Mapeo de los circuitos neuronales inhibitorios por Laser Scanning fotoestimulación

El objetivo general de este procedimiento es investigar la organización funcional local de los circuitos neuronales inhibidores. El procedimiento comienza con la preparación de cortes de cerebro vivos de la corteza somatosensorial primaria de ratones. El siguiente paso es visualizar y registrar los tipos de células inhibidoras que expresan GFP específicos en el corte de cerebro.

Tras esta fotoestimulación de barrido láser mediante glutamato, el desenjaulamiento se utiliza para activar pequeños grupos de neuronas presinápticas como excitadoras o inhibidoras. Las corrientes postsinápticas se registran en la GFP expresando interneuronas. El paso final es pasar por la fotoestimulación, el análisis de datos y generar mapas cuantitativos de la entrada sináptica a las neuronas registradas.

En última instancia, la fotoestimulación de escaneo láser combinada con registros de células completas permite la construcción de mapas detallados de entradas sinápticas a tipos específicos de neuronas inhibidoras, lo que puede permitir determinar la organización y función de los circuitos corticales inhibitorios locales. La técnica basada en la fotoestimulación fue iniciada por el Dr. Larry Katz, Ned Calloway, y desarrollada posteriormente por el Dr. Carols Waboda, mi pi, el Dr. Xing Z entrenado con el Dr. Dr. Calloway, el Instituto Salk, donde dirigió muchos estudios que investigaban los circuitos interorales. En la actualidad, nuestro grupo está ampliando y continuando estos estudios, investigando los circuitos interorales.

Para comenzar este procedimiento, se sacrifica un ratón transgénico en el postnatal de dos a tres semanas por decapitación y se extrae rápidamente el cerebro, se coloca el cerebro en una solución de corte congelada y oxigenada. A continuación, utilice las gafas GFP para examinar visualmente el cerebro y comprobar la expresión de GFP. A continuación, corta la corteza somatosensorial primaria en secciones de 400 micrómetros de grosor con un vibrador.

Incubar las rodajas en la sacarosa que contiene un líquido cefalorraquídeo burbujeado con 95% de O2 y 5% de CO2 a 32 grados centígrados durante 30 minutos a una hora. Después de eso, transfiera las rodajas al CSF A regular a temperatura ambiente para que el láser esté listo para el experimento, encienda el sistema de enfriamiento del láser y la fuente de alimentación. Luego encienda todo el hardware relacionado con el control de fotoestimulación, incluido el sistema de espejo de escaneo y el modulador óptico y el obturador electrónico, y un amplificador de entrada de fotodiodo.

A continuación, encienda el equipo electrofisiológico, como el amplificador multi clamp 700 B y los micromanipuladores. Los registros electrofisiológicos, la fotoestimulación y las imágenes se llevan a cabo en la cámara de perfusión de cortes montada en la platina motorizada del microscopio. Después de eso, encienda la cámara de imágenes, el corte se visualizará en el microscopio vertical con DIC infrarrojo y óptica epifluorescente a través del sistema de imágenes.

A continuación, abra el software FS basado en MATLAB y el software de la cámara de captura Q en el monitor. Antes de realizar el experimento, compruebe el sistema de fotoestimulación láser y asegúrese de que esté en un estado de funcionamiento. Coloque una hoja de papel debajo del objetivo del microscopio de cuatro x para observar el patrón de escaneo láser mientras el sistema está funcionando.

Para hacer el microelectrodo con una resistencia de cuatro a seis mega OM, tire de un electrodo de vidrio con el extractor de pipetas. A continuación, llene el electrodo con una solución interna que contenga un 0,1% de biotina para el marcaje de las células y la identificación morfológica. A continuación, encienda el sistema de perfusión presurizado para bombear un líquido cefalorraquídeo A a la cámara.

Asegure un nivel de líquido constante de 2,0 milímetros por encima del corte en la cámara. Se añade una alícuota de la solución madre de glutamato enjaulado MNI a 25 mililitros de líquido cefalorraquídeo A circulante para una concentración de 0,2 milimolares de glutamato enjaulado. A continuación, transfiera un trozo de cerebro a la cámara de grabación.

Ejecute el sistema de imágenes para verificar la calidad del corte y ubicar anatómicamente el área somatosensorial primaria. A continuación, ancla el corte con un anillo de platino con cuerda hecho a medida y ten cuidado de no poner el ancla sobre la región del cerebro destinada a la grabación. Visualice las células con un objetivo de 60 x basado en la visualización de la expresión de GFP bajo un microscopio fluorescente DIC.

Identificar y seleccionar los tipos de células inhibidoras. Tenga en cuenta que la grabación se realizará bajo control visual con la ayuda de DIC infrarrojo. Es necesario el monitoreo de video y el cambio entre los modos DIC y fluorescente para confirmar la ubicación de la celda GFP mientras se baja el electrodo a la celda objetivo.

