Producción eficiente de parvovirus recombinante con la ayuda de derivados de adenovirus-Systems
23 de abril de 2012
Aquí se describe un protocolo basado solamente en la infección de células, lo que mejora la eficiencia de la producción recombinante de parvovirus por más de 100 veces en comparación con otros protocolos en uso. Este protocolo se basa en el uso de un nuevo adenovirus 5-basado auxiliar que contiene el VP parvovirus unidad de transcripción (Ad-VP).
El objetivo general de este procedimiento es producir virus parvovirales recombinantes, o rec PV, con títulos altos, preservando su calidad y reduciendo los tiempos y costos de producción. Esto se logra primero generando un stock viral inicial de rec PV mediante la transfección de células HEC 293T con plásmidos de rec PV, junto con un vector derivado del adenovirus tipo 5. Dado que la introducción de elementos genómicos de ad en las células HEC 293T aumenta la producción de rec PV en más de diez veces.
En comparación con los protocolos existentes, se generó un nuevo ayudante AD VP que contiene los elementos genómicos adenovirales necesarios para mejorar la producción de parvovirus recombinante, así como la unidad del gen VP del parvovirus. El siguiente paso consiste en producir y purificar este nuevo ayudante AD VP VP según los protocolos estándar.
El paso final en este procedimiento consiste en amplificar el PVS recombinante mediante la coinfección de células NB324K con el PV recombinante y los virus AD-ADP. La eficiencia de producción del PV recombinante mejora más de 100 veces con esta estrategia, que puede utilizarse exclusivamente una vez que se ha producido una pequeña cantidad de PVS recombinantes mediante transfección. En última instancia, se utiliza una PCR cuantitativa en tiempo real o un ensayo de transducción para la titulación de los lotes virales producidos.
Además, se realiza un ensayo de placas para confirmar que no se han generado virus competentes en replicación no deseados durante el proceso de producción. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la producción clásica de parvovirus recombinante mediante plásmido, en células act y células treaty, es que una vez que hemos producido los lotes iniciales de parvovirus recombinante con la ayuda del adenovirus VP, nuestra producción dependerá completamente de la infección viral. Esto permite el uso de células NBK, que son buenas productoras de parvovirus, pero son transfectables.
De esta manera, es posible amplificar los virus recombinantes y aumentar la cantidad de virus por cultivo en más de 100 veces, reduciendo el tiempo y el costo de producción. Para demostrar el procedimiento, contaremos con Barbara Loic, jefa de la Unidad de Producción de Virus, quien desarrolló junto con nosotros este nuevo protocolo. Esperamos que les guste este video y les deseamos mucha suerte en sus experimentos.
Se requiere la producción de parvovirus recombinante o PV rec mediante transfección para obtener la cantidad mínima de PV rec que servirá como inóculo en la producción subsiguiente de PV rec mediante infección. Se necesita un laboratorio de nivel dos de seguridad biológica para la producción de PV rec un día antes de la siembra para transfección. Dos millones de células HEC 293T en una placa de 10 centímetros para obtener un 50 % de confluencia celular.
El día de la transfección, cultive las células en 10 mililitros de DMEM suplementado con 10% de FBS, L-glutamina, penicilina y estreptomicina, e incube durante la noche a 37 °C en una atmósfera de 5% de dióxido de carbono y 92% de humedad. El día de la transfección, prepare una mezcla para la producción de virus en un tubo de 1,5 mililitros. Añada los siguientes reactivos en una proporción molar de uno a dos a uno: tres microgramos del vector rec PV que porta el transgén de interés.
Seis microgramos del vector P-C-M-V-V-P que porta la unidad del gen de la cápside del parvovirus y ocho microgramos del plásmido auxiliar derivado del adenovirus. Pxx seis, diluya la mezcla de plásmidos con medio libre de suero hasta un volumen de 850 microlitros para obtener una concentración final de 20 nanogramos por microlitro. A continuación, agregue 42,5 microlitros del reactivo de transfección FU gene HD en una proporción de 2,5 a uno de reactivo FU gene respecto al ADN.
