Name: Producción eficiente de parvovirus recombinante con la ayuda de derivados de adenovirus-Systems (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Aprende a producir parvovirus recombinantes con alta eficiencia utilizando un vector ayudante derivado de adenovirus tipo 5. Este protocolo mejora el rendimiento viral más de diez veces, reduciendo tiempos y costos de producción.

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Damos las gracias al equipo de la producción de virus DKFZ y la unidad de desarrollo, en particular, Müller Marcus, Münstermann Silvia, Liebetrau Bárbara, y Roscher Mandy. Este estudio ha sido parcialmente subvencionado por el Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF) y la Asociación Helmholtz en el marco de la Deutsches Krebsforschungszentrum / Cancéropôle du Grand-Est programa conjunto en el tumor Aplicada Virología.

Nótese que un laboratorio con un nivel de bioseguridad 2 se requiere para la producción de parvovirus recombinantes (recPV). El protocolo se divide en dos partes principales. La primera parte (producción de recPV a través de la transfección) se requiere para producir la cantidad mínima de recPVs que sirve como inóculo en la segunda parte del protocolo (producción de recPVs a través de la infección). Una vez que una pequeña cantidad de recPVs se produce, la primera parte del protocolo puede ser omitido, y el parvovirus recombinante puede ser amplificado sólo a través de la infección proporcionar el gen que codifica para las proteínas parvovirus cápside a través de la ayudante de adenovirus (véase más adelante). 1. Producción de recPVs través Transfección 1,1 transfección de ADN viral Es posible utilizar cualquier método de transfección de ADN establecido en esta sección del protocolo ya sea sobre la base de lípidos catiónicos o fosfato cálcico. Generalmente usamos Fugene HReactivo D transfección. Para controlar la eficacia de transfección, se recomienda que la transfección de la placa adicional con un plásmido que expresa mayor proteína verde fluorescente (por ejemplo, pEGFP-N1, Clontech). Transfección se considera eficiente y óptima para la producción de virus cuando al menos 50% de la población de células resulta EGFP-positivas 24 horas después de la transfección. <ol><li> 1 día antes de la transfección, las células HEK293T 2 millones de semillas en una placa de 10 cm, para obtener 50% de confluencia celular en el día de la transfección. Se cultivan las células en 10 ml de medio modificado de Dulbecco Eagle (DMEM) con adición de 10% de suero fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, 100 U por ml de penicilina y 100 ug / ml de estreptomicina. </li><li> Preparar el virus de la toma de mezcla (1:2:1 proporción molar) en un tubo de 1,5 ml: <ol class="lalpha"><li> 3 g de recPV vector de albergar el transgen de interés (IE PhH-1-GFP 6). </li><li> 6 g de vector pCMV / VP 5 albergar la cápsida del parvovirus unidad de gen </li><li> 8 mg of adenovirus derivado de plásmido ayudante pXX6 7. </li></ol></li><li> Se diluye la mezcla plásmidos con medio libre de suero hasta 850 (concentración final de 20 ng / l) l. </li><li> Añadir 42,5 l Fugene HD (2,5:1 Fugene l ratio: ADN g). No toque el lado del tubo cuando se añade Fugene al medio. </li><li> Vortex suavemente durante 5-10 segundos. </li><li> Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos. </li><li> Añadir las mezclas de transfección una sabia gota a las células. Agitar la placa suavemente para distribuir uniformemente la mezcla de todo. </li></ol> 1.2 Virus de la producción <ol><li> Incubar la placa a 37 ° C con un 92% de humedad y 5% de CO 2 durante 72 horas antes de la cosecha. Durante este período partículas progenie parvovirus se forman a partir de los plásmidos parvovirus. </li></ol> 1.3 Virus de la cosecha <ol><li> En una campana de cultivo de tejidos, raspar las células dentro de su medio, aspirar y transferir la suspensión de la placa en un 15ml tubo de plástico. </li><li> Centrifugar el tubo a 250 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Eliminar el 95% del sobrenadante. </li><li> Vortex el tubo suavemente para resuspender el precipitado en el sobrenadante restante (aproximadamente 0,5 ml). </li><li> Congelar el tubo a -80 ° C. Es posible detener la producción en esta etapa o para continuar con el protocolo. </li><li> Descongelar la suspensión y llevarlo a la temperatura ambiente. </li><li> Congelar la suspensión en un baño de nitrógeno líquido y descongelación en agua caliente a 37 ° C. Vortex los tubos vigorosamente durante 15 segundos y repita los ciclos de congelación-descongelación dos veces más. </li><li> Centrifugar los tubos a 16.000 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Recoger el sobrenadante en un tubo nuevo. El tubo en esta etapa contiene la preparación de virus extracto crudo. </li><li> Continúe con la titulación del virus (ver más abajo). Para el recPV que lleva el gen GFP, una típica producción debe dar de 1-3 x 10 7 unidades virales infecciosas que corresponden a alrededor de 1 -3 x 10 10 genoma viral que contiene partículas. </li></ol> 1.4 Virus de almacenamiento <ol><li> Para almacenamiento a largo plazo congele el tubo que contiene el extracto de virus de crudo a -80 ° C. Es posible utilizar