Generación experimental de carcinoma asociada a los fibroblastos (CAF) a partir de fibroblastos humanos mamarios

Carcinoma asociados fibroblastos (CAF), rica en miofibroblastos presentes en el estroma tumoral, juegan un papel importante en la conducción de la progresión del tumor. Hemos desarrollado un modelo de tumor coimplantation xengraft para generar experimentalmente CAF a partir de fibroblastos humanos mamarios. El protocolo describe cómo establecer miofibroblastos CAF que adquirir la capacidad de promover la génesis tumoral.

Este video describe un procedimiento para generar fibroblastos o terneros asociados al carcinoma a partir de la memoria humana cultivada primaria. Los fibroblastos carcinomas son tejidos complejos formados por células neoplásicas y un compartimento no canceroso denominado stromer. El estroma S asociado al tumor consta de una matriz extracelular y una variedad de células estromalas, que incluyen fibroblastos, miofibroblastos, células endoteliales, parásitos y fibroblastos asociados al carcinoma de leucocitos ricos en miofibroblastos, un sello distintivo de los fibroblastos activados presentes dentro del tumor.

Stromer desempeña un papel importante en la progresión del tumor. Estos se pueden generar in vitro aislando primero fibroblastos mamarios humanos primarios de tejido mamario sano obtenido por mamoplastia de reducción. El tejido obtenido se disocia en una suspensión de una sola célula, luego se mortaliza por transducción viral y se diseña para expresar GFP y un gen de resistencia a la micina puram.

A continuación, las células se inyectan conjuntamente con el carcinoma de mama humano. MCF siete células AR por vía subcutánea en un ratón inmunodeficiente. Los fibroblastos de memoria humana inyectados evolucionarán a miofibroblastos de pantorrilla promotores de tumores.

A continuación, se extraen los fibroblastos mamarios de los xenoinjertos tumorales y se cultivan en presencia de purmicina. El análisis inmunohistoquímico de las células resistentes a purmicina resultantes, denominadas terneros generados experimentalmente o pantorrillas exp, revela que los fibroblastos de memoria humana inicialmente presentes en condiciones normales evolucionan en miofibroblastos de ternera dentro del xenoinjerto tumoral que han adquirido la capacidad de promover la tumorgénesis. La principal ventaja de esta técnica por el método existente como la extracción con calorías primarias de pacientes con cáncer de mama es que somos elegibles para generar experimentalmente terneros a partir de fibroblastos de mama humana utilizando tumor de coimplantación.

Kar, un becario postdoctoral en mi laboratorio, y Ahmed Kar, un estudiante de doctorado en el laboratorio. Comience con un gramo de tejido mamario humano sano diseccionado de una mamoplastia de reducción. Lave el pañuelo varias veces en PBS, luego coloque el pañuelo en una placa de Petro de 15 centímetros y use una hoja de afeitar estéril para picarlo en pequeños fragmentos de menos de 1,5 milímetros cúbicos de tamaño.

A continuación, utilice la cuchilla de afeitar para transferir los fragmentos de tejido a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de tampón de disociación celular por cada medio gramo de tejido. A continuación, vórtice durante un minuto a máxima velocidad. Coloque el tubo en una mecedora en una incubadora a 37 grados centígrados y deje que los fragmentos de tejido se digieran durante 12 a 18 horas.

Al día siguiente todavía quedarán muchos trozos de fragmentos de tejido sin digerir en el vórtice del tubo. Primero a máxima velocidad, coloque el tubo en la mesa de trabajo e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar. Después de la incubación, utilice una pipeta fisiológica de cinco mililitros para transferir el SUP nadante enriquecido con células estromales resultante a un nuevo tubo cónico.

A continuación, centrifuga la fracción estromal durante cinco minutos a 250 veces la gravedad. Después de girar, vuelva a suspender la celda en PBS, luego centrifugue su ganancia durante cinco minutos a 250 veces la gravedad. A continuación, vuelva a suspender el pellet en DMEM suplementado con 10%FCS y transfiéralo a una placa de Petri de 15 centímetros.

Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de ocho a 10 días, la célula debe ser confluente. En este punto, las células se cosechan y se pueden congelar para su almacenamiento a largo plazo.