Tenga cuidado de no permitir que el reactivo del gen FU toque la pared del tubo; agite suavemente en vórtex durante cinco a 10 segundos y luego incube la mezcla de transfección a temperatura ambiente durante 30 minutos. Añada la mezcla de transfección gota a gota a las células. Agite suavemente la placa para distribuir uniformemente la mezcla.
Incube la placa durante 72 horas a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono y 92% de humedad. Durante este período, se forman partículas de parvovirus progenie a partir de los plásmidos de parvovirus para cosechar el virus. Primero, raspe las células junto con su medio, luego aspire y transfiera la suspensión de la placa a un tubo plástico de 15 mililitros.
Centrifugar el tubo a 250 G durante cinco minutos. A temperatura ambiente, eliminar el 95 % del sobrenadante, dejando aproximadamente 0,5 mililitros. Vortexar suavemente el tubo para resuspender el precipitado en el sobrenadante restante y transferirlo a un tubo eppendorf de 1,5 mililitros.
Congele la suspensión en un baño de nitrógeno líquido y luego descongele en agua tibia a 37 grados Celsius. Agite el tubo vigorosamente durante 15 segundos. Repita el ciclo de congelación y descongelación dos veces más.
Centrifugar el tubo a 16.000 G durante 15 minutos a cuatro grados Celsius y recoger el sobrenadante en un tubo nuevo. El sobrenadante en esta etapa contiene el extracto crudo de virus, que puede utilizarse como inóculo para la producción de PVS recombinante mediante infección. Aumento de potencia del virus.
Las replicaciones dependen de factores celulares que se expresan en células en proliferación. Por lo tanto, es importante que las células utilizadas para la producción del virus recombinante se encuentren en condiciones óptimas y se siembren a una densidad adecuada, como se demuestra en este protocolo. Un día antes de la infección, sembrar 10 millones de células MB 20.4K en un matraz T175 para obtener una confluencia celular del 60 al 80 % al día siguiente.
Prepare un segundo matraz que contenga el mismo número de células como control. Cada matraz T 1 75 debe tener 20 mililitros de MEM como volumen final, suplementado con 5 % FBS, L-glutamina, penicilina y estreptomicina, la mañana del día de la infección. Prepare una mezcla de virus en un tubo plástico de dos mililitros.
Agregue estos reactivos. AÑADA el ayudante VP. Agregue una multiplicidad de infección de 10 PVS rec en una MOI de 0,5 y MEM hasta 1,5 mililitros.
Aplique toda la mezcla de virus a uno de los frascos T 1 75. Incube el frasco durante dos horas a 37 grados Celsius, 92 % de humedad y 5 % de dióxido de carbono con agitación suave cada 15 minutos. Incube durante un período adicional de 20 a 24 horas a 37 grados Celsius, 92 % de humedad y 5 % de dióxido de carbono.
Después de 20 a 24 horas, reemplace el medio de cultivo por medio fresco e incube el matraz durante 48 horas bajo las mismas condiciones como indicación de una producción viral eficiente. Deben observarse signos evidentes de citotoxicidad en el matraz que contiene las células infectadas con el virus. A partir de las 36 a 48 horas posteriores a la infección, después de 48 horas, aspire y transfiera el sobrenadante del medio del matraz a un tubo de centrífuga de 50 mililitros.
Lave las células dos veces con 1,5 mililitros de PBS, añada tripsina y incube durante tres a cinco minutos. A continuación, añada la suspensión celular al medio eliminado, centrifugue las células y el sobrenadante a 5.000 ×g durante cinco minutos a temperatura ambiente, deseche el sobrenadante y agregue un mililitro de tampón TE al sedimento celular. Vortexe suavemente el tubo para resuspender las células. A continuación, congele la suspensión celular en un baño de nitrógeno líquido y descongele en agua tibia a 37 grados Celsius.
