Name: Mapeo de la heterogeneidad de la expresión de proteínas en los tumores utilizando inmunofluorescencia cuantitativa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Aprende a cuantificar la heterogeneidad de biomarcadores en tejidos tumorales mediante inmunofluorescencia cuantitativa y análisis de imágenes AQUA. Este método mejora el desarrollo clínico de biomarcadores.

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Este trabajo fue apoyado en parte por el Consejo Escocés de Financiación (número de concesión HR07005; <a href="http://www.sfc.ac.uk/">http://www.sfc.ac.uk/</a> ), de Investigación Médica de Escocia ( <a href="http://www.medicalresearchscotland.org.uk/">http://www.medicalresearchscotland.org.uk/</a> ), el cáncer Investigación Experimental del Cáncer del Reino Unido Centro de Medicina ( <a href="http://www.cancerresearchuk.org/">http://www.cancerresearchuk.org/</a> ), y el cáncer de mama Breakthrough ( <a href="http://breakthrough.org.uk/">http://breakthrough.org.uk/</a> ).

1. Preparación de tejidos <ol class="lalpha"><li> Microtomía <ol class="lroman"><li> Sección fija parafina formalina incrustados bloques de tumor con un espesor de 4 micras con un micrótomo rotatorio. </li><li> Coloque las secciones en carga positiva portaobjetos. </li><li> Incubar los portaobjetos en un horno de 37 ° C durante la noche. </li></ol></li><li> Almacenamiento <ol><li> Secciones de almacén en un -18 ° C a -25 ° C congelador, con el fin de evitar la pérdida de antigenicidad. </li></ol></li></ol> 2. Inmunofluorescencia de secciones de tejido <ol class="lalpha"><li> Desparafinado y rehidratación <ol class="lroman"><li> Dewax diapositivas en xileno dos veces durante 5 min. </li><li> Rehidratar las diapositivas en el 99%, 99%, 80%, 50% de etanol y agua corriente durante 2 min de cada uno en orden. </li></ol></li><li> Antígeno de recuperación <ol class="lroman"><li> Realizar la recuperación de antígeno inductor de calor, con 0,15 mM de citrato sódico, pH 6,0 buffer en una olla a presión durante 5 minutos en el kmcrowave. </li><li> Enfriar diapositivas durante 20 minutos. </li><li> Lavar los portaobjetos en el 0,05% PBST durante 5 minutos en el balancín. </li></ol></li><li> El bloqueo de procedimiento <ol class="lroman"><li> El tratamiento de las secciones de peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 min. </li><li> Lavar los portaobjetos en el 0,05% PBST durante 5 minutos en el balancín. </li><li> Agregar las secciones de bastidor inmunotinción Sequenza. </li><li> El tratamiento de las secciones en el bloque de proteína de suero libre durante 10 minutos. </li></ol></li><li> Incubación del anticuerpo primario <ol class="lroman"><li> Incubar anticuerpos primarios diluidos a la dilución óptima de diluyente para anticuerpos Dako durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Enjuague en el 0,05% PBST tres veces por 5 minutos cada uno. </li></ol></li><li> Máscara epiteliales (citoqueratina) de incubación <ol class="lroman"><li> Incubar el ratón anti-citoqueratina pan, diluida 1:50 en diluyente para anticuerpos Dako la noche a 4 ° C. </li></ol></li><li> Visualización de la máscara del epitelio <ol class="lroman"><li> Prepare una dilución 1:25 de la cabra anti-ratón Alexa555 santicuerpos econdary en el pre-diluido Envision cabra-conejo HRP solución de anticuerpos. Incubar los portaobjetos en la oscuridad durante 1,5 horas a temperatura ambiente. </li><li> Enjuague en el 0,05% PBST tres veces durante 5 minutos cada uno. </li></ol></li><li> Objetivo de la visualización <ol class="lroman"><li> La transferencia de las diapositivas de la Sequenza para la cámara de humedad. </li><li> Combinar la señal de destino diluyente de amplificación (HistoRx E bañera) y el tiramida Cy5 (F HistoRx tubo) a las 1:50 de concentración. Vortex para mezclar completamente. Incubar los portaobjetos en la oscuridad durante 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Enjuague en el 0,05% PBST tres veces por 5 minutos cada uno. </li><li> Deshidratar las diapositivas en etanol al 80% durante 1 min. </li><li> El aire seco se desliza en la oscuridad. </li></ol></li><li> Contratinción y cubreobjetos <ol class="lroman"><li> Aplicar DAPI medio de montaje en el cubreobjetos y colocar el cubreobjetos sobre las secciones de tejido. </li><li> Diapositivas secar durante la noche en la oscuridad. </li><li> Después de las diapositivas se han secado, seguro y con esmalte de uñas enpreservación que a largo plazo y mantener en un 4 ° C refrigerador. </li></ol></li></ol> 3. Captura de imágenes utilizando la exploración sección completa <ol class="lalpha"><li> Cargar hasta cinco transparencias en la bandeja del escáner de diapositivas Aperio ScanScope diapositivas