extractos crudos virales como inóculo en la segunda parte del protocolo. </li></ol> 2. Producción de recPVs través de la infección Antes de comenzar con la producción recPV través de la infección, producción y purificación de adenovirus 5 que lleva el parvovirus VP gen (Ad-vicepresidente ayudante, se describe en el 5) de acuerdo a protocolo estándar de 8. También es necesario disponer de una cantidad mínima de recPVs portadores del transgén de interés (por ejemplo, producida a través de la transfección como se describió anteriormente). A continuación, se describe la producción de recPV en 175 cm 2 frasco (T175) en formato. Amplificación adicional del stock de virus producido de esta manera puede llevarse a cabo en 10 cámaras multicapa CellSTACK cultivo (Corning)con pequeños ajustes del protocolo propuesto. 2.1 La infección <ol><li> 1 día antes de la infección, las células NB324K placa 10 millones en un matraz T175 para obtener 60-80% de confluencia celular en el día de la infección. Preparar un segundo matraz que contiene el mismo número de células como un control (células no infectadas). Cada T175 debe tener 20 ml de Medio Esencial Mínimo (MEM) como un volumen final, suplementado con 5% de suero fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, 100U por ml Penicilina y 100 estreptomicina g / ml. </li><li> A la mañana siguiente preparar la mezcla de virus en un tubo de plástico de 2 ml que consiste en: <ol class="lalpha"><li> Ad-VP-auxiliar 5 en multiplicidad de infección (MOI, las unidades infecciosas / celulares) = 10 (correspondiente a 1 x 10 8 unidades infecciosas); </li><li> recPVs en Moi = 0,5 (correspondiente a 5 x 10 6 unidades infecciosas). Completar a 1,5 ml con MEM. </li></ol></li><li> Aplicar la mezcla de virus entero en un matraz de la T175. </li><li> Incubar elmatraz durante 2 horas a 37 ° C, 92% de humedad, 5% de CO 2 agitando suavemente cada 15 min. </li><li> Incubar durante 20-24 h más a 37 ° C, 92% humedad, 5% de CO 2. </li><li> Vuelva a colocar el medio de cultivo con medio fresco. </li></ol> 2.2 Virus de la producción Incubar los matraces a 37 ° C con 92% de humedad y 5% de CO 2 durante 48 horas. Como indicación de la producción viral eficiente, claros signos de citotoxicidad se deben observar en el matraz que contenía células infectadas por virus, a partir de 36-48 horas post-infección. 2.3 Virus de la cosecha <ol><li> En una campana de cultivo de tejidos, aspirar y transferir el sobrenadante del medio desde el matraz en un tubo de centrífuga de 50 ml. </li><li> Se lavan las células dos veces con 1,5 ml de PBS. </li><li> Trypsinize las células con 1,5 ml de 0,25% Trysin-EDTA. Añadir la suspensión de células al medio eliminado. </li><li> Centrifugar las células y el sobrenadante a 5.000 xg durante 5 min a temple habitacióntura. </li><li> Eliminar el sobrenadante. </li><li> Añadir 1 ml de tampón TE (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,7) al sedimento de células y vórtice suavemente el tubo para resuspender las células. </li><li> Congelar la suspensión celular en un baño de nitrógeno líquido y descongelación en agua caliente a 37 ° C. Vortex el tubo vigorosamente durante 15 segundos y repita el ciclo de congelación-deshielo en tres ocasiones. </li><li> Tratar la suspensión celular con 50 nucleasa U / ml Benzonase durante 30 min a 37 ° C con el fin de digerir el genómico de células y no envasados ​​ADNs virales. </li><li> Centrifugar el tubo a 5.000 xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Recoger el sobrenadante en un tubo nuevo. El sobrenadante en esta etapa contiene la preparación de virus extracto crudo. Los rendimientos típicos de recPV-GFP producido siguiendo este protocolo debe estar en el intervalo de 1-10 x 10 8 unidades infecciosas víricas. </li></ol> 2.4 Virus de almacenamiento <ol><li> Para el almacenamiento a corto plazo (máximo 2 meses), virus de la tienda de a 4 ° C. </li><li> Por long almacenamiento a largo plazo (más de 2 meses), el virus de la tienda a -80 ° C. </li></ol> 3. RecPV Purificación <ol><li> Para la purificación de recPVs de los lisados ​​crudos, se recomienda ejecutar un iodixanol gradiente discontinua de acuerdo a Zolotukhin et al. 9. Recomendamos utilizar un mínimo de 5 ml de extracto crudo viral (obtenido de la producción en cinco matraces T175) para la purificación del virus eficiente. </li></ol> 4. Titulación parvovirus recombinante <ol><li> Realizar titulación recPV como se describe en El-Andaloussi et al. 5 </li></ol> 5. Controles de calidad <ol><li> Utilizar el protocolo descrito en El-Andaloussi et al. 5 para comprobar la presencia de virus de replicación no deseados competentes (RCV) que llevan a cabo ensayos parvovirus placa en células indicadoras NB324K. </li></ol> 6. Los resultados representativos Un ejemplo de recPVs production mediante transfección en presencia o ausencia de elementos genómicos de adenovirus se muestra en la Figura 3. Las células se transfectaron con pCMV / VP (plásmido que lleva el gen que codifica para las proteínas de la cápside VP parvovirus) junto con PhH-1-GFP (una recPV que alberga el gen GFP) o PhH-1-luciferasa (una recPV que alberga el gen de luciferasa de luciérnaga) , con (+ pXX6) o sin (-pXX6) la pXX6 plásmido (llevando el adenovirus