Músculo Esquelético dimorfismo de género de Proteómica

El objetivo general de este procedimiento es determinar la especificidad sexual de las diferencias en los perfiles del proteoma del músculo esquelético. Esto se logra primero mediante la trituración y homogenización completa de tejidos del músculo bíceps braquial de ratones macho y hembra para extraer la mayor parte de las proteínas. A continuación, la muestra se aplica a una tira de gel IEF y las proteínas se separan según su punto isoeléctrico, seguido de una electroforesis SDS-PAGE, que realiza la separación en una segunda dimensión según el tamaño. Tras la tinción y obtención de imágenes de los geles, se comparan los perfiles proteómicos de las muestras musculares de machos y hembras, y se extraen los puntos con diferencias significativas en abundancia entre ambos sexos.

Finalmente, las proteínas en los tapones de gel se digieren con tripsina. Los péptidos resultantes se extraen del gel y se someten a cromatografía líquida en nanoescala y análisis por espectrometría de masas para su identificación. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la expresión diferencial de proteínas en dos o más condiciones experimentales mediante electroforesis en gel bidimensional y proteómica basada en espectrometría de masas.

Aunque este método puede ofrecer información sobre la especificidad muscular según el sexo, también puede aplicarse a otras células, tejidos, órganos o fluidos en distintos estados fisiológicos. La doctora Kalina Diva, directora técnica del Centro de Proteómica del Smith College, demostrará el procedimiento. Después de aislar, limpiar y picar el músculo esquelético de ratón, utilice 45 microlitros de tampón de extracción por gramo de tejido; consulte el protocolo escrito para esta y todas las demás recetas de tampones. Mediante un pistilo motorizado, homogenice el tejido siete veces durante 15 segundos cada vez a cuatro grados Celsius, enfriando dos minutos en hielo entre cada homogenización.

Centrifugar las muestras a 15,800 G durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Guardar el sobrenadante y medir su volumen. Desechar el precipitado para precipitar las proteínas en tres volúmenes de hielo.

Acetona fría de grado reactivo por volumen de sobrenadante. Vortexee los tubos durante 15 segundos, luego centrifugue a 15.800 Gs durante 10 segundos para formar los pellet. Deseche el sobrenadante y re suspenda los pellet en tampón de extracción con el pistilo motorizado y varillas de agitación de polipropileno; precipite las proteínas una segunda vez añadiendo tres volúmenes adicionales de acetona.

Después de resuspender el precipitado y el tampón de extracción, determine la concentración de proteína y/o almacene las muestras a menos 20 grados Celsius. Para realizar el enfoque isoeléctrico de las proteínas, retire una tira IPG lista del congelador a menos 20 grados Celsius y déjela equilibrar a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos. Vortexee la muestra y pipetee de 600 a 800 microgramos de proteína en una línea recta en el borde posterior de un canal en la bandeja de rehidratación de la muestra, dejando aproximadamente un centímetro en cada extremo.

Utilizando pinzas, retire la cubierta de plástico de la tira IPG, asegurándose de manipular únicamente los extremos de la tira y evitando cualquier contacto con el gel. Observe el extremo marcado como positivo de la tira y colóquelo en el lado izquierdo de la bandeja. Coloque la tira IPG con el lado del gel hacia abajo encima de la muestra.

Evite atrapar burbujas debajo. Deje que se rehidrate durante una hora. Cubra la tira con 2.5 mililitros de aceite mineral.

Cubra la bandeja con una tapa y déjela hidratarse durante la noche. Al día siguiente, a temperatura ambiente, coloque una mecha de papel en ambos extremos del canal de enfoque y humedezca cada una con 10 microlitros de agua millipore. Retire la tira IPG y sosténgala verticalmente durante aproximadamente 10 segundos.

Para drenar el aceite, absorba el respaldo de plástico con una toallita Kim. Coloque la tira IPG con el lado del gel hacia abajo y el extremo básico hacia la izquierda. En la bandeja de enfoque, cubra la tira con 2,5 mililitros de aceite mineral.

Coloque la bandeja en la celda protean IEF y programe un protocolo de tres pasos a una temperatura predeterminada de la celda de 20 grados Celsius, una corriente máxima de 50 microamperios por tira y sin tiempo de rehidratación. Una vez finalizado el programa, transfiera la tira de gel con la cara hacia arriba a una bandeja de equilibración de 11 centímetros. Añada cuatro mililitros de tampón reductor al canal y equilibre la tira durante 10 minutos con agitación suave.

Retire el tampón de reducción y agregue cuatro mililitros de tampón de alquilación al canal. Equilibre la tira con agitación durante 10 minutos adicionales. Enjuague la tira IPG sumergiéndola brevemente en tampón de electroforesis 1XSDS. A continuación, coloque la tira con la cara del gel hacia arriba sobre la placa posterior de un criterio de 11 centímetros.

