La cuantificación de la actividad agonista en el G receptores acoplados a proteínas

El objetivo general de este procedimiento es estimar la constante de afinidad relativa KB de un agonista para el estado activo de un receptor mediante el análisis de su curva de respuesta a la concentración. Esto se logra primero midiendo las curvas de respuesta a la concentración de un grupo de agonistas para inducir una respuesta en un receptor acoplado a proteína G. El siguiente paso del procedimiento consiste en estimar los valores de eemax y EC 50 de los agonistas utilizando análisis de regresión no lineal.

Estos valores se utilizan luego para calcular estimaciones iniciales de los parámetros en el análisis subsiguiente de regresión no lineal que involucra el modelo operativo. Como paso final, se obtienen estimaciones relativas de las constantes de afinidad de los agonistas por el estado activo del receptor mediante un análisis de regresión no lineal global de sus curvas de respuesta a la concentración. Finalmente, utilizando una forma modificada del modelo operativo, se puede estimar la constante de afinidad de un agonista por el estado activo de un receptor en relación con la de otro agonista, mediante un análisis de regresión no lineal global de sus curvas de respuesta a la concentración.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del descubrimiento de fármacos, como por ejemplo si un agonista tiene selectividad por una vía de señalización específica. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a los detalles del análisis matemático. Para la estimación de los valores relativos de KB del agonista, se requiere una serie de al menos dos curvas de respuesta frente a concentración de agonista.

Una discusión sobre las consideraciones para estos experimentos puede encontrarse en el protocolo escrito. Después de obtener las curvas de respuesta, reste la respuesta basal de la medida en presencia de cada concentración del agonista para comenzar a ingresar los datos de los experimentos de respuesta a la concentración en una tabla de datos. En el software Prism, todas las concentraciones logarítmicas del agonista se ingresan en la columna etiquetada como X. Las mediciones de respuesta para el agonista que parece tener la respuesta máxima más alta o valor eax se ingresan en la columna A, y las de otros agonistas se ingresan en columnas adyacentes etiquetadas con letras.

Introduzca mediciones por duplicado de curvas de respuesta a la concentración en subcolumnas de una columna con letra determinada. Seleccione la hoja de gráficos en la que se representan los datos y seleccione analizar para analizar los datos mediante un análisis de regresión no lineal utilizando la ecuación de pendiente variable, restrinja el parámetro inferior a cero y realice el análisis de regresión. Registre los parámetros superior y log EC 50 para su uso en el cálculo de las estimaciones iniciales de los parámetros.

Para calcular las estimaciones iniciales de los parámetros, asigne el log tau K observado al valor negativo del log EC 50 del agonista estándar. A continuación, calcule el valor log RAI de cada agonista en prueba como el logaritmo de la cantidad formada por el producto del valor eemax del agonista en prueba multiplicado por el EC 50 del agonista estándar, dividido por el producto del valor emax del agonista estándar multiplicado por el EC 50 del agonista en prueba. En esta ecuación, los parámetros del agonista estándar se indican con un apóstrofo.

Luego asigne la constante de afinidad logarítmica del agonista de prueba al logaritmo negativo de sus valores EC respectivos. Después de introducir los datos en Prism, asegúrese de que los datos del agonista con el valor EMAX más alto se introduzcan en la columna A. Este agonista ahora se designa como estándar, mientras que los otros agonistas se designan como agonistas de prueba. A continuación, introduzca una ecuación definida por el usuario, log RAI, en Prism en varias líneas.

En este caso, la ecuación definida por el usuario incluye un total de cinco agonistas. Ingrese las estimaciones iniciales de los parámetros de bloqueo R y la constante de afinidad de los agonistas en prueba. A M sis se le asigna el valor EMAX del agonista estándar y a M se le asigna un valor de uno.

Ahora ingrese las estimaciones iniciales de los parámetros de los valores de log RAI de los agonistas en prueba. Aplique restricciones de parámetros restringiendo log K uno a cero, y estableciendo log GR, m, sis y M con un valor compartido para todos los conjuntos de datos. A continuación, inicie el análisis de regresión no lineal.