E2A, E4 (orf6) y los genes VA RNA). Volumen igual de extractos de células brutos se aplica a NB324K células y transducción de GFP o ensayos de luciferasa se ​​realizaron como se informó en El-Andaloussi et al. 5. Un claro aumento en la producción recPVs se obtuvo de la presencia de pXX6 con aumento de la producción de 0,3 unidades GFP transduccionales (TU) o de células obtenidas de acuerdo con protocolos convencionales a aproximadamente 5 TU / célula obtenida siguiendo nuestro método (Fig. 3A, B). Un aumento significativo (alrededor de 24 veces) de recPV Produccionessobre también se observó en el caso de PhH-1-luciferasa (fig. 3C). Estos resultados indican que el material genético contenido en pXX6 es capaz de impulsar la producción de parvovirus. Un ejemplo representativo de la producción recPVs través de la infección se muestra en la Figura 4. Células NB324K fueron co-infectados con recPVs diferentes (como se indica en la figura) y Ad-VP-helper (que alberga el gen que codifica para las proteínas de la cápside VP PV). Ad-VP ayudante producción recPV mejorarse aún más hasta&gt; 70 TU por sembrado de células (Fig. 4A), sin aumentar la ocurrencia de indeseables replicación competentes partículas virales (Fig. 4B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Vectores sobre la base de los parvovirus autónomos. (A) superior: El transgén sustituye una parte de los genes codificantes VP y está bajo el control del promotor viral P38. Los genes para NS1 / 2 son recontenidas y su expresión está controlada por el promotor viral P4. El genoma del vector está flanqueado por el parvovírica RTI, que contienen elementos de acción cis que se requieren para la replicación y empaquetamiento del genoma recombinante. Conclusión: Un plásmido que lleva el gen VP-bajo o bien una heteróloga (por ejemplo por CMV.), O autógeno (por ejemplo, P38.) Promotor (Px), se suministra en trans durante la producción del parvovirus recombinante con el fin de compensar la interrupción de los genes estructurales en el genoma recombinante. ITR, repetición terminal invertida. Figura adaptada de 4 (B). Vista esquemática del protocolo clásico utilizado para la producción de recPVs. HEK293T células se transfectadas transitoriamente con ADN viral (vectores y plásmidos auxiliares) y después de tres días, las células se recogen y se recogieron los virus. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Producción de recPVs con ella ayuda de la Ad-VP. (A) Esquema de mapas de genomas recPV y Ad-VP. El recPV contiene un transgén heterólogo que sustituye parte de la región VP. El Ad-VP alberga el gen VP parvovirus. (B) Representación esquemática del protocolo descrito en este manuscrito. NB324K células están co-infectados con el virus recPV y Ad-VP. Después de tres días se cosechan las células y partículas recPV recuperado de lisado celular. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Estimulación de la producción recPV por el adenovirus-basados ​​en plásmidos pXX6. HEK293T células, se siembran en platos de 10 cm, fueron transfectadas con pCMV / VP en combinación con PhH-1-GFP (A y B) o PhH-1-luciferasa (C) para producir recPVs. Simultáneamente, las células fueron co-transfectadas con los plásmidos auxiliares derivados de adenovirus-pXX6 o no, como se indica. Tres días después de la transfección, las células se cosecharon y se lisaron mediante tres ciclos de congelación y descongelación. Volúmenes iguales de crudextractos de correos de virus se aplicaron a NBK células indicadoras, y los ensayos de transducción se llevaron a cabo. (A) micrografías representativas que muestran las células GFP positivos en monocapas confluentes NB324K. (B) Cuantificación de los ensayos de transducción de GFP expresada en la unidad de transducción (UT) por célula cabeza de serie . (C) La cuantificación de la actividad de la luciferasa expresado como unidades relativas de luciferasa (RLU). El ensayo de luciferasa se ​​realizó como se describe en el-Andaloussi et al. 5. Las columnas representan los valores promedio de tres repeticiones con barras de desviación estándar. Número en la parte superior de la columna + pXX6, en (B y C), indica el aumento veces en los títulos de virus recPV, obtenido en la presencia de pXX6 versus sin. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Estimulación de la producción recPV por medio de virus recombinante ayudante ad-VP. (A) células NB324K, fueron infecciónTed con virus purificado ayudante Ad-VP en MOI de 10 (Ad-X unidad / célula, se titula con adeno-X Kit para la titulación) y, a continuación superinfección con cualquiera de los parvovirus siguiente recombinante Chi-HH-1-EGFP 11 (0,1 TU / célula) o H-1-GFP (0,5 TU / célula) 5. Un día después de la infección, el medio se cambió y dos días más tarde, las células se recogieron y se lisaron mediante tres de congelación-descongelación y ciclos. Los extractos crudos de células se utilizan para determinar los títulos de virus mediante el ensayo de transducción de acuerdo con El-Andaloussi et al. 5. TU, unidad de transducción. (B) lotes virales producidos en la presencia de la ausencia de Ad-VP se analizaron para determinar su contenido de replicación competentes partículas virales (VN) por ensayo en placa en células indicadoras NB324K.

