Modelado y de imagen de 3 dimensiones invasión celular colectiva

Este sistema experimental tiene como objetivo caracterizar la contribución de proteínas específicas al proceso invasivo. Comience con la transducción retroviral de células con la proteína fluorescente de interés. Asimismo, cree la matriz tridimensional de proteína matrigel en insertos transwell y prepare una suspensión celular en la dilución adecuada.

Utilizando el sistema de transbien con Matrigel, mida la respuesta de transmigración al quimioatractivo con fármacos de prueba o tratamientos, y proceda a visualizar y analizar la invasión celular mediante microscopía confocal. En última instancia, los resultados pueden determinar la magnitud y el modo de invasión celular en una matriz proteica tridimensional. La ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el ensayo tradicional de invasión en Transwell es su capacidad para obtener datos tanto cuantitativos como cualitativos sobre la invasión celular en una matriz proteica tridimensional.

Mi colaboradora, Diane Creighton, demostrará ahora el método: cultive las células empaquetadoras de retrovirus en DMEM que contenga 10 %FBS durante 48 horas. Transfecte las células con ADN retroviral según las instrucciones del fabricante. Incube durante 24 horas, enjuague los pocillos dos veces con medio, luego agregue 1,5 mililitros de 10 %F-P-S-D-M-E-M por pocillo e incube durante 48 horas para recoger el retrovirus empaquetado.

Transfiera el medio de cultivo celular a tubos microcéntrifugos de dos mililitros, céntrifugue para formar un sedimento con cualquier célula presente y recoja el sobrenadante en un tubo limpio. Almacene este stock de retrovirus a menos 80 grados Celsius. Ahora, para las células retrotransducidas, retire el medio de un cultivo de sobrenocche y agregue un mililitro de stock de retrovirus suplementado con poli verde.

Después de una incubación de seis horas, agregue dos mililitros de DMEM con 10 % de SFB a la cavidad y coloque las placas en un incubador a 37 grados Celsius. Durante la noche, reponga el medio y, después de 24 horas, agregue el medio selectivo adecuado; cuando las células estén confluentes, récogalas y seleccione según la fluorescencia utilizando células no transducidas como referencia. Recolecte las células con fluorescencia mayor que las células no transducidas y congele alícuotas a menos 80 grados Celsius para su uso futuro.

Este método se basa en la expresión de proteínas fluorescentes para la visualización y permite determinar el aporte de células individuales. Incube el gel de matriz completo sobre hielo y luego dilúyalo uno a uno en PBS frío con hielo. Ahora inserte los transbien sin recubrir en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos.

Luego, pipetee cuidadosamente 100 microlitros de gel matri diluido en los pocillos y solidifíquelo a 37 grados Celsius. Mientras tanto, prepare las suspensiones de células marcadas con fluorescencia en su medio de crecimiento normal. Cuando el gel matri haya solidificado, invierta los transbolsas y pipetee 100 microlitros de la suspensión celular en la cara inferior del filtro, orientada hacia la salida.

Cubra cuidadosamente los transbien con la base de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos, haciendo contacto con cada gota de la suspensión celular. Incube la placa en posición invertida durante cuatro horas para permitir la adhesión celular. Ahora gire las placas en posición normal y lave cada transbien sumergiéndolo dos veces en un mililitro de medio libre de suero.

Luego, coloque el transwell en un tercer pocillo que contenga fármacos o reactivos de tratamiento. El agente pipetee suavemente 100 microlitros de medio que contenga el quimioatractivo dentro del transwell, encima de la mezcla solidificada de Matrigel y PBS. Incube durante tres a cinco días a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono para obtener imágenes de células no fluorescentes invadiendo Matrigel.

Coloque los insertos en placas nuevas de 24 pocillos y pipetee. Un mililitro de solución de calcio AM de cuatro micromolar sobre cada tapón de MatriGel, permitiendo que rebose por los lados y tiña desde la parte superior e inferior. Incube durante una hora a 37 grados Celsius en una atmósfera humidificada con 5% de dióxido de carbono. Luego, obtenga imágenes mediante microscopía confocal.

Este primer método de tinción vital permite la visualización de los modos de invasión. Transfiera cada transwell a una placa de 24 pocillos fresca, añada un mililitro de paraformaldehído al 4% con Tritón X-100 al 0.2% y incube a temperatura ambiente durante media hora. Después de lavar tres veces con un mililitro de PBS, añada RNasa A durante 30 minutos, luego lave dos veces con PBS para la visualización a 0.01 miligramos por mililitro.

Se diluye el yoduro de propidio en PBS y se deja a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos. Lávese tres veces con PBS. En esta etapa, las cámaras de migración teñidas con yoduro de propidio pueden conservarse a temperatura ambiente en la oscuridad durante al menos un mes.

El segundo método de tinción celular requiere fijación, pero permite una cuantificación más rápida de la invasión. Utilizando un microscopio confocal invertido, coloque el transwell con una pequeña cantidad de PBS residual sobre un cubreobjetos grande con un objetivo de inmersión no aceitosa de 20 aumentos y capture secciones ópticas cada 10 a 15 micrómetros desde la base del tapón de Matrigel. Cuantifique el grado de invasión utilizando cortes ópticos individuales. También construya objetos tridimensionales utilizando un software adecuado, como Velocity, en esta serie de cortes ópticos, las células fueron teñidas con amarillo de calcio.

Como era de esperar, el número de células que invaden desde el filtro disminuye con la distancia. Esta invasión puede cuantificarse. Las reconstrucciones tridimensionales de la invasión celular ofrecen una representación visual del modo de invasión.

Si las células están marcadas mediante la expresión de proteínas fluorescentes, entonces las posiciones de cada célula de color se pueden visualizar en reconstrucciones tridimensionales como se muestra en esta vista lateral. Además, los cortes a través de la reconstrucción pueden ofrecer información sobre los mecanismos moleculares. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar este ensayo de invasión celular para obtener más información sobre el proceso evasivo de la que se puede obtener con los métodos estándar.