Mapeo de la heterogeneidad de la expresión de proteínas en los tumores utilizando inmunofluorescencia cuantitativa

El objetivo general del siguiente experimento es cuantificar con precisión la expresión de biomarcadores en secciones completas de tejido humano con el fin de asignar un valor numérico al grado de heterogeneidad en la expresión de proteínas. Esto se logra escaneando primero secciones de tejido canceroso marcadas con inmunofluorescencia utilizando un escáner fluorescente de portaobjetos completo. Las siguientes regiones de interés dentro del tumor se seleccionan para su evaluación.

A continuación, se cuantifica la expresión de la proteína de interés dentro de las áreas tumorales invasivas utilizando el sistema automatizado de análisis de imágenes AquaAnalysis. En última instancia, este método se puede utilizar para mapear la expresión de biomarcadores en el tejido canceroso, que a menudo es muy heterogéneo en toda la sección de tejido. La principal ventaja del uso de estas técnicas sobre los métodos tradicionales, como la inmunohistoquímica con reactivos de visualización en color y métricos, es que la inmunofluorescencia es más cuantitativa y más sensible.

Al combinar estos métodos analíticos con una sección completa, el escaneo de inmunofluorescencia permite un mapeo detallado de variaciones sutiles en la expresión de biomarcadores en los tejidos. Mark Gustafson, director directo de operaciones del laboratorio Histo RX, demuestra por primera vez estos procedimientos. Después de la sección del micrótomo, la biopsia de tejido canceroso y la tinción inmunofluorescente del espécimen para la expresión de los biomarcadores de interés, cargue hasta cinco portaobjetos de las secciones teñidas en el casete de portaobjetos del escáner de portaobjetos.

A continuación, utilice la interfaz de la consola del ámbito de exploración. Para cada portaobjetos, seleccione una región que abarque todo el tejido del portaobjetos, independientemente del patrón de tinción u otros aspectos observables de la muestra. A continuación, utilizando la consola del osciloscopio de exploración, primero seleccione una región de tejido para evaluar idealmente dentro de la región tumoral del tejido para proporcionar la mejor representación.

Ahora, usando la función de exposición automática de la consola de alcance de escaneo, determine el tiempo de exposición para cada canal junto con el enfoque de la imagen, use el diamante azul en la imagen de la consola de visor de escaneo para seleccionar una región adicional lejos del tejido, pero aún dentro de la región de la diapositiva debajo del cubreobjetos para definir el área de fondo donde se adquirirán las imágenes de corrección de campo plano. Para cada filtro, agregue puntos de enfoque al área de tejido representada por cuadrados amarillos para optimizar la captura de imágenes. Si las imágenes parecen tener un fondo alto u otros artefactos de imagen, se debe mover la región de la imagen y adquirir nuevas imágenes.

A continuación, se escanea el tejido y las imágenes digitales de portaobjetos adquiridas se cargan automáticamente en la base de datos de espectro de Aperio. Haga doble clic en la imagen en miniatura del programa de espectro para seleccionar la diapositiva para su análisis de la lista de diapositivas digitales de la base de datos de espectro. A continuación, utilizando la imagen anotada h y D adjunta, anote la región de interés en la imagen fluorescente.

Se pueden seleccionar varias regiones de interés delineadas con círculos individuales en una sola muestra. Las imágenes anotadas se guardan automáticamente en la base de datos del espectro. Ahora seleccione Analizar en la barra de menú en la parte superior de la pantalla cuando aparezca la ventana de análisis, seleccione histo RX aqua analysis en el menú desplegable.

Cuando esté listo para comenzar, presione el botón analizar, aparecerá una ventana de consola minimizada en la barra de tareas de Windows que muestra el progreso de la transferencia de las imágenes de la base de datos de Spectrum a la computadora local. Una vez que se hayan transferido los datos, se iniciará el análisis de agua para generar una puntuación de agua utilizando un algoritmo de puntuación de agua no supervisado basado en la agrupación de datos de un primer umbral de muestra, la señal de imagen de citoqueratina panangular por encima de la señal de imagen de fondo. Esto permitirá el uso de los píxeles para definir una máscara tumoral que luego se puede utilizar para cálculos posteriores.

Utilice los píxeles de citoqueratina pan de alta expresión para definir también las regiones citoplasmáticas o no nucleares de las células tumorales. Como se ve aquí, los píxeles con una señal alta en el canal DPI que se encuentran dentro de la máscara tumoral se identifican como de naturaleza nuclear. Si al revisar se identifican campos que no eran adecuados para la puntuación debido a artefactos de muestra o imagen, esos campos se eliminan de la puntuación y también producirán un resultado final de error.

Los resultados de la puntuación acuática se representan como una tabla de puntuaciones asociadas a cada mosaico de 512 por 512 píxeles en la región de interés dentro de una muestra de sección de tejido completa, que se puede guardar y utilizar para el análisis estadístico posterior. Estas fotomicrografías teñidas con hemat toin y eoin demuestran cómo diferentes áreas del mismo cáncer de ovario pueden exhibir una morfología variable. La vista de alta potencia en la parte superior derecha de la Figura B destaca las células con aclaramiento citoplasmático y un patrón sólido de crecimiento en la parte superior del tumor.

Sin embargo, la parte inferior del tejido ampliada en la sección inferior derecha de la figura C tiene un citoplasma eosinófilo más homogéneo y un patrón de crecimiento papilar. Aquí, los mapas de calor de heterogeneidad de la expresión de RE en una sección de tejido de cáncer de ovario antes y después de un tratamiento de quimioterapia se muestran en los paneles superior e inferior, respectivamente. Obsérvese el cambio de la expresión variable de ER en toda la sección con regiones de expresión alta y baja en la figura superior a una distribución uniforme de la expresión alta de ER ilustrada en rojo en la figura inferior.

La representación numérica de este cambio se denota a la izquierda por la disminución en el índice de Los Simpson. En esta figura, la heterogeneidad de los mapas de calor de HER dos en una sección de tejido del cáncer de ovario se muestran de nuevo antes y después de la terapia, como se observa en los paneles superior e inferior, respectivamente. Obsérvese de nuevo el cambio de la expresión variable HER dos en toda la sección con regiones de expresión alta y baja en la figura superior a una distribución uniforme de la expresión alta de HER dos en la figura inferior.

Una vez más, se observa que el índice de Los Simpson disminuye. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la calidad de los datos generados por el análisis computacional es tan buena como la calidad de la tinción, y esta debe ser de un alto estándar técnico.