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<li>Rommelaere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+parvoviruses+as+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 21, 185(2010).</li>
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<li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene. Ther. 6, 973(1999).</li>
<li>Maxwell, F., Harrison, G. S., Maxwell, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+production+of+recombinant+AAV+by+transient+transfection+of+NB324K+cells+using+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved production of recombinant AAV by transient transfection of NB324K cells using electroporation.</a> J. Virol. Methods. 63, 129(1997).</li>
<li>Wrzesinski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+and+pseudotyped+parvoviruses+minimize+the+contamination+of+recombinant+stocks+with+replication-competent+viruses+and+identify+a+DNA+sequence+that+restricts+parvovirus+H-1+in+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells.</a> J. Virol. 77, 3851(2003).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

Hemos demostrado que la producción recPV puede mejorarse por la presencia de elementos genómicos adenovirales. Hemos aumentado los rendimientos recPV por más de 10 veces (de 0,3 a 5 UT / célula), proporcionando elemento adenovirus genómico a través de la transfección y por más de 100 veces infectan co-las células con Ad-VP-ayudante en combinación con el recPV en comparación con los protocolos convencionales. El protocolo descrito aquí puede optimizarse mediante la determinación de la temporización más adecuada para la e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Sigma </td><td> M4655 </td></tr><tr><td> Suero bovino fetal </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Gibco </td><td> 25030-024 </td></tr><tr><td> Fugene </td><td> Roche </td><td> 047097050001 </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300062 </td></tr><tr><td> Benzonase nucleasa </td><td> Sigma </td><td> E8263 </td></tr><tr><td> Adeno-X rápida Titulación Kit </td><td> Clontech </td><td> 632250 </td></tr></tbody></table>

producción eficiente de parvovirus recombinante con la ayuda de derivados de adenovirus-systems

