Síntesis, de la Asamblea, y caracterización de una sola capa de nanopartículas de oro protegidas Films de Electroquímica de proteínas monocapa

El objetivo general del siguiente experimento consiste en sintetizar nanopartículas de oro estabilizadas con alquilo, conocidas como cúmulos protegidos por monocapa o MPC, y ensamblar estos materiales en estructuras de películas delgadas que se utilizan como interfaz de absorción para la electroquímica de monocapas de proteínas azarinas. Esto se logra primero protegiendo los coloides de oro con ligandos orgánicos para crear nanopartículas de oro rodeadas por una película de alcano-folato. A continuación, los MPC se anclan a sustratos de oro y vidrio y se conectan en películas delgadas multicapa unidas covalentemente, cuyo crecimiento se monitorea mediante mediciones ópticas y electroquímicas, así como mediante microscopía de sección transversal.

Luego, la proteína de transferencia de electrones azarina se absorbe en la interfaz y se realiza la telemetría cíclica en vacío para la electroquímica de monocapa de proteínas. Los resultados muestran que las interfaces de películas MPC creadas mediante este procedimiento permiten un análisis electroquímico más optimizado de la proteína adsorbida basado en la película MPC, proporcionando una interfaz de adsorción más homogénea y una cinética rápida de transferencia de electrones que carece de la dependencia tradicional de la distancia. La ventaja principal de esta técnica frente a la electroquímica proteica tradicional es que los electrodos modificados con películas de nanopartículas proporcionan una interfaz de absorción que da lugar a un comportamiento electroquímico más ideal, medido mediante fotometría cíclica.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que la síntesis incluye señales visuales importantes, mientras que la construcción y caracterización de la película implica múltiples pasos complejos y técnicas analíticas. Las películas de NPC pueden ensamblarse sobre electrodos de oro modificados o portaobjetos de vidrio mediante un método de inmersión cíclica con capas alternadas de MPC y moléculas de unión dile. Posteriormente, estas capas pueden rastrearse electroquímicamente u ópticamente hasta alcanzar el espesor deseado de la película.

Para sintetizar grupos de oro en una campana extractora con ventilación adecuada, comience disolviendo 1,1 gramos de bromuro de tetraoctilamonio en 30 mililitros de tolueno y disolviendo 0,38 gramos de borohidruro de sodio en aproximadamente 20 mililitros de agua ultrapurificada de 18 megaohmios, y déjelo enfriar en hielo durante al menos 30 minutos. A continuación, transfiera cuantitativamente una solución acuosa de ácido tetracloroaurico a la solución de bromuro de tetraoctilamonio en tolueno utilizando cinco mililitros adicionales de agua ultrapurificada. Con el fin de transferir la fase la solución acuosa de oro a la solución no acuosa, tápela ligeramente y agite vigorosamente durante 30 minutos.

Por lo tanto, mezcle bien las fases acuosa de color naranja quemado y no acuosa transparente. Transfiera ambas fases, la acuosa transparente y la no acuosa de color naranja quemado, a un embudo de separación. Deseche la capa acuosa y vierta la capa no acuosa en un matraz limpio.

Añada C seis y una proporción de dos a uno a la solución no acuosa que contiene hidrógeno tetraclororato. Agite durante 30 minutos para formar un polímero de oro uno, como lo indica un cambio de color de naranja rojizo a una solución amarilla pálida, casi incolora. Transfiera la mezcla de reacción a un baño de hielo aislado y enfríe a cero grados Celsius durante al menos 30 minutos con agitación; agregue cuantitativa y rápidamente la solución fría de borohidruro de sodio a la mezcla de reacción con el fin de reducir el oro uno a oro metálico en presencia de muslos.

Tras la adición, se formará instantáneamente una solución espesa y negra de agrupamientos de oro protegidos por monocapa o MPC. Agite la reacción durante la noche a cero grados Celsius al día siguiente. Transfiera la mezcla de reacción a un embudo de separación.

Deseche la capa acuosa en un vaso de desecho y evapore rotatoriamente la capa de tolueno no acuosa hasta sequedad casi completa, dejando un lodo negro espeso en el matraz. Precipite los MPC añadiendo acetonitrilo y deje la solución reposar durante la noche utilizando un filtro de vidrio de porosidad media con accesorios de goma y un matraz con tubuladura lateral conectado a un aspirador.

