Teratoma generación en la cápsula del testículo
7 de noviembre de 2011
Las células madre pluripotentes (hPSCs) tienen el potencial para tratar una gran variedad de enfermedades diferentes. La utilidad de estas células reside en el hecho de que pueden diferenciarse en cualquier tipo de célula en el cuerpo. Aquí se describe el ensayo de teratoma, que se utiliza para demostrar la pluripotence de hPSCs.
El objetivo general de este procedimiento es evaluar la pluripotencialidad mediante la generación de teratomas en la cápsula testicular de ratones inmunodeprimidos utilizando células madre pluripotentes humanas o H PSCs. Comience por cosechar un cultivo de las H PSCs putativas que se van a probar para determinar su pluripotencialidad. A continuación, realice una cirugía para exponer los testículos del ratón e inyecte las células en la cápsula testicular.
Coloque los testículos de nuevo en su ubicación original y cierre quirúrgicamente al ratón; después de seis a doce semanas, examine el tumor resultante mediante histología para verificar la presencia de células de cada capa germinativa. En última instancia, los resultados pueden demostrar que una línea de CPE es verdaderamente pluripotente al mostrar que puede diferenciarse en células de las tres capas germinativas en un ratón inmunodeficiente. Aunque recientemente se han descrito nuevos métodos para demostrar la pluripotencia de células madre humanas, el ensayo de teratoma sigue siendo el estándar de oro en el campo para demostrar el procedimiento será tron, un técnico sénior en mi laboratorio de cultivo.
Cultivar las células madre pluripotentes humanas hasta alcanzar confluencia y luego disociar los HPSE con Accutase, contar las células y re-suspender 1 millón de HPC por inyección. Primero afeite el abdomen de ratones machos de seis semanas de edad anestesiados, de una cepa de ratón inmunocomprometida, utilizando una máquina cortapelos. Limpie la pared anterior del abdomen del ratón con solución de povidona-yodo, comenzando desde el centro del abdomen y moviéndose en sentido horario hacia afuera.
Luego, lave el área afeitada con etanol al 70 %. Repita el proceso tres veces, cambiando los hisopos cada vez. Para realizar el procedimiento quirúrgico, transfiera el animal a una almohadilla calefactora dentro de una campana estéril con tijeras quirúrgicas estériles.
Realice una incisión longitudinal de un centímetro a través de la piel y el peritoneo justo por debajo del nivel de la articulación de la cadera mientras sostiene el peritoneo con pinzas. Alcance hacia abajo en dirección de la cadera derecha con otro par de pinzas estériles y extraiga el tejido graso blanco junto con los testículos adheridos. Ahora llene una jeringa tuberculínica de un CC con las cphs que se van a inyectar. Inyecte lentamente de 20 a 30 microlitros de cphs en el centro de la cápsula testicular, alejado de cualquier vaso sanguíneo importante.
Retire la aguja lentamente para evitar el reflujo de las células utilizando pinzas. Devuelva los testículos y el tejido adiposo a su posición original en el abdomen. Cierre el peritoneo con dos o tres suturas reabsorbibles y cierre la piel con grapas automáticas.
Después de la cirugía, administre analgesia dos veces al día según sea necesario. Monitoree al animal para detectar crecimiento tumoral palpable durante un período de seis a doce semanas. Cuando el tamaño del tumor alcance aproximadamente cinco milímetros, retire el tumor del ratón sacrificado para su documentación.
Fotografíe el tumor y mida su tamaño y peso. Luego, corte el tumor en trozos pequeños y fíjelos en una solución de paraformaldehído al 4% para histopatología. Típicamente, se observa un teratoma después de seis a doce semanas.
En este ejemplo, se inyectaron un millón de células madre pluripotentes humanas WA oh nueve en la cápsula testicular de un ratón inmunodeficiente. El examen detallado del teratoma revela heterogeneidad y muchos quistes adyacentes. Como era de esperar.
Los análisis histopatológicos indican la presencia de células de cada una de las tres capas germinales. Al intentar este procedimiento, es importante recordar incluir una línea celular de control positivo que se sepa que es bastante potente, para asegurarse de que el ensayo se realizó correctamente. Después de ver este video, deberías tener una buena idea de cómo determinar si una línea de células madre humanas es pluripotente o no.
Descripción general
Este artículo trata sobre el ensayo de teratoma, un método utilizado para evaluar la pluripotencia de las células madre pluripotentes humanas (hPSCs). El ensayo consiste en inyectar hPSCs en la cápsula del testículo de ratones inmunocomprometidos y examinar los teratomas resultantes en busca de diferenciación en diversos tipos celulares.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Biología de Células Madre
- Medicina Regenerativa
- Histopatología
Antecedentes
- Las células madre pluripotentes humanas pueden diferenciarse en cualquier tipo celular.