FL. </li><li> Para cada diapositiva, seleccione la región en general a la imagen utilizando la interfaz de la consola de ScanScope. Seleccione la región para abarcar todos los tejidos en la diapositiva, independientemente de su patrón de tinción u otros aspectos observables de la muestra. </li><li> Uso de la Consola ScanScope, para cada canal (DAPI, Cy3 y Cy5) determinar una exposición óptima de la siguiente manera: <ol class="lroman"><li> Seleccionar un área de tejido para interrogar - esta área debe, idealmente, en la región del tumor de los tejidos para proporcionar la mejor representación. </li><li> Utilizando la función de exposición automática ScanScope consola, evaluar el tiempo de exposición sugerido para cada canal, junto con el enfoque de la imagen. </li><li> Repetir hasta 3-5 regiones de cada muestra de cooperaciónnfirm estabilidad del valor. </li></ol></li><li> Seleccione una región adicional (como se muestra por un diamante azul en la imagen de la consola ScanScope) del tejido, y aún dentro de la región coverslipped de la diapositiva, para definir un área de fondo plano, donde las imágenes corrección de campo será adquirido para cada filtro. </li><li> Revisión de las imágenes antes de la adquisición de la imagen. Si las imágenes parecen tener de fondo de alta u otros artefactos de la imagen, la imagen de la región deberán desplazarse y adquirir nuevas imágenes. </li><li> Las imágenes adquiridas digitales de diapositivas se cargan automáticamente en la base de datos del espectro Aperio. </li></ol> 4. AQUA análisis automatizado de imágenes <ol class="lalpha"><li> Ver las imágenes digitales conjunto de diapositivas en la base de datos del espectro y anotar las áreas tumorales de interés en el contexto de todo el tejido y el patrón de tinción (s). </li><li> Seleccione la diapositiva a analizar el uso AQUAnalysis de la lista de diapositivas digitales en la base de datos del espectro haciendo doble clic en el pulgarimagen de las uñas (o bien, seleccione la casilla de verificación junto a la imagen y seleccione "Ver imágenes" en el menú en la parte superior de la lista). Esto abre automáticamente el software ImageScope y color de la imagen fusionada de la muestra de tejido. </li><li> Utilice este software para navegar por la imagen utilizando las herramientas proporcionadas. </li><li> Usando el acompañamiento de H &amp; E (ya sea física o la diapositiva una imagen comentada), anotar la región de interés en la imagen fluorescente. Varias regiones de interés, cada círculo áreas, se pueden seleccionar en una sola muestra. También hay una "negativa" la herramienta que se utiliza para excluir las áreas dentro de una región seleccionada (es decir, los tejidos dañados, las áreas de los pobres de la histología, no tumorales zonas, escombros, etc.) </li><li> Salvar la capa de anotación (s) en la imagen. </li><li> Volver al menú principal de Spectrum y seleccione la casilla de verificación situada junto a la imagen que estaba anotado. Seleccione "Analizar" de la barra del menu en la parte superior de la lista. </li><li> En la ventana de análisis que se van a plantear, select "HistoRx AQUA Análisis" en el menú desplegable. </li><li> Si hay varias capas de anotaciones, utilice las casillas de verificación para seleccionar la capa adecuada (s) para su análisis. </li><li> Pulse el botón 'Analizar' botón cuando esté listo para comenzar. </li><li> En este punto, una ventana de consola minimizada aparecerá en la barra de tareas de Windows. Se mostrará el progreso de la transferencia de imágenes a partir de la base de datos del espectro de la PC local (el "tirón" de operación). </li><li> Una vez que los datos se transfieren, AQUAnalysis pondrá en marcha. El usuario puede utilizar todas las funciones internas del software para visualizar, navegar y analizar las imágenes. </li><li> La región comentada de la imagen de la base de datos del espectro se divide en 512x512 píxel de la imagen azulejos - cada uno de los cuales serán calificados individualmente. </li><li> Para este estudio, un algoritmo no supervisado AQUA puntuación, basada en el agrupamiento de datos, se utilizó 8. En este algoritmo, se generan resultados AQUA de la siguiente manera: <ol class="lroman"><li> La imagen de pan-citoqueratina signal es un umbral por encima del fondo y los píxeles se utilizan para definir un tumor "máscara" que luego se utiliza para los cálculos posteriores. La expresión de alta citoqueratina pan-píxeles también definen las regiones citoplásmicas / no nucleares de las células tumorales. </li><li> Los píxeles con alta señal en el canal DAPI que se encuentran dentro de la máscara de tumor se identifican como nucleares en la naturaleza. </li><li> El algoritmo de clustering