Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico

El objetivo general de este procedimiento es utilizar un ensayo de supresión humano in vitro para medir la función de las células Treg y posiblemente anticipar una futura pérdida de su función. Esto se logra primero preparando y probando perlas codificadas, que se utilizarán como estimuladores celulares. El segundo paso consiste en aislar células T puras CD4 positivas CD25 negativas, células T CD4 positivas CD25 bajas activadas in vivo y células T reguladoras CD4 positivas CD25 altas, así como irradiar PP BMCs para usarlos como células presentadoras de antígenos o APCs.

A continuación, se establecen cultivos simples de linfocitos T vírgenes o activados como células respondedoras con BMCs de P como APCs, o cultivos cocultivos en las mismas condiciones, pero agregando Tregs en una proporción de uno a diez. El paso final consiste en recolectar las células y medir su proliferación mediante la incorporación de timidina tritiada. Los resultados obtenidos finalmente pueden demostrar diferencias en la supresión de las respuestas de linfocitos T vírgenes frente a las de linfocitos T activados in vivo.

Me llamo Jeff Woodcliff. Las células T reguladoras no expresan marcadores únicos en la superficie celular. Por lo tanto, para medir de manera confiable su función, deben aislarse utilizando técnicas que proporcionen la mejor separación posible.

La principal ventaja de utilizar la clasificación de células por fluorescencia frente a otros métodos como el aislamiento máximo, es que fax ofrece poblaciones celulares puras que pueden obtenerse. La función celular luego puede evaluarse de forma confiable en ensayos de supresión in vitro, como se demuestra aquí. Aunque este método puede proporcionar información sobre la función de las células Treg en sujetos sanos y relacionados con la diabetes tipo uno. También puede aplicarse a otras enfermedades autoinmunes, como la artritis reumatoide humana, el lupus eritematoso sistémico, la eritromelalgia, la esclerosis múltiple y otras. Para recubrir las perlas activadas con taal con anti-CD3 humano.

Añada un mililitro de las perlas M cuatro 50 activadas del vial original a un tubo de 1,5 mililitros y coloque el tubo en un soporte magnético hasta que todas las perlas se adhieran al costado del tubo. Luego, retire el tampón de las perlas aspirándolo con una pipeta mientras el tubo aún está en el soporte magnético. A continuación, saque el tubo del soporte magnético y añada un mililitro del tampón uno.

Coloque el tubo en el soporte magnético una y otra vez. Retire el tampón mientras el tubo está en el soporte magnético. Resuspenda, suspenda las perlas en un mililitro de tampón una vez más.

Esta vez agregue 40 microlitros de anticuerpo anti-humano CD3 también. Agite las perlas y el anticuerpo a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Luego agregue BSA al 0,1 % peso por volumen y continúe agitando durante las próximas 16 horas.

A continuación, lave las perlas dos veces con tampón dos, incubando las perlas en un mililitro de tampón dos durante cinco minutos a dos a ocho grados Celsius, y luego elimine el tampón mientras el tubo está en el soporte magnético. A continuación, lave las perlas una vez más en las mismas condiciones estériles.

Esta vez, utilizando un mililitro de tampón tres, pruebe la eficiencia del recubrimiento con anticuerpo añadiendo un número variable de microesferas recubiertas con CD tres por célula, con el fin de determinar la proporción óptima, citando ALI 50,020 a 5,000 PBMC por pocillo en triplicado en una placa de 96 pocillos. Tras 72 horas de cultivo a 37 grados Celsius, añada un microcurie de timidina tritiada y continúe la incubación durante las siguientes 16 horas. Recolecte las células en una placa de recolección multipantalla o similar.

Añada líquido de centelleo y lea las cuentas por minuto o CPM por pocillo. Utilizando un contador de centelleo tipo top count N XT, o similar, determine la relación de microesferas por célula usando aquella que dé una CPM consistentemente superior a 5.000, pero inferior a 15.000 según nuestra experiencia. Una relación de tres microesferas por célula suele proporcionar la estimulación óptima tanto para células respondedoras como para células Treg en todos los sujetos humanos analizados.

