Name: A largo plazo la cultura de muestras humanas del cáncer de pecho y su análisis mediante tomografía óptica de proyección (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Aprende a cultivar tejido primario de cáncer de mama en matriz de colágeno durante 20 días y cuantificar patrones de invasión tridimensional mediante tomografía óptica de proyección. Este método permite evaluar respuestas individuales a fármacos.

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Damos las gracias a Lorna Renshaw (Unidad de Mama de Edimburgo) por su inestimable ayuda en la obtención de muestras clínicas. El uso de material tumoral fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Lothian (08/S1101/41) y obtuvo bajo los auspicios de Medicina Experimental del Cáncer Programa de Centros (Edimburgo). Este trabajo es apoyado por el Consejo Escocés de Financiación. ADL es una señorita Margaret Butters Reekie compañeros de confianza clínica.

1. La extracción de colágeno de la cola de rata <ol><li> Lugar fresco congelado colas de ratas en el 70% de etanol. </li><li> Deglove la piel que recubre los tendones con un bisturí la exposición. </li><li> Franja de los tendones de distancia de la cola y el lugar en el 70% de etanol para esterilizar. </li><li> Pesar los tendones recogida y traslado al ácido acético (tendón de 1g a 250 ml de ácido acético 0,5 M). Mezclar durante 48 horas de grabación a 4 ° C. </li><li> Centrifugar la mezcla de ácido tendón / acético a 10.000 g durante 30 minutos y desechar el sedimento. </li><li> Añadir un volumen igual de 10% (w / v) NaCl al sobrenadante y dejar la mezcla reposar durante la noche a 4 ° C. </li><li> Recoger la capa rica en colágeno, inferior insoluble y centrifugado para 30 minutos más de 10.000 g. </li><li> Resuspender el material rico en colágeno en ácido acético 0,25 M a 4 ° C y dializa contra 1:1000 ácido acético a 4 ° C durante 3 días, cambiando el tampón de diálisis dos veces al día. </li><li> Además esterilizar la solución de colágeno por centrifugación (20.000 g durante 2 h) y se almacenan a 4 ° C. </li><li> Diluir colágeno según sea necesario con la adición de ácido acético 1:1000 estéril a una concentración de 1mg/ml de valores. </li></ol> 2. 3D Creación de ensayo El ensayo 3D se basa en un ensayo de línea celular, publicó anteriormente con el 2. <ol><li> Múltiples biopsias centrales se recolectan de consentir los pacientes en el momento de la resección curativa quirúrgica para el cáncer de mama invasivo. </li><li> A simple vista, se dividen los núcleos con un bisturí en 1 mm 3 fragmentos. Recorte y deseche la grasa macroscópicamente diferentes. </li><li> Sumerja los fragmentos en los medios de comunicación MEGM completa. El tejido se pueden almacenar en este estado durante un máximo de 1 hora. </li><li> Para crear el gel de colágeno, la mezcla de hielo de colágeno de cola de rata 1mg/ml, 1:1000 ácido acético filtrada, 10x DMEM/F12 y NaOH 0.22M en una proporción de 3:5:1:1 para crear una concentración de colágeno final de 0,3 mg / ml. </li><li> Inyectar 1,2 ml de la mezcla de colágeno en los distintos pozos de una placa de 24 pocillos y el lugar en una incubadora a 37 ° C durante 10 minutos para iniciar la gelificación. </li><li> Después de 10 minutos, retire el plato y 24 de la incubadora. Coloque los trozos de tumor en el colágeno de gelificación y suavemente empuje hacia el centro del gel usando una 10μl punta de la pipeta. Devolver la placa y 24 a la incubadora durante 1 hora. </li><li> Para los tumores ER +, suplemento MEGM los medios de comunicación completa con β-estradiol a una concentración de 3.2x10 -10 M. Una vez que los ensayos de gel tienen gel durante 1 hora, introducir con cuidado 1,2 ml de los medios de comunicación complementado en cada pozo. El final de β-estradiol concentración en el ensayo se equilibriate a 1.6x10 -10 M para recapitular los niveles fisiológicos de estrógeno que se encuentra en el tejido mamario 3. </li><li> Ejecutar una punta de pipeta 10μl alrededor del borde interior de cada bien, la liberación de cada gel circunferencialmente, permitiendo así que cada gel a flotar libremente en los medios de comunicación. Devolver la placa y 24 a la incubadora. </li><li> Intercambio complementado los medios de comunicación dos veces por semana hasta la finalización del experimento. Terminar el experimento mediante la eliminación de los medios de comunicación y la adición de un fijador de formol. </li></ol> 3. La tinción de anticuerpos del ensayo en la preparación de la tomografía óptica de proyección Hemos adoptado un método previamente publicado por 4 todo tinción de las muestras. <ol><li> Lávese las muestras fijadas en formol