también analiza los píxeles que tienen baja intensidad, ya sea para DAPI o expresión de citoqueratina y los intentos de los atribuyen en parte a cualquiera de los compartimentos nucleares o citoplasmáticos, o de fondo. </li><li> Una vez que todos los pixeles son asignados a uno de los compartimentos del tumor o de fondo, la intensidad de la señal de la proteína diana (ER o HER2) se calcula en cada uno de los compartimentos y se normaliza el tamaño de los compartimentos, lo que produce resultados AQUA. </li><li> Imágenes que no tienen representación suficiente del tumor no fue evaluado (como se define por aquellos que tienen less del 5% de píxeles que representan tumor). Estas regiones también producen un valor 'Resultado final' llamado 'Fail' y por lo tanto puede ser eliminado en posteriores análisis estadísticos. </li><li> Además, si después de la revisión, los agentes identificaron los campos que no eran adecuados para la calificación debido a la muestra o los artefactos de imagen (por ejemplo, los tejidos cruzados escombros), los campos fueron redactados a partir de puntuación y produjo un 'resultado final' llamado 'Fail'. </li></ol></li><li> Los resultados de la puntuación AQUA son las tablas de resultados asociados a cada baldosa pixel 512x512 en la región de interés dentro de una muestra de tejido sección entera. Estos archivos, en formato. CSV, entonces se puede utilizar para su posterior análisis estadístico. </li></ol> 5. Análisis estadístico: Todos los análisis estadísticos se realizaron en SPSS (IBM) <ol><li> Siempre que sea posible, para las grandes operaciones, generar archivos de SPSS la sintaxis del código (. MSF) para llevar a cabo manipulaciones de datos y los pasos de análisis. Código de ejemplo de la sintaxis se presenta como archivos suplementarios. </li><li leer archivos de datos en spss. eliminaci variables utilizadas los brutos ejemplo par instrumentos espec resultados aqua no utilizados compartimentos><li> Donde las regiones tienen un 'Resultado final' de 'Fail' (ver arriba), marca estos valores como SYSMIS, que las aleja de los análisis numéricos. </li><li> Todos los datos agregados para todas las diapositivas para cada marcador (ER o HER2) en un único conjunto de datos maestros en formato SPSS. Utilice este archivo maestro para todos los cálculos posteriores. </li><li> El uso de un archivo de sintaxis SPSS (una para cada marcador: ER o HER2 (ver archivos adicionales sintaxis) los datos fue validada y Simpson índices de diversidad calculados de la siguiente manera: <ol class="lroman"><li> Generar un archivo maestro de análisis, con el fin de evitar la modificación de los datos maestros de establecer previamente generados. </li><li> Validar los datos maestros de conjunto con los datos en bruto y las imágenes generadas. </li><li> Elaborar estadísticas de resumen de las puntuaciones AQUA para cada muestra (número de campos, la puntuación media, mediana de la puntuación, minimupuntuación de m, la máxima puntuación, y la desviación estándar de las puntuaciones de la muestra). </li><li> Disponibilidad de una muestra aleatoria de los resultados con los archivos originales en bruto de datos de salida y en contra de los datos de imagen sin anotó. </li></ol></li><li> Para generar las imágenes de mapa de calor (que se muestra en las figuras 2 y 3): <ol class="lroman"><li> "Bin" el Aqua Data puntuación (utilizando la función 'Agrupación visual "en SPSS) en ocho niveles individuales. Para ER, las puntuaciones nuclear se utilizaron, para HER2, las puntuaciones se utilizaron citoplasmática. </li><li> Derive contenedores de tal manera que cada compartimiento representa un porcentaje igual de casos disponibles en el conjunto de datos. </li><li> Use "Archivo Split 'la función de SPSS para que toda la producción posterior estaría en un nivel de' muestra por lámina /. </li><li> Parcela de cada región (que corresponde a una pieza 512x512) por sus coordenadas x, y y el color con un valor correspondiente a la papelera en la que fue asignado (ver figuras 2 y 3). </li></ol></li><li> Para generar resultados heterogeneidad, el código fue escrito para generar un Simpsoníndice de diversidad con el marcador en AQUA. <ol class="lroman"><li> El índice de Simpson de diversidad, como se usa aquí, se define como: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/3334/3334eq1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="La ecuación 1"> Donde N es el número total de calificaciones / campos que se utilizan para una determinada muestra y n es el número de calificaciones / los campos de un determinado grupo de puntajes estandarizados (como se ha descrito más adelante). </li></ol></li><li> Utilice el archivo maestro de análisis descrito