Los resultados proporcionan los valores de log K observado y log RAI de los agonistas en prueba para la estimación de los valores de KB del agonista en unidades absolutas de unidades molares inversas. Se utilizan ensayos celulares in vitro que exhiben actividad constitutiva del receptor. Seleccione los agonistas y diseñe el experimento según se describe en el protocolo escrito. Calcule la actividad constitutiva del receptor y la respuesta a cada concentración de agonista como la respuesta medida menos la respuesta basal en células no transfectadas con el receptor, como se muestra aquí; respuestas a varios agonistas calculadas de esta manera para una vía de señalización que exhibe una actividad constitutiva muy baja para análisis preliminar.

Primero, introduzca los datos en Prism como se describe para la actividad no constitutiva. Acepte. También introduzca la respuesta causada por la actividad constitutiva del receptor en las columnas con letras correspondientes en la fila que corresponde a una concentración logarítmica de agonista de menos 20. Aquí se introduce un logaritmo negativo grande para aproximar una concentración de agonista de cero.

Analice los datos como antes, excepto que para la actividad constitutiva, el parámetro inferior debe restringirse de modo que se comparta entre todos los conjuntos de datos. Registre el parámetro compartido, así como los parámetros superior y log EC para cada agonista. Después de determinar la constante de afinidad logarítmica del agonista estándar en experimentos separados, calcule la estimación inicial del valor log K observado de cada agonista parcial de prueba como el logaritmo de la expresión formada por la diferencia entre el valor emáx del agonista estándar y el agonista de prueba dividida por el producto del EC 50 y la diferencia entre el valor eemáx del agonista estándar y la respuesta constitutiva.

Calcule la estimación inicial del log KB para cada agonista y la estimación inicial del log T cis para estimar los valores de KB del agonista. Ingrese los datos en Prism y luego introduzca una ecuación definida por el usuario. Ingrese log KB en Prism en varias líneas como se muestra aquí para la condición de dos agonistas.

A continuación, introduzca las estimaciones iniciales de los parámetros ingresando la afinidad de cada agonista. La estimación de log T sis estima la estimación de M sis, y a la estimación M sis se le asigna el valor EMAX del agonista estándar, mientras que a M se le asigna un valor de uno. Finalmente, introduzca las estimaciones iniciales de log kb.

Aplique restricciones de parámetros restringiendo log K uno a su valor previamente determinado y estableciendo log T sis, m sis y M con un valor compartido para todos los conjuntos de datos. Inicie el análisis de regresión no lineal. Los resultados proporcionan el log KB del agonista estándar, el log K observado y los valores de log KB de los agonistas parciales.

La respuesta máxima del sistema, el valor log T cys para el complejo del receptor libre y el factor de pendiente del transductor en el modelo operacional mostrado aquí corresponde a la hidrólisis de fosfoinosítidos inducida por agonistas muscarínicos en células de ovario de hámster chino, que expresan establemente el receptor muscarínico M tres. En este ensayo se midieron las curvas de concentración-respuesta de agonistas muscarínicos seleccionados, y los datos se analizaron como se describe aquí para estimar el valor KB de cada agonista expresado en relación con el de Oxo Tremaine M. Las curvas teóricas representan el ajuste por mínimos cuadrados de la ecuación de regresión a los datos. Se muestran las estimaciones del log RAI para kabale, a recline, pilocarpina y McNeil.

Un 3, 4 3. Se determinaron las estimaciones correspondientes de la respuesta máxima del sistema y del factor de pendiente del transductor. También se obtuvieron los valores de log K observados para cada uno de los agonistas mostrados.

Aquí se presentan los resultados de experimentos sobre la hidrólisis de fosfoinosítidos estimulada por agonistas muscarínicos en células HC 2 93. La expresión estable de G alfa 15 junto con la expresión transitoria del receptor muscarínico M tres provocó un aumento en la hidrólisis basal de fosfoinosítidos, lo cual se atribuyó a la actividad constitutiva del receptor. Los datos se analizaron para estimar los valores log KB de Oxo Tremaine M y MacNeil, A 3 43.

Las curvas teóricas representan el ajuste de mínimos cuadrados de la ecuación de regresión a los datos. Se muestran las estimaciones log KB para Oxo Tremoring M y McNeil, A 3 43. También se determinó la estimación del valor K observado de McNeil A 3 43.

Una vez dominada, esta técnica de análisis de datos puede realizarse en pocos minutos si se hace correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estimar tanto los valores KB relativos como los reales a partir de las curvas de respuesta frente a concentración de agonistas para provocar una respuesta en la vía de señalización descendente de un receptor acoplado a proteína G.