Recolecte los MPC mediante filtración al vacío y enjuague con una gran cantidad de acetonitrilo. Después de armar la celda tipo sándwich electroquímicamente, limpie el sustrato de oro realizando voltametría cíclica o CV en ventanas de potencial desde 0,2 hasta 0,9 voltios, desde 0,2 hasta 1,2 voltios y desde 0,2 hasta 1,35 voltios a 100 milivoltios por segundo en una solución de ácido sulfúrico 0,1 molar y cloruro de potasio 0,01 molar. Mida la corriente de carga de la doble capa del sustrato de oro desnudo limpio realizando CV en condiciones estándar, que incluyen una ventana de potencial desde 0,1 hasta 0,4 voltios frente a cloruro de plata y plata escaneada a 100 milivoltios por segundo en tampón de fosfato de potasio o KPB.

Deseche el tampón y enjuague dos veces abundantemente con agua ultrapurificada y etanol. Exponga el sustrato de oro limpio a aproximadamente 300 microlitros de una solución de C seis de cinco milimolar en etanol y déjela reposar durante la noche para formar un Sam ordenado de C seis. Deseche la solución de C seis de la celda y enjuáguela dos veces abundantemente con etanol y agua ultrapurificada.

Mida la corriente de carga del SAM en condiciones estándar. Deseche el KPB y enjuague dos veces abundantemente con agua ultra purificada y etanol. La corriente de carga debería disminuir notablemente.

A partir de la medición del oro desnudo, exponga el sustrato de oro modificado con SAM a aproximadamente 300 microlitros de una solución de NDT cinco milimolar en etanol y déjelo reposar durante una hora para dispersar intersticialmente las moléculas de enlace de NDT dentro del SAM de C seis. Deseche la solución de NDT y enjuague dos veces excesiva y completamente con etanol y agua ultra purificada, y luego una vez con diametano. Exponga el sustrato de oro a una solución de MPC en diametano con agitación mediante burbujeo lento de gas nitrógeno durante una hora.

Esta es la capa MPC de anclaje del ensamblaje de la película. Deseche la solución MPC y enjuague nuevamente sucesivamente con diclorometano, agua ultra purificada y KPB. Mida la corriente de carga de la capa MPC en condiciones estándar.

Deseche el KPB y enjuague abundantemente con agua ultra purificada y metano DIAM. Exponga el sustrato de oro a aproximadamente 300 microlitros de una solución de NDT cinco milimolar en metano DIAM con agitación mediante burbujeo lento de gas nitrógeno durante 20 minutos. Deseche el NDT y enjuague minuciosamente con metano DIAM para depositar la segunda capa de MPC.

Vuelva a sumergir el ensamblaje de la película en la solución de MPC de metano DIAM y déjelo reposar con agitación, burbujeando lentamente gas nitrógeno durante una hora, antes de los lavados. Luego, mida nuevamente la corriente de carga de la capa de MPC en condiciones estándar y lave de nuevo utilizando el mismo procedimiento. Deposite capas adicionales de MPC si se desea.

Una vez completada la película de MPC en red, enjuague el sustrato modificado con la película con KPB para absorber la proteína AZ sobre el ensamblaje de la película de MPC. Inyecte alrededor de 150 microlitros de una solución de AZ de cinco a 10 micromolar en KPB dentro de la celda electroquímica tipo sándwich y déjela reposar tapada y refrigerada durante al menos una hora. Después de que la celda ECM regrese a temperatura ambiente, enjuáguela completamente con KPB, rellene nuevamente la celda ECM con KPB y burbujee el KPB con gas nitrógeno durante 10 minutos.

Realice estudios electroquímicos en monocapa, como CV, en la ventana de potencial desde menos 0,25 voltios hasta 0,25 voltios. Escanee a 100 milivoltios por segundo en KPB. Enjuague un portaobjetos de vidrio modificado con PT MS 3M con metano DIAM y colóquelo en una solución MPC de metano DIAM durante una hora, agitando en un agitador a baja velocidad. Esto completa la primera capa MPC del ensamblaje de la película, anclando los MPC a los grupos terminales ME captan del sane.