anteriormente para origen de datos. En los ejemplos mostrados, todos los cálculos de ER utiliza el puntaje AQUA nuclear y HER2 cálculos utilizó la puntuación AQUA citoplasmática. Realizar los cálculos a continuación para cada muestra / diapositivas. </li><li> Puesto que los datos de fluorescencia está sujeto a la inestabilidad de la varianza, de tal manera que la magnitud de error se propaga con intensidad, aplicar logarítmica (base 2) la normalización de todas las puntuaciones de AQUA. </li><li> Además transformar el normalizado (transformación logarítmica) de datos en z (estándar) resultados. <ol class="lroman"><li> La transformación Z-score se calcula unas sigue: Z = (puntuación AQUA - promedio de todas las puntuaciones de una muestra) / desviación estándar de las puntuaciones de la muestra. Esto se traduce en la distribución de las puntuaciones en una distribución de las desviaciones en torno al valor central de la desviación cero. </li></ol></li><li> Bin estos valores Z-score en seis grupos (&lt;-2, -2 a -1, -1 - 0, 0-1, 1 - 2,&gt; 2). </li><li> Calcular el número de valores asignados en cada bandeja y la suma de cada bandeja. Utilice este valor, junto con el número total de campos, para calcular un valor para cada uno de los seis contenedores utilizados para el índice. </li><li> Suma de estos valores y restar uno para producir el índice de diversidad. </li><li> El índice de diversidad es un indicador de la difusión de resultados alrededor de la media para una muestra particular. Por lo tanto, mayores índices indican una propagación más amplia de resultados, o la mayor heterogeneidad de la expresión. Por el contrario, los menores índices, indican una menor variación en la medición de la expresión y la expresión homogénea en la muestra. Esto se ilustra en Figures 2 y 3. </li></ol> 6. Los resultados representativos: La terapia dirigida a agentes de toxicidad relativamente baja, como el tamoxifeno y el trastuzumab, no es estándar de cuidado para pacientes con cáncer de ovario. Hay buena evidencia de que el platino-taxanos quimioterapia de primera línea es superior a otros regímenes de quimioterapia para el cáncer de ovario 13.09, y mientras el 70-80% de los pacientes responden inicialmente, la mayoría de recaída y morir de su enfermedad. La medición de biomarcadores que puedan predecir la respuesta a las terapias alternativas podría ser útil en la selección de la terapia individualizada para cada paciente, ya que la presión y la quimioterapia ejerce sobre la selección de un tumor, las células tumorales sobreviven pueden poseer características diferentes y representan una subpoblación del tumor antes de la terapia, la cuantificación de esta cambio por lo tanto, podría ser útil. Hemos aplicado nuestro método de asociación y la heterogeneidad de la expresión de ER y HER2 en muestras de cáncer de ovario antes y después de la quimioterapia, en order para medir los cambios cuantitativos en la expresión, y evaluar la relación entre la expresión de biomarcadores antes y después del tratamiento. Ambos ER y HER2 demuestran una marcada heterogeneidad dentro de los tumores individuales, y en algunos tumores, los cambios del índice de Simpson tras el tratamiento de la heterogeneidad relativamente alta a baja heterogeneidad, representada por la disminución de las puntuaciones de Simpson índice (ver figuras 2 y 3). Esto apoya la noción de que la selección clonal se produce en respuesta a la quimioterapia citotóxica, que es más importante, esto puede ser explotado con la terapia dirigida contra la población residual, con el fin de personalizar mejor la terapia para pacientes con cáncer. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Hematoxilina y eosina microfotografías de las diferentes áreas del cáncer de ovario mismo mostrando la morfología variable. (A) x40 microfotografía muestra dos áreas adyacentes del tumor con mayor o morfología. Puntos de vista de alta potencia (x200) revelan células con citoplasma claro y un patrón sólido de crecimiento en la parte superior del tumor (B), mientras que la parte inferior del tejido (C) tiene un citoplasma eosinófilo más homogénea y un patrón de crecimiento papilar. Este tumor, sin embargo, ser clasificado como subtipo papilar seroso histológico a los efectos de su manejo ulterior. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Heatmaps La heterogeneidad de la expresión de proteínas en el ER-positivo citoqueratina de tejido de cáncer de ovario, antes (arriba) y después (abajo) la terapia. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Heatmaps heterogeneidad de expresión de la proteína HER2 en la citoqueratina-positivas tejido de cáncer de ovario, antes (arriba) y después de la terapia (panel inferior).

