Generación experimental de carcinoma asociada a los fibroblastos (CAF) a partir de fibroblastos humanos mamarios

Este vídeo describe un procedimiento para generar fibroblastos asociados al carcinoma o calfs a partir de cultivos primarios de tejido humano. Los carcinomas son tejidos complejos compuestos por células neoplásicas y un compartimento no canceroso denominado estroma. El estroma asociado al tumor S está formado por matriz extracelular y una variedad de células estromales, incluyendo fibroblastos, miofibroblastos, células endoteliales, parásitos y leucocitos. Los fibroblastos asociados al carcinoma, ricos en miofibroblastos, son una característica distintiva de los fibroblastos activados presentes dentro del tumor.

Los estromas desempeñan un papel fundamental en la promoción de la progresión tumoral. Estos pueden generarse in vitro mediante el aislamiento inicial de fibroblastos mamarios humanos primarios a partir de tejido mamario sano obtenido mediante mamoplastia de reducción. El tejido obtenido se disocia en una suspensión de células individuales, luego se inmortaliza mediante transducción viral y se modifica genéticamente para expresar GFP y un gen de resistencia a la puromicina.

Luego, las células se inyectan conjuntamente con carcinoma de mama humano. Las células MCF siete RAs se inyectan subcutáneamente en un ratón inmunodeficiente. Los fibroblastos humanos de memoria inyectados se transformarán en fibroblastos mioide de ternera que promueven el tumor.

Luego, los fibroblastos mamarios humorales parentales se extraen de xenoinjertos tumorales y se cultivan en presencia de puromicina. Las células resultantes resistentes a la puromicina, denominadas fibroblastos asociados al cáncer generados experimentalmente o exp-CAF, revelan mediante análisis inmunohistoquímico que los fibroblastos normales humanos inicialmente presentes evolucionan hacia fibroblastos asociados al cáncer dentro del xenoinjerto tumoral, adquiriendo la capacidad de promover la tumorigénesis. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la extracción de CAF primarios de pacientes con cáncer de mama, es que somos capaces de generar experimentalmente CAF a partir de fibroblastos mamarios humanos mediante la coimplantación tumoral.

El modelo general que demostrará el procedimiento será Kar, un investigador posdoctoral en mi laboratorio, y Ahmed Kar, un estudiante de doctorado en el laboratorio. Comience con un gramo de tejido mamario humano sano diseccionado de una mamoplastia de reducción. Lave el tejido varias veces en PBS, luego coloque el tejido en una placa de Petri de 15 centímetros y use una cuchilla estéril para picarlo en fragmentos pequeños de menos de 1,5 milímetros cúbicos de tamaño.

A continuación, utilice la cuchilla de afeitar para transferir los fragmentos de tejido a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de tampón de disociación celular por cada medio gramo de tejido. Luego, vortexee durante un minuto a velocidad máxima. Coloque el tubo en un agitador rotatorio dentro de un incubador a 37 grados Celsius y deje que los fragmentos de tejido se digieran durante 12 a 18 horas.

Al día siguiente, aún habrá muchos fragmentos de tejido no digerido en el vórtice del tubo. Primero, a velocidad máxima, coloque el tubo sobre la superficie de trabajo e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitación. Tras la incubación, utilice una pipeta fisiológica de cinco mililitros para transferir el sobrenadante enriquecido en células estromales resultante a un nuevo tubo cónico.

Luego, centrifugue la fracción estromal durante cinco minutos a 250 veces la gravedad. Después de la centrifugación, re suspenda el botón celular en PBS y luego centrifugue su muestra durante cinco minutos a 250 veces la gravedad. A continuación, re suspenda el botón en DMEM suplementado con 10% de FCS y transfiéralo a una placa de Petri de 15 centímetros.

Incube las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Después de ocho a 10 días, las células deben estar confluentes. En este momento, se cosechan las células y pueden congelarse para almacenamiento a largo plazo.

Para inmortalizar los fibroblastos humanos normales de memoria primarios aislados, introduzca un vector retroviral P MIG que exprese tanto H turt como GFP en el cultivo celular durante cuatro a cinco días, y luego seleccione las células positivas para GFP mediante citometría de flujo. Introduzca un constructo retroviral P babe puro que codifique un gen de resistencia a la puromicina en los fibroblastos inmortalizados marcados con GFP. Incube las células durante cinco a siete días en presencia de puromicina a una concentración final de un microgramo por mililitro.