durante 30 minutos en PBS. Deshidratar los geles paso a paso en metanol diluido en PBS que contenía 0,05% de Tween 20 (0,05% PBST): 33%, 66% y el 100% de ≥ 15 minutos en cada paso. </li><li> Incubar el tejido recién preparada MeOH: DMSO: 30% H 2 O 2 en una proporción de 02:01:03 (15% v / v de H 2 O 2) a temperatura ambiente durante 24 horas para saciar la autofluorescencia. </li><li> Lávese las muestras dos veces durante 30 minutos en metanol. Congelar las muestras a -80 ° C cinco veces por lo menos 1 hora cada vez y de nuevo a temperatura ambiente (TA) para asegurarse de que los antígenos en las partes más profundas de los tejidos se vuelven accesibles. </li><li> Rehidratar los tejidos de nuevo a 0,05% PBST con metanol como disolvente (33%, 66% y 100% para 15 minutos en cada paso). </li><li> Bloquear el tejido en solución de bloqueo (10% de suero en el 0,05% PBST) para las 24 horas. </li><li> Incubar el tejido con el anticuerpo primario para identificar el contenido del epitelio, de conejo anti-citoqueratina a una concentración de 1:500 diluido en 1,5 ml de solución de bloqueo con 5% de DMSO durante 48 horas de grabación. </li><li> Lávese las muestras de cuatro veces con PBST 0,05% durante 30 minutos cada uno. </li><li> Incubar el tejido con anticuerpos fluorescentes secundaria (1:100 de cabra anti-conejo Alexa555), diluida en solución de 1,5 ml de bloqueo que contienen un 5% de DMSO durante 48 horas de grabación. </li><li> Lavado de las muestras una vez más con PBST 0,05% cuatro veces durante 30 minutos cada uno. </li></ol> 4. Tomografía óptica de proyección Tomografía por proyección óptica es una técnica de microscopía desarrolladas previamente para producir imágenes de alta resolución en 3D de las muestras biológicas fluorescentes con un espesor de hasta 15 milímetros 5. <ol><li> Montar el sgel sostenido de bajo punto de fusión al 1% de agarosa y se deshidratan en el 100% de metanol durante 24 horas. Clara muestra de la solución en Babb (1:2 alcohol bencílico, benzoato de bencilo) para 48 horas de grabación y escanear con el escáner OPT 3001M (Bioptonics). </li><li> Tanto el objetivo como la autofluorescencia se capturaron con el conjunto de filtros Cy3 (excitador 545nm/30 nm, emisor 610/75 nm) y GFP1 conjunto de filtros (excitación 425nm/40 nm, emisor LP475 nm), respectivamente. </li></ol> 5. La reconstrucción y cuantificación 3D <ol><li> El conjunto de proyecciones angular adquirida por OPT puede ser reconstruido utilizando NRecon software (SkyScan) para crear una serie de cortes de sección transversal a través de la invasión de ensayo. Este software está disponible para descargar de forma gratuita en <a href="http://www.skyscan.be/products/downloads.htm">http://www.skyscan.be/products/downloads.htm</a> . </li><li> Analizar los datos reconstruidos utilizando el software Volocity (PerkinElmer). Software de demostración gratuita está disponible para su descarga en <a href="http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/">http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/</a> . </li><li> Con el fin de cuantificar el volumen epiteliales mediante tinción con citoqueratina, establecer un umbral voxel intensidad mínima para reducir la interferencia de la fluorescencia de fondo en el canal de destino. Hemos definido este umbral empíricamente en 9000 au Usando una lista de parámetros disponibles en la aplicación de medición, hemos cuantificado el volumen de epitelio en continuidad con el núcleo original (demarcada en el canal de autofluorescentes). Esto nos permitió cuantificar los volúmenes de derivación epitelial entre diferentes las muestras tumorales. </li></ol> 6. Los resultados representativos: Durante el desarrollo de la prueba, un total de cáncer de mama 52 muestras de biopsia con una amplia gama de histopatología se han utilizado. De estos &lt;10% (5 / 52) no ha facilitado al menos un ensayo de invasión viable. El fracaso del ensayo se debe a bacterias o supra-infección o material insuficiente la biopsia del tumor. Por lo tanto la aplicación de la prueba no se limita a un subtipo específico de cáncer de mama. Ensayos típicos (figura 1) fija después de 20 días en la cultura de colágeno y posteriormente teñidos para citoqueratina. Volocity software es capaz de reconocer tanto la mayor parte del epitelio continuo con el núcleo original y los grupos separados de células invasoras y cuantificar cada volumen por separado. <img src="/files/ftp_upload/3085/3085fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Invasión ensayos posteriores a la fijación y cuantificación. El ensayo apoya las muestras obtenidas de múltiples subtipos de cáncer de mama: a) ER + b) HER2 + y c) ER-

