Mapeo de la heterogeneidad de la expresión de proteínas en los tumores utilizando inmunofluorescencia cuantitativa

El objetivo general del siguiente experimento consiste en cuantificar con precisión la expresión de biomarcadores en secciones completas de tejido de cáncer humano, con el fin de asignar un valor numérico al grado de heterogeneidad en la expresión proteica. Esto se logra primero escaneando secciones de tejido canceroso marcadas con inmunofluorescencia mediante un escáner fluorescente de portaobjetos completo. A continuación, se seleccionan regiones de interés dentro del tumor para su evaluación.

Luego, la expresión de la proteína de interés dentro de las áreas tumorales invasivas se cuantifica utilizando el sistema automatizado de análisis de imágenes aqua analysis. En última instancia, este método puede utilizarse para mapear la expresión de biomarcadores en tejido canceroso, que a menudo es muy heterogéneo a lo largo de la sección del tejido. La ventaja principal de usar estas técnicas frente a métodos tradicionales, como la inmunohistoquímica con reactivos de visualización colorimétrica y métrica, es que la inmunofluorescencia es más cuantitativa y más sensible.

La combinación de estos métodos analíticos con un escaneo de inmunofluorescencia de sección completa permite un mapeo detallado de las variaciones sutiles en la expresión de biomarcadores a través de los tejidos. Por primera vez, Mark Gustafson, director directo de operaciones en el laboratorio Histo RX, demuestra estos procedimientos. Después del corte con micrótomo de una biopsia de tejido canceroso y la tinción de inmunofluorescencia de la muestra para detectar la expresión de los biomarcadores de interés, cargue hasta cinco portaobjetos con las secciones teñidas en el casete del escáner de portaobjetos.

Luego, utilizando la interfaz en la consola del microscopio de escaneo. Para cada portaobjetos, seleccione una región que incluya todo el tejido en el portaobjetos, independientemente del patrón de tinción u otros aspectos observables de la muestra. A continuación, utilizando la consola del microscopio de escaneo, primero seleccione una región de tejido para evaluar, idealmente dentro de la región tumoral del tejido, para obtener la mejor representación posible.

Ahora, utilizando la función de exposición automática de la consola del microscopio de exploración, determine el tiempo de exposición para cada canal junto con el enfoque de la imagen. Utilice el diamante azul en la imagen de la consola del microscopio de exploración para seleccionar una región adicional alejada del tejido, pero aún dentro de la región del portaobjetos bajo el cubreobjetos, a fin de definir el área de fondo donde se adquirirán las imágenes de corrección de campo plano. Para cada filtro, agregue puntos de enfoque al área del tejido representada por los cuadrados amarillos para optimizar la captura de imágenes. Si las imágenes presentan un fondo elevado u otros artefactos, se debe mover la región de la imagen y adquirir nuevas imágenes.

A continuación, se escanea el tejido y las imágenes digitales de las láminas adquiridas se cargan automáticamente en la base de datos Aperio Spectrum. Haga doble clic en la imagen en miniatura para que el programa Spectrum seleccione la lámina para análisis a partir de la lista de láminas digitales en la base de datos Spectrum. Luego, utilizando la imagen anotada de h y D adjunta, anote la región de interés en la imagen fluorescente.

Pueden seleccionarse múltiples regiones de interés delimitadas con círculos individuales en una sola muestra. Las imágenes anotadas se guardan automáticamente en la base de datos de espectros. Ahora, cuando aparezca la ventana de análisis, seleccione Analizar en la barra de menú en la parte superior de la pantalla y luego seleccione análisis histo RX aqua en el menú desplegable.

Cuando esté listo para comenzar, presione el botón de análisis. Aparecerá una ventana de consola minimizada en la barra de tareas de Windows mostrando el progreso de la transferencia de las imágenes desde la base de datos Spectrum al ordenador local. Una vez que los datos se hayan transferido, se iniciará el análisis aqua para generar una puntuación aqua mediante un algoritmo de puntuación aqua no supervisado basado en la agrupación de datos de un primer umbral de muestra, la señal de imagen de pan-citokeratina por encima de la señal de fondo de la imagen. Esto permitirá el uso de los píxeles para definir una máscara de tumor que luego podrá utilizarse para cálculos posteriores.

Utilice los píxeles de citokeratina pan de alta expresión para definir también las regiones citoplasmáticas o no nucleares de las células tumorales. Como se observa aquí, los píxeles con una señal alta en el canal DPI que se encuentran dentro de la máscara tumoral se identifican como de naturaleza nuclear. Si tras revisar se identifican campos que no son adecuados para la puntuación debido a artefactos de la muestra o de imagen, dichos campos se excluyen de la puntuación y también producirán un resultado final de fallido.

Los resultados de la puntuación aqua se representan como una tabla de puntuaciones asociadas a cada tesela de 512 por 512 píxeles en la región de interés dentro de una muestra completa de sección de tejido, que puede guardarse y utilizarse para análisis estadísticos posteriores. Estas microfotografías teñidas con hematoxilina y eosina demuestran cómo diferentes áreas del mismo cáncer de ovario pueden presentar morfología variable. La vista de alto aumento en la parte superior derecha de la Figura B resalta células con clarificación citoplasmática y un patrón de crecimiento sólido en la parte superior del tumor.

La parte inferior del tejido ampliada en la sección inferior derecha de la Figura C, sin embargo, presenta un citoplasma eosinófilo más homogéneo y un patrón de crecimiento papilar. Aquí se muestran, en los paneles superior e inferior respectivamente, mapas térmicos de heterogeneidad de la expresión de ER en una sección de tejido de cáncer de ovario antes y después de un tratamiento con quimioterapia. Obsérvese el cambio desde una expresión variable de ER a lo largo de la sección, con regiones de expresión alta y baja, en la figura superior, hacia una distribución uniforme de alta expresión de ER ilustrada en rojo en la figura inferior.

La representación numérica de este cambio se indica a la izquierda por la disminución del índice de Simpson. En esta figura se muestran nuevamente los mapas térmicos de heterogeneidad de HER2 en una sección de tejido de cáncer de ovario antes y después del tratamiento, como se observa en los paneles superior e inferior, respectivamente. Obsérvese nuevamente el cambio desde una expresión variable de HER2 a lo largo de la sección, con regiones de expresión alta y baja en la figura superior, hacia una distribución uniforme de alta expresión de HER2 en la figura inferior.

Una vez más, se observa que el índice de Simpson disminuye. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que la calidad de los datos generados por el análisis computacional depende únicamente de la calidad de la tinción, la cual debe cumplir con un alto estándar técnico.