Vortexee el tubo vigorosamente durante 15 segundos. Repita el ciclo de congelación-descongelación tres veces. A continuación, trate la suspensión celular con la nucleasa Ben Nase durante 30 minutos a 37 grados Celsius para digerir el ADN genómico celular y el ADN viral no empaquetado.
Después de 30 minutos, centrifugue el tubo a 5.000 G durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Finalmente, recoja el sobrenadante en un tubo nuevo. El sobrenadante en esta etapa contiene un extracto crudo de virus.
Los rendimientos típicos de PV rec GFP producidos siguiendo este protocolo deben estar en el rango de uno a diez veces diez a la octava unidad infecciosa viral. Aquí se muestra un ejemplo de la estimulación de la producción de PV rec mediante un plásmido basado en adenovirus. Extractos virales crudos que contienen PHH uno GFP PV rec que porta el gen GFP con o sin.
Se aplicaron el plásmido PXX basado en adenovirus a células indicadoras NBK como se observa en estas micrografías; hay más células positivas para GFP en presencia de PXX seis. Cuando se realizaron ensayos de transducción GFP, se obtuvo un claro aumento en la producción de PV recombinante en presencia de Pxx seis. La producción aumentó de 0,3 unidades de transducción GFP o TU por célula, obtenidas mediante protocolos convencionales, a aproximadamente cinco TU por célula obtenidas con este protocolo.
Los resultados del ensayo de transducción de GFP indican que los genes E dos a, E cuatro y ARN VA del adenovirus contenidos en PXX seis son capaces de aumentar la producción de parvovirus. Esta figura siguiente muestra un ejemplo representativo de la producción de PV recombinante mediante infección. Las células NB tres 20 4K fueron infectadas con el virus auxiliar ADP purificado y luego superinfectadas con cualquiera de los dos parvovirus recombinantes.
Se utilizaron extractos celulares crudos para determinar los títulos virales mediante un ensayo de transducción que mostró que el AD VP mejoró aún más la producción de PV recombinante hasta más de 70 T por célula. Finalmente, se analizaron lotes virales producidos en presencia o ausencia de ADP para determinar su contenido de partículas virales competentes para la replicación mediante un ensayo de placas en células indicadoras MB tres 20 4K. Los resultados indican que el ADP mejoró la producción de PV recombinante sin aumentar la aparición de partículas virales competentes para la replicación indeseables tras su desarrollo.
Esta técnica permite a los científicos en el campo de la terapia génica y contra el cáncer aumentar aún más la producción de virus recombinantes con capacidad terapéutica. Mediante el uso de biorreactores, se pueden producir variantes en grandes cantidades necesarias para un entorno clínico.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Resumen
Este artículo presenta un protocolo para producir parvovirus recombinantes (rec PVS) con una eficiencia significativamente mejorada. Al utilizar un vector auxiliar novedoso basado en el adenovirus 5, el protocolo aumenta la producción viral más de diez veces en comparación con los métodos existentes.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Virología
- Terapia génica
- Desarrollo de vectores virales
Antecedentes
- Los parvovirus recombinantes son herramientas valiosas en la terapia génica.
- Los métodos actuales de producción suelen ser ineficientes y costosos.
- Mejorar la eficiencia de producción es crucial para aplicaciones de investigación y terapéuticas.
- Los vectores de adenovirus pueden mejorar el rendimiento de virus recombinantes.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo más eficiente para la producción de PVS recombinantes.
- Reducir los tiempos y costos asociados con la generación de vectores virales.
- Mantener la calidad de los virus producidos.
Métodos Utilizados
- Transfección de células HEC 293T con plásmidos de PV recombinante.
- Cotransfección con un vector derivado del adenovirus tipo cinco.
- Producción y purificación del nuevo vector auxiliar de adenovirus.
- Comparación de eficiencia con protocolos existentes.
Resultados principales
- El nuevo ayudante adenoviral aumenta significativamente la producción de PVS rec.