<ol><li>Lopez-Garcia, M. A., Geyer, F. C., Lacroix-Triki, M., Marchio, C., Reis-Filho, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+precursors+revisited%3A+molecular+features+and+progression+pathways.+Histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Breast cancer precursors revisited: molecular features and progression pathways. Histopathology.</a> 57, 171-192 (2010).</li>
<li>Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-dependent+versus+-independent+cancer+cell+invasion+programs%3A+three-dimensional+amoeboid+movement+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited.</a> J Cell Biol. 185, 11-19 (2009).</li>
<li>Dabrosin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+extracellular+local+levels+of+estradiol+in+normal+breast+in+vivo+during+the+luteal+phase+of+the+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Increased extracellular local levels of estradiol in normal breast in vivo during the luteal phase of the menstrual cycle.</a> J Endocrinol. 187, 103-108 (2005).</li>
<li>Alanentalo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+molecular+imaging+and+3D+quantification+within+adult+mouse+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs.</a> Nat Methods. 4, 31-33 (2007).</li>
<li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li>
<li>Hidalgo-Carcedo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+requires+suppression+of+actomyosin+at+cell-cell+contacts+mediated+by+DDR1+and+the+cell+polarity+regulators+Par3+and+Par6%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration requires suppression of actomyosin at cell-cell contacts mediated by DDR1 and the cell polarity regulators Par3 and Par6.</a> Nat Cell Biol. 13, 49-58 (2011).</li>
<li>Katz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+on+the+HER2+amplicon%2C+C35%2C+is+an+oncogene+in+breast+cancer+whose+actions+are+prevented+by+inhibition+of+Syk%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">A gene on the HER2 amplicon, C35, is an oncogene in breast cancer whose actions are prevented by inhibition of Syk.</a> Br J Cancer. 103, 401-410 (2010).</li>
<li>Timpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Regulation+of+RhoA+Activity+during+Pancreatic+Cancer+Cell+Invasion+Driven+by+Mutant+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53.</a> Cancer Res. 71, 747-757 (2011).</li>
</ol>

SEW y JF son empleados por MRC Technology, que está comercializando Bioptonics escáneres OPT. Otros autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

A base de colágeno ensayos para estudiar el comportamiento de líneas celulares de cáncer son ampliamente utilizados 6,7,8. Sin embargo, estos ensayos no han reflejado en su totalidad la complejidad del tumor y su entorno. En este estudio, mostramos que los materiales de cáncer de mama humano puede ser utilizado de una manera similar, ex vivo. Además, OPT es una herramienta útil para caracterizar la expansión 3D de cáncer de mama. Se encontró que la principal limitación de esta técnica es la disponibilidad de materiales tumor (una sola biopsia con aguja gruesa es suficiente para 4-6 ensayos). Otro factor limitante es que la invasión estructural sólo se produce en aproximadamente el 40% de los ensayos. Para superar esto, que regularmente agregar cualquier tratamiento deseado alrededor del día 7 a todos los ensayos con un crecimiento visible. El uso de los territorios palestinos ocupados podría ampliarse en el futuro para detectar también cambios masivos, ex vivo, que resulta del tratamiento de drogas. Esto a su vez podría facilitar el tratamiento del cáncer más individualizada, independiente de los modelos animales. Actualmente estamos explorando la respuesta de los tumores RE + al tamoxifeno ex vivo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo N º </td></tr><tr><td> Completa MEGM </td><td> Lonza </td><td> CC-3150 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8900 10X1L </td></tr><tr><td> β-estradiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E8875-250MG </td></tr><tr><td> Conejo anti-citoqueratina </td><td> Dako </td><td> Z0622 </td></tr><tr><td> Cabra anti-conejo Alexa555 </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td></tr></tbody></table> Todos los reactivos otra norma se obtuvieron de Sigma-Aldrich

a largo plazo la cultura de muestras humanas del cáncer de pecho y su análisis mediante tomografía óptica de proyección