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</ol>

JC, MG, CJ y CS son empleados de HistoRx, Inc.

El método descrito en este documento permite la cuantificación de la heterogeneidad molecular en el estándar fijado en formol e incluido en parafina cortes histológicos de material tumoral. El método permite a un valor que se asigna el grado de heterogeneidad en una sección de tejido, por lo que este se pueda tomar en cuenta como una variable en el desarrollo de biomarcadores y el análisis. Aunque, en general, es preferible que los biomarcadores de tejidos son homogéneos con respecto a la expresión, por lo que el ensayo es menos susceptible a errores de muestreo o de sesgo, es posible que en algunas circunstancias, ser útil para cuantificar la heterogeneidad como un parámetro. Por ejemplo, como se muestra en el ejemplo ilustrativo de ER y HER2, los marcadores biológicos comunes muestran una considerable heterogeneidad de expresión y actualmente se desconoce si esto representa un factor independiente de pronóstico o predictivo con respecto a los resultados clínicos o la respuesta al tratamiento, respectivamente. Del mismo modo, como se ilustra, la terapia se podría alterar la dinámicapoblaciones constituyentes de las células, y por lo tanto la medición de enriquecimiento de destino puede ser útil para guiar las decisiones de tratamiento. Sin embargo, la técnica está limitada por los mismos factores que limitan el tradicional análisis histopatológico o biomarcadores (por ejemplo, inmunohistoquímica). El resultado depende del tipo, tamaño y calidad del tejido que se analiza, y por lo tanto una sección de tejido sola puede no ser representativa de todo el tumor. De hecho, el índice de Simpson puede ser excesivamente sesgado por el tamaño de los tejidos (número de fotogramas capturados y midieron los índices de AQUA). La inmunogenicidad de los epítopos que se está midiendo puede ser objeto de pre-analítica incontrolables factores que artificialmente alterar su expresión a través de la sección de tejido (por ejemplo, tiempo de isquemia fría, o la longitud de la fijación, y el artefacto de borde). Esto es particularmente un problema para la fosfo-epítopos, que son muy lábiles 14, 15. Por lo tanto, la técnica podría ser más adecuadade muestras de resección en lugar de pequeñas biopsias, y se realizó en varias secciones en lugar de uno solo. En última instancia, las técnicas de imagen en 3D podría ofrecer una oportunidad a una mejor cuantificación de este parámetro. La técnica que se presenta también puede estar limitado por factores biológicos, como la variabilidad en la expresión del epítopo enmascaramiento citoqueratina. Esto puede ser especialmente preocupante en aquellos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de ovario y de mama, que se someten a la transición epitelio-mesenquimal de transición (EMT) o se enriquecen por falta de componentes epiteliales o células madre de 16 años, como ha sido recientemente demostrado que se producen en la quimioterapia tratar el cáncer de ovario in vitro 17, y en pacientes con cáncer de mama en la respuesta al tratamiento 18. Esta limitación puede ser superada utilizando anticuerpos alternativa adhesiva (o cócteles de anticuerpos), como citoqueratina vimentina además, que es regulada en EMT 16. Además, dado que los otros componentes del tejido (el micrófonoroenvironment), como los fibroblastos o células del endotelio vascular son también cada vez más el blanco de las terapias biológicas, la técnica también puede ser ampliado para anotar estos componentes, el uso de máscaras específicas para los compartimientos de interés, tales como PECAM / CD31 a las manchas de las células endoteliales vasculares . A pesar de la adaptación del índice de Simpson se ha utilizado como una medida de la heterogeneidad en el protocolo actual, debido a su simplicidad, otras medidas de heterogeneidad podría ser utilizado, como las mediciones simples de tendencia central (media, la varianza, la mediana, etc.) Además, los cálculos del índice de Simpson podría ser modificado para adaptarse mejor a una población de prueba en particular. El uso de la Z-score transformaciones permite el marcador sea más aplicable a múltiples marcadores ya que la heterogeneidad se basa en la desviación alrededor de la media de un conjunto de datos. Sin embargo, el rango de general de puntuación puede ser limitada en este tipo de transformación. Algunos diseños pueden ser más adecuadossimplemente bin los resultados AQUA reales para todas las muestras de un conjunto marcador particular. La selección del número de papeleras y los cortes es también una limitación en el rango de valores que puede dar lugar y puede ser optimizado para diseños alternativos de experimentación. Hemos