Predicción del VIH-1 usos correceptor (tropismo) por análisis de secuencia utilizando un enfoque genotípica

El objetivo general del siguiente experimento es predecir el uso de co-receptores del VIH-1 para la administración de una nueva clase de fármacos antirretrovirales. Esto se logra aislado los ácidos nucleicos genómicos virales, ARN viral o ADN proviral, a partir de la sangre del paciente, tras la amplificación de la región del envoltorio. La región V3 viral, que es el principal determinante del tropismo, se amplifica mediante PCR anidada.

A continuación, el amplicón V tres se secuencia con diferentes cebadores para generar un archivo fasta. Se obtienen resultados que muestran el tropismo viral y la susceptibilidad al antagonista del coreceptor en función de la tasa de falsos positivos o FPR, según la herramienta en línea de interpretación geno to pheno coreceptor. Dependiendo del uso de CORECEPTOR, los virus del VIH se clasifican como R cinco o X cuatro.

El miri rock se une al receptor CCR5, inhibiendo la entrada de virus R5 en la célula diana. Durante el curso de la enfermedad, pueden surgir virus X4 y superar en crecimiento a los virus R5. La determinación del uso de receptores, también llamada tropismo, es por lo tanto obligatoria antes de la administración de maraviroc, tal como lo exigen la EMA y la FDA.

La principal ventaja de esta técnica es que se puede realizar fácilmente una determinación paralela de la resistencia a otras clases de fármacos antirretrovirales. Este método permite una medicina mucho más personalizada, ya que los puntos de corte para los resultados de tropismo pueden modificarse según las necesidades del paciente. Tuvimos la idea inicial de este método a principios de los años noventa, cuando deseábamos conocer la base molecular de la diferente replicación en cultivo celular de cepas de VIH y de la progresión de la enfermedad en pacientes, demostrando que el procedimiento será datos de un técnico de nuestro grupo antes del inicio de este protocolo.

Las muestras se recolectan como sangre con EDTA en el sitio clínico y se envían al laboratorio para comenzar el aislamiento de ácidos nucleicos de VIH a partir de 1000 microlitros de suero o plasma sanguíneo completo utilizando el sistema mag pure compact y el kit de aislamiento de ácidos nucleicos según las instrucciones del fabricante. El ARN o ADN obtenido se suspende luego en 50 microlitros de tampón TE. El siguiente paso consiste en amplificar la región del envoltorio del ácido nucleico mediante PCR de transcripción inversa para ARN o simplemente PCR para ADN, como se describe en el texto; la reacción debe generar un producto de 1.245 pares de bases de longitud que comprenda la mayor parte de la región de la proteína del envoltorio. Para amplificar la región V3 de la proteína del envoltorio, se realiza una PCR anidada utilizando cinco microlitros de la primera reacción de PCR como molde.

Prepare las reacciones utilizando la mezcla maestra para la PCR anidada casera según se describe en el texto. Los parámetros de ejecución de la PCR anidada también se detallan allí. Tras la amplificación de la región V tres, analice el producto de PCR para verificar el producto esperado de 902 pares de bases de longitud mediante electroforesis en gel antes de la secuenciación.

Purifique el producto de PCR según se describe en el protocolo escrito. Una vez que el producto de PCR haya sido purificado, realice la reacción de secuenciación según se indica en el texto tras completar la reacción. Purifique las muestras de secuenciación utilizando Cidex G 50 superfino y una placa de filtro multicanal con membrana Durapore, siguiendo las instrucciones de la parte escrita de este procedimiento para secuenciar el producto purificado; prepare el secuenciador comprobando el polímero y cambiando el tampón.

Luego cargue las muestras, establezca las condiciones e inicie la corrida. Tras la corrida de secuenciación, se puede utilizar el programa DNA STAR laser gene para alinear y editar las secuencias.

El amplicón V tres se secuencia con al menos un cebador directo y uno inverso. Laser gene alinea los archivos ABI obtenidos del secuenciador con las secuencias de referencia. V tres, consenso B y envoltura laser gene crea una secuencia consenso de la muestra analizada utilizando todos los datos brutos disponibles, pero no las referencias, y la almacena como un archivo FASTA.

El archivo FASTA es un archivo de texto que incluye un encabezado con el nombre de la muestra y la secuencia de nucleótidos. Para comenzar la interpretación de los datos y la predicción de tropismo, cargue el archivo FASTA en el sistema de interpretación basado en web. Geno Tono co-receptor selecciona el valor de corte FPR hasta el cual el virus se clasifica como R cinco.

Al utilizar las guías alemanas, el virus se clasifica como R cinco cuando la FPR es mayor o igual al 20 %, y como X cuatro cuando la FPR es menor al 12,5 %. Seleccione cualquier parámetro clínico adicional disponible y luego seleccione, alinee y prediga. Este servidor traduce la secuencia de nucleótidos en aminoácidos, la alinea con la secuencia consenso V tres B y produce una clasificación de subtipo. Además, genera una predicción del uso del co-receptor expresada como FPR.

El resultado muestra una interpretación graduada según la probabilidad de uso del co-receptor. Para valores altos de FPR, se tiene mucha certeza de que el virus no es X cuatro, y para valores bajos de FPR se tiene incertidumbre sobre el tipo de virus si la interpretación, el texto y el color de fondo son verdes. El color verde indica que se puede administrar Ravi Rock con seguridad, el amarillo sugiere un posible riesgo bajo al usar Ravi Rock, y el rojo indica que no se debe recetar Ravi Rock.

Además, el servidor genera un informe en formato PDF que puede imprimirse y enviarse al médico. Se pueden incluir manualmente datos adicionales, como el nombre del paciente o la fecha de extracción de sangre, utilizando un programa de escritura de PDF. En la privacidad del ordenador del usuario también se pueden añadir comentarios específicos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar los cortes virales utilizando la herramienta de receptor geno-fenotipo. Al intentar este procedimiento, es importante realizar controles de calidad de forma regular. No olvide que trabajar con el VIH puede ser extremadamente peligroso, por lo que siempre deben tomarse precauciones y utilizarse laboratorios biológicamente seguros y autorizados.