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

El cáncer de mama es la principal causa de mortalidad en el mundo occidental. Es bien sabido que la propagación del cáncer de mama, en primer lugar a nivel local y distal más tarde, es un factor importante en el pronóstico del paciente. Sistemas experimentales de cáncer de mama se basan en las líneas celulares derivadas de tumores por lo general primario o derrames pleurales. Dos grandes obstáculos dificultan esta investigación: (i) algunos conocidos subtipos de cáncer de mama (tumores pronóstico notablemente pobre luminal B) no están representadas en colecciones de la línea actual, (ii) la influencia del microambiente tumoral no se suele tener en cuenta. Se demuestra una técnica de cultivo primario especímenes de cáncer de mama de todos los subtipos. Esto se logra mediante el uso de tres dimensiones (3D) de los sistemas de cultivo en el que pequeños trozos de tumor están incrustados en el colágeno de rata suave que amortigua. El plazo de 2-3 semanas, las células tumorales se propagan en el colágeno y la forma de diversas estructuras similares a los observados en tumours1 humanos. Adipocitos viables, las células epiteliales y fibroblastos en el núcleo original se hicieron evidentes en la histología. Células epiteliales malignos con morfología escamoide se demostró en la invasión de colágeno circundante. Pleomorfismo nuclear fue evidente dentro de estas células, junto con figuras de mitosis y cuerpos apoptóticos. Hemos empleado la tomografía óptica de proyección (OPT), una tecnología de imagen 3D, con el fin de cuantificar el grado de diseminación del tumor en la cultura. Hemos utilizado OPT para medir el volumen de la masa de la cultura del tumor, un parámetro de una medida rutinaria en el tratamiento neo-adyuvante de pacientes con cáncer de mama para evaluar la respuesta al tratamiento farmacológico. Aquí, se presenta una oportunidad para los tumores de mama humanos sin cultura sub-tipo de prejuicios y cuantificar la propagación de los ex vivo. Este método podría ser utilizado en el futuro para cuantificar la sensibilidad de la droga en el tumor original. Esto puede proporcionar un modelo más predictivo que las líneas celulares actualmente en uso.

Hemos desarrollado una base de colágeno en el ensayo in vitro, que promueve la proliferación y la invasión de las muestras de todos los subtipos de cáncer de mama. Tomografía óptica de proyección, una técnica de tres dimensiones se utilizó la microscopía para visualizar y cuantificar la expansión del tumor. Este ensayo puede ser utilizado para cuantificar la respuesta al fármaco de las muestras tumorales individuales.

A largo plazo la cultura de muestras humanas del cáncer de pecho y su análisis mediante tomografía óptica de proyección

El cáncer de mama es una de las principales causas de mortalidad en el mundo occidental. Está bien establecido que la propagación del cáncer de mama, primero de forma local y posteriormente...