Para inmortalizar los fibroblastos humanos primarios de memoria normal aislados, se introduce un vector P MIG retroviral que expresa tanto H turt como GFP cultivo, las células durante cuatro o cinco días y luego se clasifican las células GFP positivas mediante citometría de flujo. Introducir una construcción retroviral de P babe puro que codifica un gen de resistencia a la micina pura en el cultivo de fibroblastos inmortalizados marcados con GFP. Las células durante cinco a siete días en presencia de micina pura a una concentración final de un microgramo por mililitro.

Para aislar los fibroblastos de memoria humana inmortalizados resistentes a la micina PUR marcados con GFP. A continuación, examinar si los fibroblastos producen virus activos, lo que puede conducir a la transferencia horizontal de genes que codifican la GFP y la resistencia a la purmicina. Crezca 2,5 veces 10 por los cinco fibroblastos de memoria humana inmortalizados resistentes a la purmicina en una placa de Petri de seis centímetros durante dos días.

Recoja y filtre el medio acondicionado de fibroblastos con un filtro de jeringa de 0,45 micras del tamaño de los poros. Luego agregue a 10 t y media de células de fibroblastos de ratón y cultive durante 12 horas en presencia de cinco microgramos por mililitro de sulfato de proteína, lo que aumenta la eficiencia de la infección viral después de que hayan pasado 12 horas. Cambie el medio a DMEM suplementado con 10% de FCS y cultivo durante dos días adicionales.

Examinar las células mediante microscopía de fluorescencia. 10 células T y media infectadas por el virus GFP serán GFP positivas. Ahora cambie el medio para tratar las células con un microgramo por mililitro.

Purmicina durante cinco a siete días. Una vez más, observe las células mediante microscopía de fluorescencia para determinar si alguna célula tentativa y media resistente a purmicina ha formado colonias. Obsérvese que la transferencia horizontal de genes por parte de los virus activos producidos por los fibroblastos mamarios humanos marcados con GFP resistentes a la purmicina podría hacer que las células murinas y las células de carcinoma sean sensibles a la pur micina circundantes.

Pur micina resistente y GFP positivo dentro del xenoinjerto tumoral. Esto puede dificultar el proceso de aislamiento de los fibroblastos mamarios humanos puros resistentes a la micina marcados con GFP inyectados del xenoinjerto tumoral para generar experimentalmente fibroblastos asociados al carcinoma para inyectarlos en un ratón inmunodeficiente. Comience con tripsina y cuente la línea celular mamaria humana que se acaba de preparar junto con la línea celular de carcinoma de mama humano MCF siete RA en nuevos tubos de microrresiduos.

Reus suspende una vez 10 a las seis mc siete siete AR células de carcinoma de mama humano y tres veces 10 a las seis GFP etiquetadas pur micina resistente inmortalizada. Fibroblastos mamarios humanos en 400 microlitros de medios de cultivo con 50% de matrigel por inyección. Coloque los tubos en hielo como control.

También prepare los mismos fibroblastos mamarios humanos sin las células MCF siete RA. A continuación, con una aguja de calibre 27, inyecte la mezcla de células en un sitio subcutáneo de un ratón desnudo inmunodeficiente para examinar la variación intratumoral de los fenotipos de terneros. Aísle terneros y controle fibroblastos de algunos xenoinjertos tumorales diferentes.

A continuación, implante cada mezcla en las longitudes derecha e izquierda de cada ratón. Deje que el tumor o los xenoinjertos de fibroblastos crezcan durante 42 días después de la inyección. El período de incubación de los fibroblastos dentro del xenoinjerto tumoral debe optimizarse en función del fenotipo de miofibroblastos adquirido en los fibroblastos parentales en el tumor.

Para extraer los terneros o controlar los fibroblastos del ratón sacrificado, coloque al menos 0,5 gramos de tejido de xenoinjerto y al menos 0,1 gramos de tejido de xenoinjerto de fibroblastos en platos separados. A continuación, utilice una hoja de afeitar estéril para picar el tejido en pequeños fragmentos de tejido de menos de 1,5 milímetros cúbicos. Luego use la hoja de afeitar para transferir los fragmentos de tejido a un tubo cónico de 15 mililitros que contiene el tampón de disociación celular y el vórtice durante un minuto A velocidad máxima, incube la suspensión celular durante tres horas a 37 grados Celsius con centrífuga de agitación lenta continua a la suspensión celular.