utilizado ER y HER2 en el presente estudio como biomarcadores candidatos, puesto que ya se utilizan en la clínica, ayudar a responder preguntas relevantes clínicos con respecto a la eficacia de las terapias dirigidas, y se sabe que presentan una considerable heterogeneidad y el cambio en la educación primaria y distante la enfermedad 19. Sin embargo, el marcador óptimo de la heterogeneidad que queda por determinar. Otras posibilidades podrían incluir marcadores citogenéticos de clonalidad, tales como los utilizados anteriormente en el estudio de los peces interfase 20. El enfoque requiere una validación adicional en grandes cohortes, clínicas bien anotado o ensayos clínicos con el fin de consolidar aún más la relevancia de este parámetro en la biología del cáncer.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> ScanScope FL </td><td> Aperio </td><td> ScanScope FL </td><td> Se utiliza como dotado de un vendedor </td></tr><tr><td> Espectro </td><td> Aperio </td><td> Espectro </td><td> Números de la configuración y el catálogo pueden variar en cómo las instituciones locales a crear su base de datos y la estructura de TI. </td></tr><tr><td> AQUAnalysis, junto con AQUAjustment </td><td> HistoRx </td><td> V2.3 </td><td> El paquete permite AQUAjustment AQUAnalysis el uso de imágenes almacenados en el espectro. </td></tr><tr><td> HER2 </td><td> Dako </td><td> A0485 </td><td> Dilución de 1 en 400 </td></tr><tr><td> ratón anti-citoqueratina pan </td><td> Dako </td><td> M3515 </td><td> 1 de cada 50 de dilución </td></tr><tr><td> Diluyente de anticuerpos </td><td> Dako </td&gt; <td> S0809 </td><td></td></tr><tr><td> Envision cabra-conejo HRP </td><td> Dako </td><td> K4003 </td><td></td></tr><tr><td> Proteína bloque </td><td> Dako </td><td> X0909 </td><td></td></tr><tr><td> Cabra anti-ratón Alexa555 </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI medio de montaje </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td> Cy5 tiramida </td><td> HistoRx </td><td> AQ-EMR1-00001 </td><td></td></tr><tr><td> Sequenza Centro de inmunotinción </td><td> Thermo Scientific Shandon </td><td> 73300001 </td><td> Se utiliza aquí para la tinción de inmunofluorescencia de sobremesa </td></tr></tbody></table>

mapeo de la heterogeneidad de la expresión de proteínas en los tumores utilizando inmunofluorescencia cuantitativa

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Heterogeneidad morfológica dentro de un tumor individual es bien reconocida por los histopatólogos en la práctica quirúrgica. Si bien esto suele adoptar la forma de las áreas de la diferenciación en distintos subtipos histológicos reconocido, o el grado patológico diferentes, a menudo hay diferencias más sutiles en el fenotipo que desafían la clasificación exacta (Figura 1). En última instancia, ya que la morfología está determinada por el fenotipo molecular subyacente, las zonas con diferencias visibles suelen ser acompañados por las diferencias en la expresión de proteínas que orquestan la función celular y la conducta, y por lo tanto, la apariencia,. La importancia de la visible y lo invisible (molecular) la heterogeneidad en el pronóstico se desconoce, pero la evidencia reciente sugiere que, al menos en el nivel genético, la heterogeneidad que existe en el 1,2 del tumor primario, y algunos de estos clones sub-dan lugar a metástasis ( y por lo tanto mortal) enfermedad. Además, algunas proteínas sonmedida como biomarcadores, ya que son los objetivos de la terapia (por ejemplo, ER y HER2 para el tamoxifeno y el trastuzumab (Herceptin), respectivamente). Si estas proteínas muestran una expresión variable dentro de un tumor luego las respuestas terapéuticas también puede ser variable. Los esquemas utilizados histopatológico de puntuación de inmunohistoquímica o bien ignoran, o numéricamente homogeneizar la cuantificación de la expresión de la proteína. Del mismo modo, en las técnicas destructivas, donde las muestras se homogeneizan tumor (por ejemplo, perfiles de expresión génica), la información cuantitativa puede ser dilucidado, pero la información espacial se pierde. Enfoques de mapeo genético heterogeneidad en el cáncer de páncreas se han basado tanto en la generación de una suspensión de células individuales 3 o el 4 de macrodissection. Un reciente estudio ha utilizado los puntos cuánticos, para trazar la heterogeneidad morfológica y molecular en el cáncer de próstata tejido 5, aportando la prueba de principio de que la asignación de la morfología y la molecular es factible, pero que entren short de la cuantificación de la heterogeneidad. Dado que la inmunohistoquímica es, como mucho, sólo semi-cuantitativos y sujetos al sesgo intra-e inter-observador, más sensible y metodologías cuantitativas son necesarias con el fin de