El objetivo general de este procedimiento es crear un cultivo a largo plazo de tejido de cáncer de mama primario y cuantificar el patrón de crecimiento tridimensional. Esto se logra primero extrayendo colágeno tipo uno de las colas de rata. A continuación, se prepara la muestra de biopsia de cáncer y se incrusta en la matriz de colágeno.Tras 20 días en cultivo, el tejido de cáncer de mama se tiñe mediante inmunofluorescencia y se escanea utilizando tomografía de proyección óptica, y los datos se reconstruyen y cuantifican. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el patrón de invasión del tumor de un individuo, el cual puede cuantificarse aún más mediante análisis tridimensional. La principal ventaja de los cultivos ex vivo es que utiliza materiales cancerosos reales en un contexto fisiológico.A diferencia de los cultivos de líneas celulares, la demostración visual de esta técnica es importante, ya que es difícil obtener tejido canceroso primario. La técnica correcta optimizará las posibilidades de un resultado experimental exitoso. Esta técnica será demostrada por mí y por Joanne Farrell de MRC Technology, para comenzar la extracción de colágeno tipo uno.Coloque las colas congeladas de rata en etanol al 70 % hasta que se descongelen. Con un escalpelo, retire la piel superficial para exponer los tendones, separe los tendones de la cola y colóquelos en etanol al 70 % para esterilizarlos. Pese los tendones recolectados y transfiéralos al ácido acético.Agite durante 48 horas a cuatro grados Celsius. A continuación, centrifugue la mezcla de tendón y ácido acético a 10.000 ×g durante 30 minutos y deseche el precipitado.Añada un volumen igual de cloruro de sodio al 10% al sobrenadante S y deje la mezcla en reposo durante la noche a cuatro grados Celsius. Pipete la capa superior y deséchela. Luego, recoja la capa inferior insoluble rica en colágeno y centrifugue durante 30 minutos a 10.000 veces.Luego, resuspender por gravedad el material rico en colágeno en ácido acético 0,25 molar a cuatro grados Celsius y pipetear en una bolsa de diálisis. Dializar frente a una a 1000 partes de ácido acético a cuatro grados Celsius durante tres días.Cambiando el tampón de diálisis dos veces al día. El colágeno puede esterilizarse adicionalmente mediante otro paso de centrifugación y suspensión en ácido acético para este ensayo. Comience con múltiples biopsias por núcleo que se hayan obtenido de pacientes que dieron su consentimiento en el momento de la resección quirúrgica curativa por cáncer de mama invasivo, a simple vista y utilizando un escalpelo.Divida la muestra en fragmentos de un milímetro cúbico, recorte y deseche cualquier grasa macroscópicamente distinta. Montar la muestra sobre una hoja de bisturí permite una mejor visualización dentro de la campana y hace que la disección sea precisa y segura. Sumerja los fragmentos en medio MEGM completo.El tejido puede almacenarse en este estado durante hasta una hora para crear una mezcla de gel de colágeno de 0,3 miligramos por mililitro. Mezcle en hielo colágeno de cola de rata a un miligramo por mililitro, ácido acético filtrado de 1 a 1000, D-M-E-M-F 12 diez veces y hidróxido de sodio 0,22 molar. Pipetee 1,2 mililitros de la mezcla de colágeno en cada pocillo individual de una placa de 24 pocillos y colóquela en un incubador a 37 grados Celsius durante 10 minutos. Para iniciar la gelificación, retire la placa del incubador.Coloque los fragmentos de tumor sobre el colágeno gelificado y utilice la punta de una pipeta de 10 microlitros para empujarlos suavemente hacia el centro del gel. Devuelva la placa al incubador durante una hora. Suplemente el medio completo A-M-E-G-M con beta-estradiol hasta una concentración final de 3,2 veces 10 a la menos 10 molar.Una vez que los ensayos con geles hayan incubado durante una hora, introduzca cuidadosamente 1,2 mililitros del medio suplementado en cada pocillo. La concentración final de beta-estradiol se equilibrará a 1,6 veces 10 a la menos 10 molar para recapitular los niveles fisiológicos de estrógeno presentes en el tejido mamario. Pase la punta de una pipeta de 10 microlitros alrededor del borde interno de cada pocillo, liberando cada gel de forma circunferencial, permitiendo así que cada gel flote libremente dentro del medio.Devuelva la placa de 24 pocillos