Utilizando la técnica convencional de sujeción de parches. Primero, aplique presión positiva al electrodo. Acérquelo a la superficie de la célula para establecer un hoyuelo discernible en la membrana celular objetivo.

A continuación, aplique presión negativa rápidamente para formar un giga sello y romperse en la celda mientras supervisa las respuestas de inyección actuales en el monitor de vídeo. Al entrar, tome las imágenes de la GFP registrada que expresa intra neurona con un aumento de 60x en los modos DIC y fluorescente para la verificación en línea. Antes de recopilar los datos de fotoestimulación, inyecte pulsos de corriente hiperpolarizantes y despolarizantes para examinar las propiedades electrofisiológicas básicas de cada célula.

Una vez estable, se logra el registro de toda la célula con una buena resistencia de acceso, que suele ser inferior a 20 mega ohmios, cambie el objetivo del microscopio de 60 x a cuatro aumentos para la fotoestimulación de escaneo láser, adquiera una imagen de corte con cuatro aumentos y utilícela para guiar y registrar los sitios de fotoestimulación. Configure los parámetros de fotoestimulación y adquisición de datos activando el módulo de interruptor de configuración de phys. Utilice un pulso láser de un milisegundo de aproximadamente 20 milivatios con un intervalo de estímulo de un segundo.

Para el mapeo de fotoestimulación, adquiera trazas de datos de un segundo muestreado a 10 kilohercios. A continuación, cargue la imagen de cuatro cortes x en el módulo mapeador de phys. Defina la ubicación del soma y configure los sitios de fotoestimulación de un patrón de 16 por 16 con 80, micrómetro por 80 micrómetros.

Espaciado alrededor de la ubicación de la célula, que cubre todas las capas corticales. A continuación, mapee el perfil de excitación de la neurona registrada examinando las ubicaciones de los picos en respuesta a la fotoestimulación en el modo de pinza de corriente. Nuestro software fácil de usar con funciones de visualización en línea facilita los experimentos de mapeo.

Después de eso, mapee las conexiones del circuito excitatorio local detectando las corrientes postsinápticas excitatorias de la celda registrada Con escaneo láser en diferentes ubicaciones, sostenga la celda a menos 70 milivoltios en modo de pinza de voltaje para detectar corrientes excitatorias internas. A continuación, repita los mapas de corriente postsináptica excitatoria dos o tres veces con el patrón de fotoestimulación girado o invertido. Para mapear las conexiones de los circuitos inhibitorios locales, detecte las corrientes postsinápticas inhibitorias de la celda registrada.

Sostenga la celda cerca de cero milivoltios en este caso, menos 15 milivoltios en modo de pinza de voltaje para detectar corrientes inhibitorias externas. Después de completar todos los ensayos fisiológicos, retire el electrodo suavemente de la celda registrada. Retire el trozo de cerebro de la cámara, luego fíjelo en formaldehído al 4% durante la noche y tiña las células registradas con biotina.

En este experimento, se utiliza la combinación de la expresión de GFP, la electrofisiología intrínseca y las características morfológicas para clasificar las neuronas inhibidoras. Mostrado. Aquí está el ejemplo y un mapa de datos sin procesar para ilustrar la fotoestimulación de escaneo láser, que permite un mapeo extenso de las conexiones de circuitos corticales locales a la neurona inhibidora registrada. Aquí están los ejemplos de los mapas de entrada cuantitativos codificados por colores derivados de los trazos sin procesar que se muestran en la Figura D. Las amplitudes de los eventos sinápticos detectados en las interneuronas registradas están codificadas por colores y superpuestas topográficamente a las ubicaciones de fotoestimulación.

La ubicación del cuerpo de la célula se indica mediante el círculo rojo abierto en la barra de escala. Los colores cálidos indican entradas sinápticas fuertes y los colores fríos indican una conectividad débil o nula con la célula objetivo. De manera similar, la figura E presenta el número de eventos sinápticos por ubicación de descarga muestreada a la neurona registrada.

La Figura F muestra el tiempo de inicio del primer evento sináptico detectado a la célula registrada después de la fotoestimulación en la barra de escala. Los colores cálidos indican una entrada corta, latencia, y los colores más fríos indican latencias sinápticas más largas. Por lo tanto, LSPS permite la construcción de mapas detallados de la posición, la fuerza, la latencia y el número de entradas que inciden en tipos específicos de neuronas inhibidoras.

Bueno, asistiendo a este procedimiento, es importante ser paciente, hacer la condición limpia del experimento, pero neurona de manera efectiva y muy cuidadosa para cambiar de objeto de alto aumento a baja modificación. Luego, el último uso del software de tierra muy bien.