- La formación de teratoma es un indicador clave de la pluripotencia.
- Este ensayo se considera el estándar de oro para demostrar la pluripotencia.
- Existen nuevos métodos, pero el ensayo de teratoma sigue siendo ampliamente utilizado.
Objetivo del estudio
- Demostrar la pluripotencia de las cPSC humanas mediante la formación de teratoma.
- Proporcionar una metodología detallada para realizar el ensayo de teratoma.
- Destacar la importancia de utilizar un control positivo en el ensayo.
Métodos Utilizados
- Recolección de hPSCs y preparación para la inyección.
- Exposición quirúrgica del testículo de ratón e inyección de hPSCs.
- Seguimiento del crecimiento tumoral durante seis a doce semanas.
- Análisis histológico del teratoma para la diferenciación de las capas germinales.
Resultados principales
- Los teratomas se formaron entre seis y doce semanas después de la inyección.
- El análisis histopatológico confirmó la presencia de células de las tres capas germinales.
- Se demostró la eficacia del ensayo de teratoma para evaluar la pluripotencia.
- Se incluyó un control positivo para validar los resultados del ensayo.
Conclusiones
- El ensayo de teratoma es un método confiable para confirmar la pluripotencia de las hPSC.
- Las técnicas quirúrgicas adecuadas y el monitoreo son cruciales para obtener resultados exitosos.
- Estudios futuros podrían explorar métodos alternativos junto con los ensayos tradicionales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El ensayo de teratoma proporciona una lectura funcional de la pluripotencia al demostrar la capacidad de diferenciación en las tres capas germinales in vivo. Este ensayo respalda la validación del blanco y la reducción del riesgo mecanicista en las primeras etapas del desarrollo de terapias basadas en células madre. Permite tener una confianza predictiva en la identidad celular antes de avanzar hacia modelos preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Confirma la pluripotencialidad mediante la verificación de la diferenciación en linajes de ectodermo, mesodermo y endodermo.
- Valor operativo: Utiliza un modelo estandarizado in vivo para reducir los falsos positivos en las afirmaciones de pluripotencialidad.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones de avance o interrupción sobre la idoneidad de una línea de células madre para el desarrollo terapéutico.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera resultados histopatológicos cuantitativos para la representación de las capas germinales.
- Valor operativo: Establece un protocolo reproducible mediante la inyección en la cápsula testicular en ratones inmunocomprometidos.
- Valor estratégico: Facilita la estandarización de ensayos entre laboratorios para pruebas de pluripotencia consistentes.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Valida el potencial de desarrollo de las CPH humanas antes de su diferenciación en progenitores específicos de linaje.
- Valor operativo: Requiere monitoreo durante 6 a 12 semanas para la formación de tumores y análisis histopatológico.
- Valor estratégico: Proporciona información para el avance ajustado al riesgo de líneas de células madre hacia estudios preclínicos de eficacia.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El ensayo de teratoma funciona como una etapa de control en la continuación del descubrimiento de células madre, ubicada tras el mantenimiento de la pluripotencialidad y antes de la diferenciación dirigida o las pruebas preclínicas de eficacia.
- Biología del Descubrimiento: Evalúa la hipótesis fundamental de la pluripotencia mediante la evaluación de la capacidad de diferenciación trilinaje.
- Tamizaje: Genera tasas estandarizadas de formación de teratomas y puntuaciones histológicas para la evaluación comparativa de líneas.
- Análisis: Proporciona resultados específicos por capa germinativa mediante histopatología para cuantificar el potencial de diferenciación.
- Investigación Traductiva: Conecta la confirmación de pluripotencia con flujos de trabajo de diferenciación posteriores para la producción de células relevantes para enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Sirve como un punto de control de pluripotencia reutilizable para múltiples líneas de células madre pluripotentes humanas en el tamizaje de pipelines terapéuticos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la identidad de las células madre al confirmar la pluripotencia funcional.
- Valor operativo: Proporciona resultados estandarizados y reproducibles mediante procedimientos quirúrgicos e histológicos definidos.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al eliminar líneas no pluripotentes al inicio del desarrollo.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización basada en riesgos de líneas de células madre para la inversión en diferenciación y modelado de enfermedades.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cirugía de roedores y técnica estéril para la inyección en la cápsula testicular.
- Depende del acceso a cepas de ratones inmunodeprimidos y a instalaciones para la monitorización postoperatoria.
- Necesita infraestructura de histopatología para la identificación de capas germinales en secciones de teratoma.
- Implica supervisión ética y aprobación del IACUC para el uso de animales en ensayos de tumorigenicidad.
- Limitado por el período de 6–12 semanas, que puede ralentizar campañas de cribado iterativas.
