Predicción del VIH-1 usos correceptor (tropismo) por análisis de secuencia utilizando un enfoque genotípica

El objetivo general del siguiente experimento es predecir el uso de correceptores del VIH uno para la administración de una nueva clase de medicamentos antirretrovirales. Esto se logra aislando los ácidos nucleicos genómicos virales, el ARN viral o el ADN proviral de la sangre del paciente después de la amplificación de la región de la envoltura. La región viral V tres, que es el principal determinante del tropismo, se amplifica mediante PCR anidada.

A continuación, se secuencia el amplicón V tres con diferentes cebadores para generar un archivo fasta. Se obtienen resultados que muestran el tropismo viral y la susceptibilidad de los correceptores antagonistas en base a la tasa de falsos positivos o FPR obtenida por la herramienta de interpretación en línea geno a fenotipo coreceptor. Dependiendo del uso del correceptor, los virus del VIH se clasifican como R cinco o X cuatro.

La roca Miri se une a través del receptor CCR cinco, inhibiendo la entrada de los virus R cinco en la célula diana. Durante el curso de la enfermedad X, pueden surgir cuatro virus y superar a los virus R cinco. Por lo tanto, la interrupción del uso del receptor, también llamado tropismo, es obligatoria antes de la administración de maraviroc, tal y como exigen la EMA y la FDA.

La principal ventaja de esta técnica es que se puede hacer una determinación paralela de la resistencia a otras clases de medicamentos antirretrovirales muy fácilmente. Este método permite una medicina mucho más personalizada, ya que los puntos de corte para los resultados del tropismo pueden modificarse según las necesidades del paciente. La idea de este método la tuvimos por primera vez a principios de los años noventa cuando quisimos conocer las bases moleculares de los diferentes cultivos celulares, el crecimiento de cepas de VIH y la progresión de la enfermedad en los pacientes demostrando el procedimiento que serían datos de un técnico de nuestro grupo previo al inicio de este protocolo.

Las muestras se recolectan como sangre EDTA en el sitio clínico y se envían al laboratorio para comenzar a aislar los ácidos nucleicos del VIH de 1000 microlitros de suero o plasma de sangre total utilizando el sistema compacto mag pure y el kit de aislamiento de ácido nucleico según las instrucciones del fabricante. A continuación, se alude al ARN o ADN obtenido en tampón TE de 50 microlitros. El siguiente paso es amplificar la región de la envoltura del ácido nucleico mediante PCR con transcripción inversa para ARN o simplemente PCR para ADN, como se describe en el texto, la reacción debe generar un producto largo de 1, 245 pares de bases que comprenda la mayor parte de la región de la proteína de la envoltura para amplificar la región V tres de la proteína de la envoltura seguida con PCR anidada utilizando cinco microlitros de la primera reacción de PCR como plantilla.

Prepare las reacciones utilizando la mezcla maestra para la PCR interna anidada como se describe en el texto. Allí también se describen los parámetros de ejecución de PCR anidados. Después de la amplificación de la región V tres, analice el producto de PCR para verificar el producto esperado en el par de bases 902 de longitud mediante electroforesis en gel antes de la secuenciación.

Purifique el producto de PCR como se describe en el protocolo escrito. Una vez que se haya purificado el producto de PCR, realice la reacción de secuenciación como se describe en el texto al finalizar la reacción. Purifique las muestras de secuenciación utilizando cidex G 50 superfino y una placa de filtro multipantalla con membrana durapore siguiendo las instrucciones de la parte escrita de este procedimiento para secuenciar el producto purificado, prepare el secuenciador comprobando el polímero y cambiando el tampón.

A continuación, cargue las muestras, establezca las condiciones e inicie la ejecución. Después de la secuenciación. El programa de genes láser DNA STAR se puede utilizar para alinear y editar las secuencias.

El amplicón V tres se secuencia con al menos un cebador directo y otro inverso. El gen láser alinea los archivos ABI obtenidos del secuenciador con las secuencias de referencia. V tres, consenso B y gen láser envolvente crea una secuencia de consenso de la muestra analizada utilizando todos los datos brutos disponibles, pero no las referencias y la almacena como un archivo FASTA.

El archivo FASTA es un archivo de texto que incluye un encabezado con el nombre de la muestra y la secuencia de nucleótidos. Para comenzar la interpretación de datos y la predicción de tropismos, cargue el archivo FASTA en el sistema de interpretación basado en la web. El correceptor Geno Tono selecciona el punto de corte FPR hasta el cual el virus se clasifica como R cinco.

Siguiendo las directrices alemanas, el virus se clasifica como R cinco. Cuando FPR es mayor o igual que 20% y como X cuatro, cuando FPR es menor que 12.5%seleccione cualquier parámetro clínico adicional si está disponible, y luego seleccione, alinee y prediga Este servidor traduce la secuencia de nucleótidos en aminoácidos, la alinea con la secuencia B de consenso V tres y produce una clasificación de subtipos. Además, genera una predicción del uso de co-receptores expresado como FPR.

El resultado muestra una interpretación graduada en función de la probabilidad de uso del correceptor. Para valores altos de FPR, uno está bastante seguro de que el virus no es X cuatro y para FPR bajos uno no está seguro de cómo se ve el virus si la interpretación, el texto y el color de fondo son verdes. Se indica la administración segura de Ravi Rock, mientras que el amarillo sugiere un posible bajo riesgo de uso de Ravi Rock, y el rojo indica que Ravi Rock no debe recetarse.

Además, el servidor genera un informe en PDF que se puede imprimir y enviar al médico. Los datos adicionales, como el nombre del paciente o la fecha de la extracción de sangre, se pueden incluir manualmente mediante un programa de redacción de PDF. En la privacidad del ordenador del usuario también se pueden añadir comentarios específicos.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo determinar las cortes virales utilizando la herramienta de receptor de genofenotipo Al intentar este procedimiento, es importante realizar controles de calidad con regularidad. No olvide que trabajar con el VIH puede ser extremadamente peligroso, por lo que siempre se deben tomar precauciones y utilizar laboratorios biológicos seguros autorizados.