al incubador y cambie el medio suplementado dos veces por semana hasta la finalización del experimento. El crecimiento invasivo puede observarse en tiempo real mediante un microscopio de campo claro aquí. Un video con captura de retardo temporal y enfoque extendido de profundidad demuestra la invasión del epitelio desde el borde del tumor hacia el colágeno circundante durante 60 horas, desde el día siete hasta el nueve.Finalice el experimento eliminando el medio y agregue una fórmula. Fijativo durante 48 horas para inmunotincionar las muestras del ensayo 3D para tomografía de proyección óptica. Primero transfiera el formal en especímenes fijados desde los pocillos a un vial.Luego, lavar durante 30 minutos. Realizar una deshidratación escalonada de los geles utilizando metanol diluido en PBS que contenga Tween 20 al 0,05 %, e incubar el tejido en metanol DMSO peróxido de hidrógeno al 30 % recién preparado en una proporción de dos a uno a tres a temperatura ambiente durante 24 horas para suprimir la autofluorescencia. A continuación, lavar las muestras dos veces durante 30 minutos.En el congelamiento-descongelamiento con metanol, someta las muestras a cinco ciclos de temperatura desde menos 80 grados Celsius hasta temperatura ambiente, durante al menos una hora cada vez, para asegurar que los antígenos en las partes más profundas del tejido queden accesibles. Luego, rehidrate el tejido nuevamente en PBS con 0,05 %T entre 20 utilizando metanol como diluyente, incube el tejido en solución bloqueante durante 24 horas a cuatro grados Celsius para identificar el contenido epitelial, incube las muestras en anticuerpos primarios de conejo anti-citoqueratina diluidos en 1,5 mililitros de solución bloqueante con 5 %DMSO durante 48 horas a cuatro grados Celsius. Lave las muestras en PBS con 0,05 %T entre 24 veces durante 30 minutos cada una.Incubar el tejido en anticuerpos secundarios fluorescentes, diluidos en 1,5 mililitros de solución bloqueante que contiene 5% DMSO durante 48 horas a cuatro grados Celsius. Lavar las muestras nuevamente en PBS con 0,05% entre 24 veces durante 30 minutos cada una. Para preparar las muestras para la tomografía de proyección óptica, montar el gel teñido en agarosa al 1% de punto de fusión bajo y deshidratar en metanol al 100% durante 24 horas.A continuación, aclare la muestra en solución BABB durante 48 horas. Escanee las muestras utilizando el escáner OPT 3001 M. Tanto la señal objetivo como la autofluorescencia se capturan usando los conjuntos de filtros SI tres y GFP uno, respectivamente.El espécimen se sostiene en un cilindro transparente de gel de aro y se rota en pasos angulares de 0,9 grados. Se toma una imagen digital del espécimen estático en cada una de las 400 posiciones rotadas. Utilice el software n recon para reconstruir el conjunto de proyecciones angulares adquiridas en OPT, creando una serie de cortes transversales a través del ensayo de invasión.Analice los datos reconstruidos utilizando software de velocidad para cuantificar el volumen epitelial mediante citokeratina. Tiña, establezca un umbral mínimo de intensidad de vóxel para reducir la interferencia del fondo de fluorescencia en el canal objetivo. Aquí, este umbral se define empíricamente en 9.000 unidades arbitrarias.Finalmente, utilice una lista de parámetros disponibles en la aplicación de medición y los datos del canal autofluorescente, que delimita el epitelio continuo con el núcleo original, para cuantificar el volumen de epitelio en una proliferación tumoral. Aquí se muestra un ensayo típico fijado tras 20 días en cultivo con colágeno y posteriormente teñido para citokeratina. El software Velocity es capaz de reconocer tanto la masa epitelial, continua con el núcleo original, como los grupos desprendidos de células invasoras, y cuantificar cada volumen por separado.Las biopsias originales obtenidas procedían de una variedad de tumores tras cultivos ex vivo. También se podrían utilizar otras técnicas, como inmunohistoquímica o inmunofluorescencia, para determinar tasas de proliferación o apoptosis o cualquier cosa similar. El desarrollo de esta técnica ha permitido a los investigadores en el campo de la investigación traslacional del cáncer de mama explorar métodos para identificar la resistencia a fármacos en personas con cáncer de mama.