Para aislar los fibroblastos humanos inmortales de memoria etiquetados con GFP resistentes a la puromicina. A continuación, examinar si los fibroblastos producen virus activos, los cuales pueden provocar la transferencia horizontal de genes que codifican GFP y resistencia a la puromicina. Cultive 2,5 veces 10 a la cinco fibroblastos humanos inmortales de memoria resistentes a la puromicina en una placa de Petri de seis centímetros durante dos días.

Recolecte y filtre el medio condicionado de fibroblastos utilizando un filtro de jeringa con un tamaño de poro de 0,45 micrones. A continuación, añádalo a diez células de fibroblastos murinos y medio, y cultive durante 12 horas en presencia de cinco microgramos por mililitro de sulfato de proteína, lo que aumenta la eficiencia de la infección viral tras transcurridas 12 horas. Cambie el medio a DMEM suplementado con 10% FCS y cultive durante dos días adicionales.

Examine las células mediante microscopía de fluorescencia. Las células T y media infectadas por el virus GFP serán positivas para GFP. Ahora cambie el medio para tratar las células con un microgramo por mililitro.

Seleccionar con puromicina durante cinco a siete días. Nuevamente, observar las células mediante microscopía de fluorescencia para determinar si se han formado colonias a partir de células tentativas resistentes a la puromicina. Tenga en cuenta que la transferencia horizontal de genes mediante virus activos producidos por los fibroblastos mamarios humanos parentales resistentes a la puromicina y marcados con GFP podría conferir resistencia a la puromicina a las células murinas sensibles circundantes y a las células de carcinoma.

Resistentes a la puromicina y positivos para GFP dentro del xenoinjerto tumoral. Esto podría dificultar el proceso de aislamiento de los fibroblastos mamarios humanos marcados con GFP y resistentes a la puromicina inyectados del xenoinjerto tumoral, con el fin de generar experimentalmente fibroblastos asociados al carcinoma para su inyección en un ratón inmunodeficiente. Comience por tratar con tripsina y contar la línea celular mamaria humana recién preparada junto con la línea celular de carcinoma de mama humana MCF seven RAs en nuevos tubos microfugas.

Suspender 1 × 10⁶ células de carcinoma de mama humano mc77 RAs y 3 × 10⁶ fibroblastos mamarios humanos inmortalizados resistentes a la puromicina y marcados con GFP en 400 µL de medio de cultivo con 50 % de Matrigel por inyección. Colocar los tubos en hielo como control.

También prepare los mismos fibroblastos mamarios humanos sin las células MCF seven RAs. A continuación, utilizando una aguja de 27 gauge, inyecte la mezcla celular en un sitio subcutáneo de un ratón desnudo inmunodeficiente para examinar la variación intratumoral de los fenotipos de los calfs. Aísle los calfs y los fibroblastos control de varios xenoinjertos tumorales diferentes.

Luego, implante cada mezcla en los segmentos derecho e izquierdo de cada ratón. Permite que los xenoinjertos de tumor o fibroblastos crezcan durante 42 días tras la inyección. El período de incubación de los fibroblastos dentro del xenoinjerto tumoral debe optimizarse según el fenotipo de miofibroblasto adquirido en los fibroblastos parentales en el tumor.

Para extraer los fibroblastos de ternera o los fibroblastos control del ratón sacrificado, coloque al menos 0,5 gramos de tejido de xenoinjerto y al menos 0,1 gramos de tejido de xenoinjerto de fibroblastos en placas separadas. A continuación, use una cuchilla estéril para picar el tejido en fragmentos pequeños de menos de 1,5 milímetros cúbicos. Luego, use la cuchilla para transferir los fragmentos de tejido a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga el tampón de disociación celular y vortexee durante un minuto a velocidad máxima. Incube la suspensión celular durante tres horas a 37 grados Celsius con agitación lenta continua y luego centrifugue la suspensión celular.

Disociar durante cinco minutos a 250 × g después de la centrifugación, ya sea del tumor o del injerto de fibra de vidrio sano. Suspender nuevamente el botón celular en PBS y repetir la centrifugación. Luego, suspender el botón celular resultante en DMEM suplementado con 10 % FCS para aislar la cultura de fibroblastos mamarios humanos parentales resistentes a la puromicina.