mapear con precisión y cuantificar la heterogeneidad del tejido in situ. Hemos desarrollado y aplicado una metodología experimental y estadístico para cuantificar sistemáticamente la heterogeneidad de la expresión de proteínas en secciones de tejido conjunto de los tumores, con base en el análisis automatizado cuantitativo (AQUA) del sistema 6. Las secciones de tejido son marcadas con anticuerpos específicos dirigidos contra citoqueratinas y los objetivos de interés, junto al fluoróforo anticuerpos secundarios marcados. Las diapositivas son imágenes con un escáner de fluorescencia conjunto de diapositivas. Las imágenes se dividen en cientos de miles de azulejos, baldosas y cada uno se le asigna una puntuación de AQUA, que es una medida de la concentración de proteínas en las células epiteliales (tumor), componente de los tejidos. Heatmaps se generan para representar la expresión de las proteínas de los tejidos y una puntuación heterogeneidad asignado, utilizando una medida estadística de la heterogeneidad utilizado originalmente en la ecología, basado en el índice de Simpson biodiversidad 7. Hasta la fecha no ha habido intentos de mapa de forma sistemática y cuantificar esta variabilidad junto con la expresión de proteínas, en las preparaciones histológicas. Aquí se ilustra el primer uso del método aplicado para ER y HER2 expresión de biomarcadores en cáncer de ovario. El uso de este método abre el camino para el análisis de la heterogeneidad como una variable independiente en los estudios de expresión de biomarcadores en estudios de traducción, a fin de establecer la importancia de la heterogeneidad en el pronóstico y predicción de respuesta al tratamiento.

Aquí se describe un método para cuantificar la heterogeneidad molecular en los cortes histológicos de material tumoral mediante inmunofluorescencia cuantitativos, análisis de imágenes, y una medida estadística de la heterogeneidad. El método está pensado para su uso en el desarrollo de biomarcadores clínicos y estudios.

Mapeo de la heterogeneidad de la expresión de proteínas en los tumores utilizando inmunofluorescencia cuantitativa

La heterogeneidad morfológica dentro de un tumor individual es ampliamente reconocida por los histopatólogos en la práctica quirúrgica. Si bien esto a menudo se presenta en forma de...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en cuantificar con precisión la expresión de biomarcadores en secciones completas de tejido de cáncer humano, con el fin de asignar un valor numérico al grado de heterogeneidad en la expresión proteica. Esto se logra primero escaneando secciones de tejido tumoral marcadas con inmunofluorescencia mediante un escáner fluorescente de portaobjetos completo. A continuación, se seleccionan regiones de interés dentro del tumor para su evaluación.Luego, la expresión de la proteína de interés dentro de las áreas tumorales invasivas se cuantifica utilizando el sistema automatizado de análisis de imágenes aqua analysis. En última instancia, este método puede utilizarse para mapear la expresión de biomarcadores en tejido canceroso, que a menudo es muy heterogéneo a lo largo de la sección del tejido. La ventaja principal de usar estas técnicas frente a métodos tradicionales, como la inmunohistoquímica con reactivos de visualización colorimétrica y métrica, es que la inmunofluorescencia es más cuantitativa y más sensible.La combinación de estos métodos analíticos con un escaneo de inmunofluorescencia de sección completa permite una cartografía detallada de las variaciones sutiles en la expresión de biomarcadores a través de los tejidos. Por primera vez, Mark Gustafson, director directo de operaciones en el laboratorio Histo RX, demuestra estos procedimientos. Después del corte con micrótomo de una biopsia de tejido canceroso y la tinción por inmunofluorescencia de la muestra para detectar la expresión de los biomarcadores de interés, cargue hasta cinco portaobjetos con las secciones teñidas en el casete del escáner de portaobjetos.Luego, utilizando la interfaz en la consola del microscopio de escaneo. Para cada portaobjetos, seleccione una región que incluya todo el tejido del portaobjetos, independientemente del patrón de tinción u otros aspectos observables de la muestra. A continuación, utilizando la consola del microscopio de escaneo, primero seleccione una región de tejido para evaluar, idealmente dentro de la región tumoral del tejido, para obtener la mejor representación posible.Ahora, utilizando la función de exposición automática de la consola del microscopio de exploración, determine el tiempo de exposición para cada canal junto con el enfoque de la imagen. Utilice el diamante azul en la imagen de la consola del microscopio de exploración para seleccionar una región