Llene un tubo cónico de 50 mililitros con 15 mililitros de FAL Plus. Luego realice una dilución uno a seis de 50 mililitros de capa leucocitaria agregando 250 mililitros de PBS al tubo de sangre. Añada cuidadosamente 25 mililitros de la capa leucocitaria diluida encima del Fial Pack sin alterar las capas.

Centrifugar a 800 × g durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Con la frenada desactivada, recoger cuidadosamente la capa de PBMC, que es la fase intermedia blanca entre el vial y el tampón. Si es necesario, raspar las células de la pared del tubo.

Espere unos minutos y recójalos nuevamente de la fase intermedia. Transfiera las células a tubos nuevos de 50 mililitros y lávelas llenando los tubos con PBS para formar el pellet. Los PBMCs.

Repita el paso de lavado dos veces cada vez. Combine dos pellets celulares en un solo tubo y, en última instancia, reúna todos los pellets celulares en un único tubo de 50 mililitros. Luego, utilice 20 microlitros de las células en suspensión para determinar la viabilidad celular mediante la exclusión con azul de tripano.

Pruebe generar APCs transfiriendo un mililitro de los PBMC viables a un nuevo tubo. Luego agregue cuatro mililitros de medio e irradie las células con 5.000 rads. Complete el tubo que contiene el resto de los PBMCs con tampón PBS. Luego, después de centrifugar las células a 250 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius, deseche el sobrenadante y resuspenda las células en cuatro mililitros de la misma mezcla.

Luego, agregue 200 microlitros de microesferas máximas anti-CD4 a los PBMC e incube la mezcla de células y microesferas a cuatro grados Celsius durante 20 minutos. Después de la incubación, lave las células con 40 mililitros de tampón PBS y luego centrifugue para obtener el sedimento celular. A continuación, deseche el sobrenadante y resuspenda las células en ocho mililitros de tampón PBS desgasificado a temperatura ambiente.

A continuación, utilice filtros de separación pres para filtrar y separar la suspensión celular. Luego divida el PBM CS en dos tubos de 15 mililitros. Añada cuatro mililitros de los P BMCs a cada tubo.

Coloque dos columnas gruesas sobre un separador minimax y coloque tubos de recolección debajo de cada columna. A continuación, agregue tres mililitros de tampón PBS DGAs a cada columna; cuando no quede tampón, superponga cuidadosamente toda la solución celular de cuatro mililitros de cada tubo sobre las columnas antes de que la suspensión celular se agote por completo. Agregue tres mililitros de tampón PBS DGAs a temperatura ambiente a cada columna y deje que el tampón pase a través de ellas hacia los tubos de recolección.

Agregue más tampón hasta que salga claro. Pipetee cinco mililitros adicionales del tampón DGAs sobre las columnas LS y luego retire las columnas LS del separador minimax. Coloque las columnas en nuevos tubos colectores estériles de 50 mililitros.

Deje salir medio mililitro y luego expulse lentamente el resto del volumen, que es aproximadamente cuatro mililitros. Ahora combine las dos fracciones positivas de CD4. A continuación, agregue hasta 50 mililitros de PBS al tubo y cuente las células después de centrifugarlas a 400 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.

ReSuspender las células en dos mililitros de tampón PBS. Combinar los anticuerpos que se utilizarán para la tinción de superficie en un solo tubo: anti-CD14, CD32, CD116 y opcionalmente anti-CD4. Tomar una alícuota de la mezcla para teñir el tubo menos un fluorocromo.

Prepare el tubo FMO transfiriendo cinco microlitros de la suspensión celular por mililitro a un tubo fax y tiña las células con dos microlitros de la mezcla de anticuerpos previamente preparada. A continuación, agregue células no teñidas y cuentas recubiertas con IgG de ratón que se tiñan con un solo fluorocromo a nuevos tubos fax individuales para usarlos como controles de compensación para el ordenamiento celular. Luego agregue 50 microlitros de CD25 humano anti-PE a la mezcla y añada la mezcla al resto de la suspensión celular.

Incube los tubos a cuatro grados Celsius durante 30 minutos. Después de incubar las células con la mezcla de anticuerpos, agregue tampón PBS a las células y luego péletelas Resus. Suspenda el precipitado en tampón PBS a una concentración de 10 a la siete células por mililitro.