Coloque un gel precolado de poliacrilamida tris-HCl-SDS del 10,5 al 14 % e insértelo suavemente para que haga contacto completo con el gel SDS. Asegúrese de que no queden burbujas atrapadas entre las dos superficies del gel. Cubra la tira IPG con un mililitro de solución de agarosa fundida y deje que solidifique durante cinco minutos.

Luego, cargue cinco microlitros de marcador de proteínas en el pozo individual. Corra el gel en tampón SDS a 200 voltios a temperatura ambiente o a cuatro grados Celsius. Cuando el frente de colorante alcance la parte inferior del gel, retírelo del molde de plástico y tiña durante la noche agitando suavemente en azul brillante de Kumasi.

Agite el gel en la solución de fijación dos veces durante tres horas cada vez y deje en fijación dos durante la noche. Almacene el gel en ácido acético al 7 % para su análisis. Después de obtener la imagen del gel, realice un análisis comparativo de los patrones de manchas entre geles y corte las manchas de interés; añada 200 microlitros de solución de fijación a los tapones de gel, vortexee y incube las muestras a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación.

Luego, retire con cuidado y deseche la solución y repita. Añada 30 microlitros de tampón reductor recién preparado a los tubos que contienen los tapones de gel e incube a 60 grados Celsius durante 10 minutos. Deje que las muestras se enfríen.

Luego retire y deseche el tampón. Añada 30 microlitros de tampón de alquilación e incube las muestras en la oscuridad a temperatura ambiente durante una hora; después, retire y deseche el tampón de alquilación. Lave los tapones de gel añadiendo 200 microlitros de solución desnaturalizante a cada tubo e incube las muestras a 37 grados Celsius durante 15 minutos.

Retire y deseche la solución de retención y repita el lavado. A continuación, agregue 50 microlitros de acetonitrilo a los tapones de gel y incúbelos durante 10 minutos a temperatura ambiente para permitir que se sequen y encogieran. Luego, retire cuidadosamente el acetonitrilo y repita con los trozos de gel.

Debería verse blanco y pequeño. Deje secar los trozos de gel en un concentrador durante 10 minutos. Haga hinchar los trozos de gel añadiendo 10 microlitros de solución de tripsina activada.

Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Añadir 25 microlitros de tampón de digestión a los tubos. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante la noche con agitación, sonicar las muestras durante 10 minutos y centrifugarlas antes de transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.

Para extraer más péptidos, agregue 10 microlitros de ácido fórmico al 0,1 % a los tapones e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente con agitación; sonicar las muestras durante 10 minutos. Recopile el sobrenadante y combínelo con el sobrenadante previamente guardado. Luego, las proteínas pueden desalinizarse y prepararse para cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) acoplada a espectrometría de masas; se extrajo y separó músculo esquelético de machos y hembras sin ejercicio en un mapa bidimensional.

En el primer nivel del proteoma muscular comparativo, una vez visualizado mediante imágenes digitales de alta resolución, se detectaron alrededor de 800 puntos proteicos en cada uno, como se observa aquí. Utilizando el mapa del proteoma masculino como referencia, es evidente que existen numerosos puntos cuya abundancia cambia en el proteoma femenino: los puntos proteicos que aumentaron en un valor mayor o igual a dos veces en las hembras están marcados con un círculo rojo, y aquellos que disminuyeron en un valor mayor o igual a dos veces están marcados con un círculo azul. Las identidades de los puntos proteicos que varían más de dos veces hacia arriba o hacia abajo y que son estadísticamente significativos con una N de cinco ratones se determinaron mediante análisis de secuencia de aminoácidos utilizando cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas.

En este gráfico, el eje X representa a ratones hembra antes del ejercicio, y el eje Y representa un grupo en el punto de tiempo de una sola sesión a cero horas. Los resultados muestran que las hembras presentan una disminución abundante en el metabolismo energético de azúcares, enzimas y en isoformas de la enzima creatina quinasa, un sistema de suministro energético diferente en los músculos. Tanto humanos como animales muestran niveles séricos más altos de CK en hombres en reposo y tras el ejercicio, pero los niveles séricos de CK no necesariamente se correlacionan con la cantidad de miofibrilar.

Este dimorfismo por sexo en la abundancia celular de CK en el músculo biceps braquial de ratones es un hallazgo novedoso y podría explicar los niveles séricos de CK fisiológicamente diferentes. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el inmunoblot cuantitativo para verificar los resultados. Después de ver este video, deberíamos tener una buena comprensión de cómo preparar y separar muestras para el perfilado proteómico diferencial.