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Parvovirus roedores (PV), tales como ratas H-1PV y MVM, son pequeñas, simples virus icosaédricas transición a la competencia, el ADN. Su genoma incluye dos promotores P4 y P38 que regulan la expresión de proteínas no estructurales (NS1 y NS2) y cápside (VP1 y VP2), respectivamente 1. Ellos atraen el interés de alta como agentes contra el cáncer para sus habilidades y oncolíticos oncosuppressive al tiempo que no patógeno para los seres humanos 2. NS1 es el efector principal de 3 citotoxicidad viral. Con el fin de mejorar aún más sus actividades antineoplásicos naturales, derivados de estos vectores se han generado mediante la sustitución del gen que codifica para las proteínas de la cápside con un transgén terapéutico (por ejemplo, un polipéptido citotóxico, citoquinas, quimioquinas, gen supresor tumoral, etc) 4. Los parvovirus recombinantes (recPVs) vector retiene las secuencias NS1 / 2 de codificación y los telómeros genoma fotovoltaicos que son necesarias para la amplificación del ADN viral y el envasado. Producción derecPVs se produce sólo en las células productoras (generalmente HEK293T), por la co-transfección de las células con un segundo vector (pCMV-VP) que expresan el gen que codifica para las proteínas VP (fig. 1) 4. Los vectores recPV generadas de esta manera son replicación defectuosa. Aunque recPVs demostrado poseer actividades mejoradas oncotoxic con respecto a los virus parentales de los que han sido generadas, su producción sigue siendo un reto importante y fuertemente obstaculiza el uso de estos agentes anti-cáncer en aplicaciones clínicas. Hemos encontrado que la introducción de un vector de Ad-5 que contiene el derivado E2a, E4 (orf6) y los genes VA RNA (por ejemplo pXX6 plásmido) en HEK293T mejoró la producción de recPVs por más de 10 veces en comparación con otros protocolos en uso. Con base en este hallazgo, hemos construido una novela Ad-VP-helper que contiene los elementos genómicos adenovirales necesarias para aumentar la producción de recPVs así como la parvovirnos VP gen la unidad 5. El uso de Ad-VP-ayudante, permite la producción de reco-PV usando un protocolo que se basa enteramente en los pasos infección viral (en oposición a la transfección del plásmido), lo que hace posible el uso de líneas celulares que son difíciles de transfectar (por ejemplo, NB324K) ( fig. 2). Se presenta un método que mejora enormemente la cantidad de virus recombinante producida, reduciendo tanto el tiempo de producción y los costes, sin afectar la calidad del producto final 5. Además, la producción a gran escala de recPV (en células en suspensión y biorreactores) es ahora concebible.

Aquí se describe un protocolo basado solamente en la infección de células, lo que mejora la eficiencia de la producción recombinante de parvovirus por más de 100 veces en comparación con otros protocolos en uso. Este protocolo se basa en el uso de un nuevo adenovirus 5-basado auxiliar que contiene el VP parvovirus unidad de transcripción (Ad-VP).

Producción eficiente de parvovirus recombinante con la ayuda de derivados de adenovirus-Systems

Los parvovirus (PV) de roedores, tales como el H-1PV de rata y el MVM, son virus de ADN monocatenario, pequeños e icosaédricos. Su genoma incluye dos promotores, P4 y P38...

El objetivo general de este procedimiento es producir virus parvovirales recombinantes, o rec PV, con títulos altos, preservando su calidad y reduciendo los tiempos y costos de producción. Esto se logra primero generando un stock viral inicial de rec PV mediante la transfección de células HEC 293T con plásmidos de rec PV, junto con un vector derivado del adenovirus tipo 5. Dado que la introducción de elementos genómicos de ad en las células HEC 293T aumenta la producción de rec PV en más de diez veces.En comparación con los protocolos existentes, se generó un nuevo ayudante AD VP que contiene los elementos genómicos adenovirales necesarios para mejorar la producción de parvovirus recombinante, así como la unidad del gen VP del parvovirus. El siguiente paso consiste en producir y purificar este nuevo ayudante AD VP VP según los protocolos estándar.El paso final en este procedimiento consiste en amplificar el PVS recombinante mediante la coinfección de células NB324K con el PV recombinante y los virus AD-ADP. La eficiencia de producción del PV recombinante mejora más de 100 veces con esta estrategia, que puede utilizarse exclusivamente una vez que se ha producido una pequeña cantidad

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Rescate de arenavirus recombinantes a partir de ADNc clonado, un enfoque conocido como la genética inversa, permite a los investigadores estudiar la función de los productos específicos de genes virales, así como la contribución de los diferentes dominios y residuos específicos, a diferentes aspectos de la biología de los arenavirus . Del mismo modo, las técnicas de genética inversa en líneas celulares aprobados por la FDA (Vero) para el desarrollo de vacunas ofrece nuevas posibilidades para la...