Utilice el tubo FMO para establecer el umbral para la clasificación de linfocitos T CD25 positivos. Mediante esta estrategia de selección, primero establezca una compuerta alrededor de las células FITC negativas con el fin de excluir las células FITC positivas, que comprenden monocitos, macrófagos y todas las demás células no T CD4 positivas, como se muestra en esta figura. En un gráfico aparte, dibuje compuertas para linfocitos T CD25 negativos y CD25 bajos, y células Treg CD25 altas como se indica en esta figura.

Tras el flujo, al clasificar los subconjuntos celulares, centrifugue los tubos de recolección y luego mantenga los linfocitos T sobre hielo hasta el momento de sembrarlos. Etiquete una placa de 96 pocillos con fondo en U como se muestra en la tabla. Suspenda una alícuota de 50 microlitros de microesferas recubiertas con CD3, calculada para una concentración de tres microesferas por célula respondedora por pocillo, en medio completo con 10% de suero humano AB agrupado en la placa de 96 pocillos; luego diluya las APC previamente irradiadas en medio hasta una concentración de cinco por 10 a la quinta células por mililitro.

Añada 50 microlitros de las células a la placa de 96 pocillos y luego agregue 2,5 veces 10 a la cuatro células T CD4 positivas CD25 negativas o CD4 positivas CD25 bajas por pocillo en triplicado. Añada las Treg a la fila B y a los pocillos etiquetados como solo Treg en la co-cultura en una proporción de 1 a 10, como se muestra aquí. A continuación, incube la placa a 37 grados Celsius en un incubador con 5 %CO2 en humedad saturada durante 72 horas. Luego, pulse las células con un microcurio de timidina tritiada y continúe la incubación a 37 grados Celsius durante las siguientes 16 horas después de que la timidina haya sido incorporada en las últimas horas de la co-cultura.

Utilice una cosechadora de filtro mate para cosechar las células en una placa de cosecha con múltiples rejillas. Luego, cubra la placa de cosecha con una cubierta plástica transparente previamente rellenada con un líquido de centelleo. Finalmente, lea los CPM por pocillo.

Mediante un contador de centelleo, los subconjuntos de linfocitos T pueden aislarse con alta pureza mediante este sistema, como se observa en la siguiente serie de diagramas de dispersión: aquí se muestran las células T CD4 positivas CD25 negativas en la compuerta inferior. En esta siguiente figura, pueden observarse linfocitos T CD4 positivos CD25 bajos altamente purificados. Una población pura de células T CD4 positivas ordenadas por citometría de flujo.

Las células Treg CD25 alta se muestran en la compuerta superior de control. Cultivos de tipo celular único de APC y Treg procedentes de sujetos sanos mostraron poca o ninguna proliferación por encima del fondo, medida mediante la incorporación de timidina, mientras que las células T naïve CD25 negativas y las células T CD25 baja activadas in vivo exhibieron una proliferación marcada que se suprime cuando estos tipos de células respondedoras se cultivan en co-cultivo con células Treg. Aunque se observaron ligeras diferencias en la capacidad de las Treg para suprimir las células respondedoras naïve CD25 negativas y las células T CD25 baja activadas in vivo.

No fue un control significativo. Los cultivos de tipo celular único de APC y Treg de sujetos en riesgo mostraron poca o ninguna proliferación por encima del fondo, medida mediante la incorporación de timidina. Mientras que las células T naïve CD25 negativas y las células T CD25 bajas activadas InVivo exhibieron niveles más bajos de proliferación en comparación con los controles sanos.

Las células T respondedoras fueron suprimidas aún más por las tregs y los cultivos conjuntos, ya que el ensayo genera resultados confiables. Adicionalmente, podemos concluir que los valores bajos de CPM sugieren defectos potenciales en la transducción de señales, lo cual debería investigarse más a fondo en un tipo diferente de estudio. La diferencia en la capacidad de las tregs para suprimir las células T respondedoras CD25 negativas frente a las células T respondedoras CD25 bajas en sujetos en riesgo, sin embargo, fue significativa.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo conectar de forma fluida todos los pasos necesarios para realizar una prueba funcional exitosa y confiable para detectar la presencia de linfocitos T reguladores en sujetos sanos y en sujetos con sistemas inmunitarios comprometidos. Por ejemplo, en sujetos con diabetes tipo uno.