Lave completamente la laminilla con metano Dior, séquela con gas de nitrógeno y tome un espectro UV-vis de la laminilla después de remojarla en la solución de NDT en metano diam. Coloque la laminilla en la solución de MPC durante una hora agitándola en un agitador a baja velocidad. Esto completa la segunda capa de MPC en el ensamblaje de la película.

Lave completamente la portaobjetos con metano DIAM, seque con gas de nitrógeno y tome un espectro UV-vis de la portaobjetos. La absorbancia a través del espectro debe aumentar a medida que se absorben capas adicionales de MPC al ensamblaje de la película. Para fijar una película de MPC ensamblada sobre una portaobjetos de vidrio modificada con PT MS 3M a una portaobjetos microscópica estándar.

Prepare la resina epoxi Embed Eight 12 y déjela espesar durante al menos 12 horas. Llene una cápsula de haz con resina epoxi e inviértala sobre la muestra de película MPC. Aplique presión sobre la cápsula para que una burbuja ascienda hasta la parte superior de la cápsula, creando un sello entre la resina epoxi y la muestra de película MPC.

Deje que polimerice durante al menos 18 horas a 60 grados Celsius y luego enfríe las laminillas montadas hasta temperatura ambiente. Caliente las laminillas montadas durante 20 segundos sobre una placa calefactora de aluminio fundido a 200 grados Celsius para facilitar la eliminación del bloque con el MPC adherido en la película rápida. Corte la muestra que contiene la película del bloque de la cápsula del haz utilizando una sierra de joyero, y coloque la porción retirada en un molde plano de silicona con el lado de la película MPC hacia arriba, enfrentando el interior del molde de silicona.

Llene el pozo de silicona con resina epoxi a temperatura ambiente y permita que polimerice durante al menos 18 horas a 60 grados Celsius. Luego, regrese la muestra a temperatura ambiente. Corte secciones delgadas de 60 a 80 nanómetros en un ultramicrotomo Leica UCT utilizando un cuchillo de diamante para cortar secciones perpendiculares al borde del cuchillo, coloque las secciones cortadas sobre una película de soporte de carbono VAR forma en rejillas de cobre de 400 mallas e tome imágenes de TEM de secciones transversales de los ensamblajes de película MPC mostrados.

A continuación se muestran los resultados del monitoreo de la corriente de carga de doble capa durante el crecimiento de la película de MPC, con un total de cinco ciclos de inmersión que implican exposición alternada a soluciones de MPC y NDT. Las corrientes de carga aumentan sistemáticamente con cada ciclo de inmersión. Añadiendo capas de MPC a la película.

Aquí se muestra un ciclo típico de Volta Graham para la adición de AZ que se absorbe en un ensamblaje de película MPC, recopilado utilizando una ventana de potencial desde -0,25 hasta +0,25 voltios, escaneada a 100 milivoltios por segundo en tampón de fosfato de potasio 4,4 milimolar. Aquí se muestra un seguimiento espectral UV-vis representativo del crecimiento de una película MPC unida mediante un diol sobre un portaobjetos de vidrio modificado con PT MS 3M. Un ciclo de inmersión consiste en la exposición del portaobjetos a una solución de enlazador NDT, seguida de la exposición a una solución MPC.

Cada inmersión subsiguiente provoca un aumento en el grosor de la película y un incremento concurrente en la absorbancia. Esta figura muestra un análisis de imagen transversal por microscopía electrónica de transmisión de un ensamblaje de película MPC unida mediante DIA. El recuadro muestra una imagen típica de MET de MPC funcionalizadas con hexa metol utilizadas en el análisis de ensamblaje de la película por MET.

Mediante el uso de Image J, se determinó que el diámetro promedio del núcleo de oro de los MPC era de aproximadamente dos nanómetros. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar, caracterizar y ensamblar películas de pares estrechos de oro de MPC que actúan como una interfaz para la absorción y el posterior análisis electroquímico de proteínas redox. El proceso de ensamblaje de las películas es fácilmente adaptable mediante la manipulación del procedimiento de síntesis de los MPC, así como del mecanismo de enlace interno de las partículas, para acomodar la absorción de una amplia variedad de proteínas.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la electroquímica de la absorción de proteínas en plataformas sintéticas modificadas, también puede aplicarse al desarrollo de sistemas de modelado de transferencia de electrones, esquemas de biosensores y materiales sintéticos biocompatibles.