Generación de Arenavirus recombinante para el Desarrollo de Vacunas de la FDA aprobados células Vero

Virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) se ha estudiado ampliamente en los últimos años con el fin de desarrollar nuevos vectores para la vacunación y la terapia, entre otros. Estos estudios han sido posible debido a las técnicas para rescatar virus recombinante a partir de cDNA, tales como las que se describen aquí.

Rescate del virus de la enfermedad de Newcastle recombinante a partir de cDNA

En los últimos 15 años, los vectores derivados del adenovirus canino tipo 2 (CAV2) han demostrado su eficacia para transducir células in vitro e in vivo y son ampliamente utilizados para la vacunación y la terapia génica. En este trabajo describimos un procedimiento para construir, producir y purificar vectores CAV2, dando lugar a suspensiones virales de alto título.

Producción y purificación de no replicativa adenovirus canino tipo 2 vectores derivados

A continuación, presentamos un protocolo para generar un adenovirus divalente tipo 5 (Ad5) vectores de prueba de principio Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su 6 mediante la utilización de la estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación. Este vector se demostró la aptitud para exhibir cualitativa, la capacidad de escapar de sueros Ad5-positivo in vitro, y la antigenicidad, así como la inmunogenicidad de los antígenos incorporados.

La utilización de la Estrategia de la cápside-Incorporación Antigen para el desarrollo de enfoques adenovirus serotipo 5-Vectored de vacunas

Se presenta un protocolo para la generación de vectores adenovirales de alta capacidad que carecen de todas las secuencias codificantes virales. La clonación de los transgenes contenidos en el genoma del vector se basa en endonucleasas homing. La amplificación del virus en células productoras cultivadas como células adherentes y en suspensión se basa en un virus auxiliar que proporciona genes virales en trans.

La clonación y producción a gran escala de alta capacidad vectores adenovirales en base al tipo de adenovirus humano 5

Se describe un método para generar y amplificar genéticamente modificados virus sincitiales respiratorios (RSVs) y un ensayo de placa optimizada para RSVs. Ilustramos este protocolo mediante la creación de dos virus recombinantes que respectivamente permiten cuantificación de replicación RSV y análisis de cuerpos de inclusión de RSV y gránulos asociada a cuerpos de inclusión dinámica en vivo.

Generación, amplificación y titulación de virus sincitiales respiratorios recombinantes

La generación de rotavirus recombinantes a partir del ADN plásmido proporciona una herramienta esencial para el estudio de la replicación del rotavirus y la patogénesis, y el desarrollo de vectores de expresión de rotavirus y vacunas. En este documento, describimos un enfoque de genética inversa simplificado para generar rotavirus recombinantes, incluyendo cepas que expresan proteínas fluorescentes de reportero.

Método de Genética Inversa Simplificada para Recuperar Rotavirus Recombinantes Expresando Proteínas Reportero

Este es un método para generar virus de vacuna recombinante "sin cicatrices" utilizando la selección del rango de host y la identificación visual de virus recombinantes.

Generación rápida y sin fisuras de poxvirus recombinantes utilizando el rango de host y la selección visual

Aquí, presentamos un protocolo para la producción de adenovirus utilizando el sistema pAdEasy. La tecnología incluye la recombinación de los plásmidos pAdTrack y pAdEasy-1, el empaquetado y la amplificación del adenovirus, la purificación de las partículas adenovirales del lisato celular y el medio de cultivo, la titulación viral y las pruebas funcionales del adenovirus.

Un método eficiente para la producción de adenovirus

La tasa de rotación de los virus en los sistemas marinos y de agua dulce puede ser estimado por una reducción de la recurrencia y la técnica. Los datos permiten a los investigadores a deducir las tasas de mortalidad microbiana mediada por el virus en los sistemas acuáticos.

Estimación de las tasas de producción de virus en los sistemas acuáticos

Aprende a producir parvovirus recombinantes con alta eficiencia utilizando un vector ayudante derivado de adenovirus tipo 5. Este protocolo mejora el rendimiento viral más de diez veces, reduciendo tiempos y costos de producción.

Producción eficiente de parvovirus recombinante con la ayuda de derivados de adenovirus-Systems

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