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Fuente: Huang, Y. et. al., Seguimiento morfológico y fisiológico longitudinal de esferoides tumorales tridimensionales mediante tomografía de coherencia óptica. J. Vis. Exp. (2019)Este video muestra el uso de la coherencia óptica tomografía (OCT) para monitorear los esferoides tumorales en una placa de pocillos múltiples mediante la captura de imágenes transversales de alta resolución. Mediante el análisis de los reflejos de la luz de las estructuras celulares, OCT construye modelos 3D para...

Seguimiento morfológico y fisiológico de esferoides tumorales mediante tomografía de coherencia óptica 

Masas de tejido complejo, de órganos a los tumores, se componen de diversos elementos celulares. Hemos dilucidado la contribución de los fenotipos celulares dentro de un tejido utilizando ratones transgénicos fluorescentes de múltiples etiquetados en combinación con la tinción de inmunofluorescencia seguido de multiparamétrico desmezcla espectrales de descifrar origen celular, así como características de células basado en la expresión de proteínas.

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El análisis ex vivo de lesiones arteriales a partir de modelos animales de enfermedad cardiovascular se basa clásicamente en técnicas histológicas e inmunohistoquímicas. Estos proporcionan mediciones bidimensionales en lesiones tridimensionales. Este manuscrito describe la generación de lesiones arteriales para análisis cuantitativo en 3 dimensiones mediante tomografía óptica de proyección.

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Cultivo tridimensional de células epiteliales mamarias sobre una membrana basal reconstituida es un método útil para recapitular la arquitectura in vivo de la benigna de la mama, y para diferenciar el fenotipo maligno de la fenotipo benigna de la mama. Es importante destacar que este sistema se puede aplicar para estudiar los carcinomas invasivos en otros tejidos.

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Protocolos se describen para el estudio de la migración de células de cáncer de mama, la proliferación y la colonización en un sistema modelo de explante de tejido óseo humano.

Métodos de explantes de tejidos El cultivo fémur humano para el Estudio de la colonización de la célula del cáncer de pecho de la Niche metastásico

Tomografía de coherencia óptica (OCT), una tecnología de imagen tridimensional, fue utilizada para monitorear y caracterizar la cinética de crecimiento de esferoides multicelulares tumor. Cuantificación volumétrica precisa de esferoides tumorales usando un voxel contando el enfoque y la detección de tejido libre de etiqueta muerto en esferoides basado en contraste intrínseco atenuación óptica, fueron demostrados.

Longitudinal control morfológico y fisiológico de esferoides tumorales tridimensional mediante tomografía de coherencia óptica

Los cultivos tridimensionales de muestras BMPC pacientes y xenoinjertos de cáncer de próstata metastásico óseo mantienen la heterogeneidad funcional de sus tumores originales, lo que resulta en quistes, esferoides y organoides complejos similares a tumores. Este manuscrito proporciona una estrategia de optimización y protocolo para el cultivo 3D de muestras derivadas de pacientes heterogéneos y su análisis utilizando IFC.

Establecimiento y Análisis de Organoides Tridimensionales (3D) Derivados de los Especímenes de Metastasis ósea del Cáncer de Próstata del Paciente y sus Xenoinjertos

Los organoides derivados del paciente (DOP) son una herramienta poderosa en la investigación traslacional del cáncer, que refleja tanto la heterogeneidad genética y fenotípica de la enfermedad como la respuesta a las terapias personalizadas contra el cáncer. Aquí, se detalla un protocolo consolidado para generar DOP de cáncer de vejiga primario humano en preparación para la evaluación de análisis fenotípicos y respuestas a medicamentos.

Cultivo de organoides del cáncer de vejiga como herramientas de medicina de precisión

Describimos un protocolo para la producción, cultivo y visualización de cánceres humanos, que han hecho metástasis a las superficies peritoneales. Las muestras tumorales resecadas se cortan con un vibratomo y se cultivan en insertos permeables para aumentar la oxigenación y la viabilidad, seguidas de imágenes y análisis posteriores mediante microscopía confocal y citometría de flujo.

Cultivo e imágenes de cortes tumorales organotípicos ex vivo de pseudomixoma peritonei a partir de muestras tumorales humanas resecadas

Aquí se proporciona un protocolo detallado para establecer organoides mamarios humanos a partir de resecciones de tumores de mama derivados de pacientes o tejido mamario normal. El protocolo proporciona instrucciones completas paso a paso para el cultivo, la congelación y la descongelación de organoides mamarios derivados de pacientes humanos.

Establecimiento y cultivo de organoides mamarios derivados de pacientes

Este protocolo ofrece un marco sistemático para el establecimiento de organoides de cáncer de ovario de diferentes estadios de la enfermedad y aborda los desafíos de la variabilidad específica del paciente para aumentar el rendimiento y permitir una expansión robusta a largo plazo para aplicaciones posteriores. Incluye pasos detallados para el procesamiento de tejidos, la siembra, el ajuste de los requisitos de medios y la tinción de inmunofluorescencia.

Estrategia para el biobanco de organoides de cáncer de ovario: abordaje de la heterogeneidad entre pacientes en los subtipos histológicos y los estadios de la enfermedad

Aprende a cultivar tejido primario de cáncer de mama en matriz de colágeno durante 20 días y cuantificar patrones de invasión tridimensional mediante tomografía óptica de proyección. Este método permite evaluar respuestas individuales a fármacos.

A largo plazo la cultura de muestras humanas del cáncer de pecho y su análisis mediante tomografía óptica de proyección

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