Las células derivadas del tumor o los fibroblastos flotan en una placa de Petri de 15 centímetros en presencia de un microgramo por mililitro de puramicina a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Esto eliminará cualquier célula de carcinoma contaminante y/o murina.

Las células estromales propagan las células hasta que alcancen confluencia y almacenan las células a menos 80 grados Celsius utilizando medio de congelación. Tenga en cuenta que las células resultantes resistentes a la puromicina, denominadas fibroblastos del ternero XP de 42 días de edad o fibroblastos control uno, son inmortales y positivas para GFP. Los fibroblastos humanos de memoria incrementan su fenotipo promotor de tumores de tipo miofibroblástico dentro del xenoinjerto tumoral mediante la interacción con células de carcinoma durante la progresión del tumor. Mezcle una vez 10 a la seis células MCF siete RAs y tres veces 10 a la seis fibroblastos P del ternero de 42 días.

Una célula en 400 microlitros de medio de cultivo con inyección de Matrigel al 50 % en un tubo eppendorf de 1,5 mililitros. Prepare también tres veces 10 a la 6 células de fibroblastos control de 42 días sin células de carcinoma en un tubo eppendorf para potenciar aún más los fenotipos miofibroblásticos promotores de tumores de las células exp calf una. Inyecte una mezcla de estas células con células CF siete RAs subcutáneamente en un ratón desnudo. Inyecte también células de fibroblastos control una solas, sin células cancerosas, para preparar las células control si es necesario.

Incubar células exp calf una durante períodos adicionales de 200 días dentro del xenoinjerto tumoral para generar células exp C dos y potenciar el fenotipo de miofibroblasto promotor de tumores. Asimismo, generar células control fibroblastos dos como control frente a las células exp calf dos, inyectando células control fibroblastos uno sin células de carcinoma en un ratón, extraer los tumores y colocarlos en placas de cultivo de tejidos.

Disecte y disocie el injerto tumoral o el seno fibroblástico en una suspensión de células individuales y cultívelo. Incube las células en una placa de Petri de 15 centímetros con DMEM con suero fetal al 10 % en presencia de puromicina, propague las células hasta que estén completamente enzimáticamente disociadas con tripsina y almacene las células a menos 80 grados Celsius utilizando medio de congelación. Las células resultantes resistentes a la puromicina se denominan células expcalf dos de 242 días o células control fibroblásticas dos. Las células expcalf dos GFP marcadas y las células control fibroblásticas dos extraídas de injertos xenógenos de tumor de mama se analizaron inmunohistoquímicamente. Como se muestra en esta imagen, las células se tiñen fuertemente positivas para marcadores mesenquimales, incluyendo prolina 4-hidroxilasa específica humana, colágeno tipo I, fibronectina, S100A4 y proteína de superficie de fibroblastos.

Estos resultados indican un origen humano y una naturaleza mesenquimal de estas células. En contraste, la citokeratina, un marcador para células epiteliales, no se tiñó en estos fibroblastos positivos para GFP considerados en conjunto. Estos hallazgos sugieren que las células EXP C dos y los fibroblastos de control dos se originaron a partir de los fibroblastos mamarios humanos parentales introducidos inicialmente en xenoinjertos de ratón.

Es importante destacar que un número mucho mayor de células XP de la cría dos mostraron tinción positiva para alfa SMA y para la glucoproteína de matriz extracelular nasina C, ambas marcadoras de miofibroblastos en comparación con los fibroblastos control de la cría dos. Obsérvese que una proporción más alta de miofibroblastos positivos para alfa SMA está presente en las células de la cría dos exp en comparación con la observada en las células de la cría uno exp de 42 días de edad. Estos datos demuestran que los fibroblastos residentes humanos de memoria progresivamente se transforman en miofibroblastos de la cría dentro de xenoinjertos tumorales durante la progresión tumoral tras su desarrollo.

El modelo de xenoinjerto tumoral de complementación allanó el camino para que los investigadores que estudian el microentorno tumoral analicen los procesos de evolución del fibroblasto normal hacia el cáncer. Así hablan los fibroblastos.