cubierta plástica transparente previamente rellenada con un líquido de centelleo. Finalmente, lea los CPM por pocillo.Mediante un contador de centelleo, los subconjuntos de linfocitos T pueden aislarse con alta pureza mediante este sistema, como se observa en la siguiente serie de diagramas de dispersión: aquí se muestran las células T CD4 positivas CD25 negativas en la compuerta inferior. En esta siguiente figura, pueden observarse células T CD4 positivas CD25 bajas altamente purificadas. Una población pura de células T CD4 positivas clasificadas por citometría de flujo.Las células Treg CD25 altas se muestran en la compuerta superior de control. Cultivos de tipo celular único de APC y células Treg provenientes de sujetos sanos mostraron poca o ninguna proliferación por encima del fondo, medida mediante la incorporación de timidina, mientras que las células T CD25 negativas naïve y las células T CD25 bajas activadas in vivo exhibieron una proliferación marcada que se suprime cuando estos tipos de células respondedoras se cultivan en co-cultivo con células Treg. Aunque se observaron ligeras diferencias en la capacidad de las células Treg para suprimir las células respondedoras naïve CD25 negativas y las células T CD25 bajas activadas in vivo.No fue un control significativo. Los cultivos de tipo celular único de APC y Treg de sujetos en riesgo mostraron poca o ninguna proliferación por encima del fondo, medida mediante la incorporación de timidina. Mientras que las células T naïve CD25 negativas y las células T CD25 bajas activadas InVivo exhibieron niveles más bajos de proliferación en comparación con los controles sanos.Las células T respondedoras fueron suprimidas adicionalmente por las treg y los cultivos conjuntos, ya que el ensayo genera resultados confiables. Además, podemos concluir que los valores bajos de CPM sugieren defectos potenciales en la transducción de señales, lo cual debería investigarse más a fondo en un tipo diferente de estudio. La diferencia en la capacidad de las treg para suprimir las células T respondedoras CD25 negativas frente a las células T respondedoras CD25 bajas en sujetos en riesgo, sin embargo, fue significativa.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo conectar de forma fluida todos los pasos necesarios para realizar una prueba funcional exitosa y confiable para detectar la presencia de linfocitos T reguladores en sujetos sanos y en sujetos con sistemas inmunitarios comprometidos. Por ejemplo, en sujetos con diabetes tipo uno.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Hemos desarrollado un ensayo in vitro para investigar el papel de las vías inmunorreguladoras en la regulación de la secreción de citoquinas por las células-T CD4 específicas del VIH.

Ensayo in vitro para evaluar el impacto de inmunoreguladoras Caminos de CD4 T función específica para el VIH efector celular

Se describe el uso de los anticuerpos monoclonales TG30 (CD9) y GCTM-2 para la detección combinada de antígenos de la superficie celular a través de la fluorescencia activada por la clasificación celular (FACS) para la identificación y enriquecimiento de células madre embrionarias humanas vivas (hESC) utilizando la selección positiva y también el uso de la selección negativa para purgar hESCs de una población de células mixtas.

Enriquecimiento Y Purga De Células Madre Embrionarias Humanas Por La Detección De Antígenos De Superficie Celular Utilizando Los Anticuerpos Monoclonales TG30 Y GCTM-2

La coinfección humana es difícil de replicar in vitro. Sin embargo, los parásitos de la malaria humana pueden cultivarse fácilmente in vitro, al igual que las células mononucleares de sangre periférica humana recién aisladas infectadas naturalmente con el VIH. Esto proporciona un modelo excelente para estudiar las respuestas inmunitarias tempranas a los parásitos de la malaria en el contexto de la coinfección por el VIH.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para medir la respuesta inmune a la malaria en el contexto del VIH Co-infección

Este protocolo describe los métodos para construir un modelo de ratón humanizado de médula ósea/hígado/timo con inmunidad modificada basada en células madre contra la infección por VIH.

-Base de células madre Inmunidad Diseñado frente a la infección por VIH en el modelo de ratón humanizado

Aquí, presentamos un protocolo para inducir tolerancia en el trasplante y evaluar in vitro e in vivo la capacidad supresora de subconjuntos distintos de la célula del receptor y el estado inmune del receptor hacia el donante o los antígenos exógenos.

In Vitro e In Vivo la evaluación de la actividad supresora T, B y las células mieloides y las respuestas humorales de los receptores de trasplante

Describimos aquí un protocolo para investigar la citotoxicidad de CD8 pre-activado+ T las células contra las células cancerosas mediante la detección de apoptosis cáncer células vía en tiempo real la microscopia. Este protocolo puede investigar los mecanismos detrás de la supresión de la célula de T inducida por la célula mieloide y evaluar compuestos destinados a reposición de T las células vía bloqueo de células mieloides supresores inmunes.

Tiempo real detección de Vitro Tumor de la célula apoptosis inducida por CD8+ T las células para el estudio de las funciones inmunológicas de supresores de Tumor infiltrante de células mieloides

Este papel utiliza un ensayo basado en la citometría de flujo para las bibliotecas de la pantalla de inhibidores químicos para la identificación de los inhibidores y los objetivos que influyen en la del receptor de células T de señalización. Los métodos descritos aquí pueden ampliarse también para proyecciones de alto rendimiento.

Identificación de mediadores del Receptor de células T de señalización a través de la proyección de las bibliotecas del inhibidor químico

Describimos una célula mononuclear de sangre periférica humana (PBMC), modelo de ratón xenoinjerto humanizado basado para la investigación traslacional de inmunooncología. Este protocolo podría servir como una guía general para establecer y caracterizar modelos similares para la evaluación de la terapia I-O.

Un modelo de xenoinjerto humanizado de sangre periférica humana (PBMC) para la investigación de inmunooncología traslacional (I-O)

El uso de un enfoque basado en ARN para determinar los perfiles inmunitarios cuantitativos de los tejidos tumorales sólidos y aprovechar las cohortes clínicas para el descubrimiento de biomarcadores de oncitología se describe a través de protocolos moleculares e informáticos.

Modelado inmune predictivo de tumores sólidos

Aquí se presenta un protocolo para el aislamiento primario de monocitos de sangre humana, así como su diferenciación en macrófagos y células dendríticas y el montaje con células epiteliales en un modelo pulmonar humano multicelular. Se comparan las respuestas biológicas de las cocultivos compuestas de células inmunitarias diferenciadas de los monocitos recién aislados o descongelados, tras la exposición a estímulos proinflamatorios.

Modelo alveolar humano multicelular compuesto por células epiteliales y células inmunes primarias para la evaluación de riesgos

Este protocolo describe la generación de ratones del sistema inmune humano (HIS) para estudios de inmunooncología. Las instrucciones y consideraciones en el uso de este modelo para probar inmunoterapias humanas en tumores humanos implantados en este modelo se presentan con énfasis en la caracterización de la respuesta del sistema inmune humano al tumor.

Prueba de inmunoterapia contra el cáncer en un modelo de ratón humanizado con tumores humanos

Aprende a medir la función de células T reguladoras mediante un ensayo de supresión in vitro en humanos. Este método permite identificar desequilibrios inmunológicos en individuos con riesgo de diabetes tipo 1.

Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico

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