adicional alejada del tejido, pero aún dentro de la zona del portaobjetos bajo el cubreobjetos, a fin de definir el área de fondo donde se adquirirán las imágenes de corrección de campo plano. Para cada filtro, añada puntos de enfoque en el área del tejido representada por los cuadrados amarillos para optimizar la captura de imágenes. Si las imágenes presentan un fondo elevado u otros artefactos, se debe mover la región de la imagen y adquirir nuevas imágenes.A continuación, se escanea el tejido y las imágenes digitales de las láminas adquiridas se cargan automáticamente en la base de datos Aperio Spectrum. Haga doble clic en la imagen en miniatura para que el programa Spectrum seleccione la lámina para análisis a partir de la lista de láminas digitales en la base de datos Spectrum. Luego, utilizando la imagen anotada de h y D adjunta, anote la región de interés en la imagen fluorescente.Pueden seleccionarse múltiples regiones de interés delimitadas con círculos individuales en una sola muestra. Las imágenes anotadas se guardan automáticamente en la base de datos de espectros. Ahora, cuando aparezca la ventana de análisis, seleccione Analizar en la barra de menú en la parte superior de la pantalla y luego seleccione análisis histo RX aqua en el menú desplegable.Cuando esté listo para comenzar, presione el botón de análisis. Aparecerá una ventana de consola minimizada en la barra de tareas de Windows mostrando el progreso de la transferencia de las imágenes desde la base de datos Spectrum al equipo local. Una vez que los datos se hayan transferido, se iniciará el análisis aqua para generar una puntuación aqua mediante un algoritmo de puntuación aqua no supervisado basado en la agrupación de datos de un primer umbral de muestra, la señal de imagen de pan citokeratina por encima de la señal de fondo de la imagen. Esto permitirá el uso de los píxeles para definir una máscara de tumor que luego podrá utilizarse para cálculos posteriores.Utilice los píxeles de citokeratina pan de alta expresión para definir también las regiones citoplasmáticas o no nucleares de las células tumorales. Como se observa aquí, los píxeles con una señal alta en el canal DPI que se encuentran dentro de la máscara tumoral se identifican como de naturaleza nuclear. Si tras revisar se identifican campos que no son adecuados para la puntuación debido a artefactos de la muestra o de imagen, dichos campos se excluyen de la puntuación y también producirán un resultado final de fallido.Los resultados de la puntuación aqua se representan como una tabla de puntuaciones asociadas a cada tesela de 512 por 512 píxeles en la región de interés dentro de una muestra completa de sección de tejido, que puede guardarse y utilizarse para análisis estadísticos posteriores. Estas microfotografías teñidas con hematoxilina y eosina demuestran cómo diferentes áreas del mismo cáncer de ovario pueden presentar morfología variable. La vista de alto aumento en la parte superior derecha de la Figura B resalta células con clarificación citoplasmática y un patrón de crecimiento sólido en la parte superior del tumor.La parte inferior del tejido ampliada en la sección inferior derecha de la Figura C, sin embargo, presenta un citoplasma eosinófilo más homogéneo y un patrón de crecimiento papilar. Aquí se muestran, en los paneles superior e inferior respectivamente, los mapas térmicos de heterogeneidad de la expresión de ER en una sección de tejido de cáncer de ovario antes y después de un tratamiento con quimioterapia. Obsérvese el cambio desde una expresión variable de ER a lo largo de la sección, con regiones de expresión alta y baja, en la figura superior, hacia una distribución uniforme de alta expresión de ER ilustrada en rojo en la figura inferior.La representación numérica de este cambio se indica a la izquierda por la disminución del índice de Simpson. En esta figura se muestran nuevamente los mapas térmicos de heterogeneidad de HER2 en una sección de tejido de cáncer de ovario antes y después del tratamiento, como se observa en los paneles superior e inferior, respectivamente. Obsérvese nuevamente el cambio desde una expresión variable de HER2 a lo largo de la sección, con regiones de expresión alta y baja en la figura superior, hacia una distribución uniforme de alta expresión de HER2 en la figura inferior.Una vez más, se observa que el índice de Simpson disminuye. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que la calidad de los datos generados por el análisis computacional es tan buena como la calidad de la tinción, y esta debe cumplir con un alto estándar técnico.

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Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

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