- La eficiencia de producción mejoró más de diez veces.
- Se pueden aplicar protocolos estándar de purificación al nuevo vector ayudante.
- El protocolo reduce los costos y el tiempo totales de producción.
Conclusiones
- Este protocolo representa un avance significativo en la producción de PVS rec.
- El uso de vectores de adenovirus puede aumentar eficazmente el rendimiento viral.
- Las aplicaciones futuras podrían beneficiarse de la mayor eficiencia y rentabilidad.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La producción de parvovirus recombinantes sigue siendo un cuello de botella para las líneas de oncología y terapia génica debido a los bajos títulos y altos costos. Este protocolo aprovecha sistemas auxiliares derivados del adenovirus para lograr mejoras en el título superiores a 100 veces, posibilitando la fabricación a escala en sistemas de suspensión y biorreactores. El enfoque reduce los plazos de producción y el gasto de recursos, al tiempo que preserva la integridad viral, facilitando la traducción preclínica a clínica de candidatos de parvovirus oncolíticos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación funcional de los mecanismos oncolíticos mediados por parvovirus mediante la producción de vectores de alto título.
- Valor operativo: Reduce los ciclos iterativos de transfección al cambiar la producción a una amplificación basada en infección tras la generación del stock inicial.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Proporciona stocks virales consistentes y de alto título para ensayos de transducción y cribado de citotoxicidad en flujos de trabajo de validación de dianas.
- Valor operativo: Facilita la estandarización de ensayos mediante la producción reproducible de virus a través de pasos definidos de infección dependientes de ayudante.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Facilita estudios de determinación de dosis y biodistribución al permitir la producción a gran escala de parvovirus recombinantes en cultivos en suspensión.
- Valor operativo: Permite el uso de células productoras de difícil transfección (por ejemplo, NB324K) para la fabricación a escala, ampliando las opciones de líneas celulares para el desarrollo de procesos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la fase temprana de descubrimiento mediante la generación de lotes de siembra a través de transfección, y luego pasa a una amplificación basada en infección para la optimización del fármaco líder y el suministro preclínico, lo que permite la continuidad desde la validación del blanco hasta los estudios que posibilitan la presentación de la IND.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis sobre la actividad antitumoral de los parvovirus mediante la producción confiable de vectores armados con transgenes.
- Selección: Permite ensayos cuantitativos de transducción para evaluar la potencia del vector y la expresión del transgen en células diana.
- Análisis: Utiliza qPCR y ensayos de transducción para la determinación del título, proporcionando criterios cuantitativos de liberación para aplicaciones posteriores.
- Investigación Traducional: Conecta la producción a escala de descubrimiento con las necesidades preclínicas mediante escalabilidad en cultivo en suspensión y preparación para biorreactores.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable dependiente de ayudantes, aplicable a múltiples serotipos de parvovirus y cargas de transgenes.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva en los datos de eficacia de parvovirus al minimizar la variabilidad entre lotes en la producción del vector.
- Valor operativo: Estandariza la producción mediante infección dependiente de virus auxiliar, reduciendo la dependencia de la eficiencia de transfección y la variabilidad en la preparación de plásmidos.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al reducir el costo por dosis y acelerar los plazos para el avance de candidatos preclínicos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de terapéuticos basados en parvovirus al abordar un cuello de botella clave en la capacidad de fabricación.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la producción de vectores virales, técnicas de transfección e infección.
- Necesita infraestructura para la propagación y purificación del vector auxiliar de adenovirus bajo condiciones de BSL-2.
- Exige la estandarización de la MOI y del momento de infección entre los equipos de producción para obtener rendimientos consistentes.
- Incluye consideraciones de adaptación al transferir el protocolo a líneas celulares productoras alternativas o a adaptaciones en suspensión.
- Comprende limitaciones prácticas, como el requisito inicial de un stock seminal dependiente de transfección antes de la ampliación basada en infección.