Disociado del tumor o del injerto de fibra de vidrio durante cinco minutos a 250 veces la gravedad después del centrifugado. Vuelva a suspender el pellet de celda en PBS y repita la centrifugación. A continuación, vuelva a suspender la paleta celular resultante en DMEM suplementado con FCS al 10% para aislar el cultivo de fibroblastos mamarios humanos humanos parentales resistentes a purmicina.

Las células derivadas del tumor o de los fibroblastos se agrupan en una placa de Petri de 15 centímetros en presencia de un microgramo por mililitro. Puram micina a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Esto eliminará cualquier célula de carcinoma contaminante y/o murino.

Las células estromales propagan las células hasta que el cofluente almacena las células a menos 80 grados centígrados utilizando un medio de congelación. Tenga en cuenta que las células resistentes a purmicina resultantes, designadas como células XP de ternero de 42 días de edad uno o células de fibroblasto de control uno, son inmortales y positivas para GFP: los fibroblastos de memoria humana aumentan su tumor, promoviendo el fenotipo miofibroblástico dentro del xenoinjerto tumoral al interactuar con las células de carcinoma durante la progresión del tumor. Mezcle una vez 10 a las seis células MCF, siete células RAs y tres veces 10 a la cría P de 6 42 días de edad.

Una celda en 400 microlitros de medio de cultivo con inyección de potencia de matrigel al 50% en un tubo de orph eend de 1,5 mililitros. También prepare tres fibroblastos de control de 10 a 6 42 días de edad de una célula sin células de carcinoma en un tubo de einor para estimular aún más el tumor promoviendo los fenotipos miofibroblásticos de las células exp calf una inyección subcutánea de estas células con células CF siete RA en un ratón desnudo. También inyecte fibroblastos de control de una sola célula sin células cancerosas para preparar las células de control si es necesario.

Incubar células exp ternera una durante períodos adicionales de 200 días dentro del xenoinjerto tumoral para generar células exp C dos para mejorar el fenotipo miofibroblástico promotor del tumor. También generar control. Fibroblastos dos células como control contra dos células exp ternera mediante la inyección de fibroblastos de control una célula sin células de carcinoma en un ratón, extirpa los tumores y los coloca en placas de cultivo de tejidos.

Diseccionar y disociar el tumor o el injerto de seno de fibroblastos en una sola suspensión y cultivo celular. Las células en una placa de Petro de 15 centímetros con 10% F-C-S-D-M-E-M en presencia de purmicina propagan las células hasta que se complementan con los ojos de tripsina y almacenan las células a menos 80 grados Celsius utilizando medio de congelación. Las células resistentes a purmicina resultantes se denominan 242 días de edad, exp ternera, dos células o fibroblastos de control, dos células marcadas con GFP, exp ternera dos y control, fibroblastos, dos células extraídas de tumores de mama, los xenoinjertos se analizaron inmunohistoquímicamente como se muestra en esta imagen, las células se tiñen fuertemente positivas para los marcadores mesenquimales, incluido el prolo específico humano, la fermentación prolo cuatro hidroxilasa, el colágeno, una A, la fibronectina S 100, A cuatro, y la proteína de superficie de los fibroblastos.

Estos resultados indican un origen humano y una naturaleza mesenquimal de estas células. Por el contrario, la citoqueratina, un marcador de células epiteliales, no se tiñó en estos fibroblastos positivos para GFP tomados en conjunto. Estos hallazgos sugieren que las células EXP C dos y fibroblastos control dos se originan a partir de los fibroblastos mamarios humanos parentales introducidos inicialmente en xenoinjertos de ratón.

Es importante destacar que el número de células XP ternera dos teñidas positivamente para alfa SMA y glicoproteína de la matriz extracelular a nasina C, los cuales son marcadores de miofibroblastos en comparación con las células de fibroblastos de control dos. Tenga en cuenta que una mayor proporción de miofibroblastos alfa smma positivos está presente en las células exp calf two en comparación con la observada en las células exp calf one de 42 días de edad. Estos datos demuestran que los fibroblastos de memoria humanos residentes se involucran progresivamente en los miofibroblastos de ternera dentro de los xenoinjertos tumorales durante la progresión del tumor después de su desarrollo.

El modelo de xenoinjerto tumoral de complementación allanó el camino para que los investigadores que trabajan en el microambiente tumoral estudien los procesos de evolución del fibroblasto normal en cáncer. Eso dicen los fibroblastos.