Name: Músculo Esquelético dimorfismo de género de Proteómica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Aprende a analizar el dimorfismo de género en proteómica del músculo esquelético mediante electroforesis bidimensional y espectrometría de masas. Este método identifica aproximadamente 800 proteínas diferenciales entre muestras masculinas y femeninas.

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Damos las gracias a Yutian Gan para el uso de la figura 3. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias 0420971, el Smith College Blakeslee, Wilens y los fondos de Holmes, y el Howard Hughes Medical Institute.

1. Preparación de la muestra <ol><li> El uso de tejido fresco, congelado o en flash RNAlater tratos de los ratones como material de partida. Blot a la basura cualquier exceso con un conservante Kimwipe antes de proceder. </li><li> Eliminar todos los tendones y la fascia alrededor del músculo y el tejido con pelos en las hojas de afeitar solo filo para los 2 minutos en placas de vidrio enfriado en un cuarto frío (4 ° C) hasta que el tejido está bien picado o en polvo. Recoger la muestra en un tubo de microcentrífuga previamente pesado y determinar el peso del tejido. No utilice más de 10 mg de tejido como material de partida. </li><li> Añadir 45 l de tampón de extracción (8 M urea, 50 mM DTT, CHAPS 4%, 0,2% anfolitos transportista 5.8, 0,0002% bromofenol azul) por mg de tejido una picada, a temperatura ambiente. Si el volumen es superior a 350 l, 350 l añadir inicialmente y homogeneizar (paso 1.4), a continuación, añadir el resto del buffer para minimizar las salpicaduras. </li><li> Homogeneizar el tejido siete veces con un mazo motorizado (Kontes Corp) durante 15 segundos a4 ° C, con dos minutos de enfriamiento en hielo entre cada homogenización. </li><li> Centrifugar las muestras a 15.600 xg durante 30 minutos a 4 ° C. Guardar el sobrenadante y medir su volumen. Los restos de sedimento de células se descarta. </li><li> Precipitar las proteínas en el sobrenadante con helado de acetona de grado reactivo (3 veces v: relación v). Vortex los tubos durante 15 segundos. Centrífuga para 15.600 xg durante 10 segundos para formar pellets y resuspender en tampón de extracción con el motor y barras de polipropileno Kontes agitación (BioSpec Prod) </li><li> Repita el paso 1.6. </li><li> O bien proceder a la estimación de concentración de proteínas de las muestras o almacenarlos a -20 ° C. </li></ol> 2. Proteína estimación de concentración Use el ensayo de Lowry 7 o el ensayo BCA 8 (Pierce), objetivo de unos 4,5 mg ml -1. 3. Isoelectroenfoque <ol><li> Quitar una tira IPG ReadyStrip (11 cm, pH 5.8, Bio-Rad)desde -20 ° C y deje que se equilibre a temperatura ambiente durante 10-15 min. </li><li> Vortex la muestra y la pipeta 600-800 mg (volumen total 200 l) de la muestra de la proteína en una línea recta en el borde posterior de un canal en la bandeja de rehidratación de la muestra, dejando aproximadamente 1 cm en cada extremo. </li><li> Con unas pinzas, retire la tapa de plástico de la tira IPG - Asegúrese de manejar sólo los extremos de la banda y evitar cualquier contacto con el gel. Nota final básicos de la tira y colocarla en el lado izquierdo de la bandeja. Coloque la tira IPG gel hacia abajo en la parte superior de la muestra, evite la retención de burbujas debajo. Deje que se rehidratan durante una hora. </li><li> Superposición con 2,5 ml de aceite mineral (BioRad). Cubra la bandeja con la tapa, y dejar hidratar durante la noche a temperatura ambiente. </li><li> Coloque una mecha de papel en ambos extremos del canal de la bandeja de enfoque y húmeda cada uno con 10 l de agua Millipore. </li><li> Saque la tira IPG y sosténgalo de forma vertical durante unos 10 segundos el desagüe el aceite. Seque la b de plásticoACKing con un Kimwipe. </li><li> Coloque el lado de la tira de gel IPG abajo y con fines básicos de la izquierda en la bandeja de enfoque. Cubrir la franja con 2,5 ml de aceite mineral. </li><li> Coloque la bandeja en la célula PROTEAN IEF (Bio-Rad) y el programa de un protocolo de 3 pasos (Tabla 1) a la temperatura de celda predeterminado de 20 ° C, una corriente máxima de 50 mA / tira, y no hay tiempo de rehidratación. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Voltaje </td><td> Tiempo </td><td> Volt-Horas </td><td> Rampa </td></tr><tr><td> Paso 1 </td><td> 250 </td><td> 20 min </td><td></td><td> Lineal </td></tr><tr><td> Paso 2 </td><td> 8000 </td><td> 2,5 horas </td><td></td><td> Lineal </td></tr><tr><td> Paso 3 </td><td> 8000 </td><td></td><td> 40.000 </td><td> Rápido </td></tr><tr><td> Total </td><td></td><td> 6,5 horas </td><td> 40.000 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Tres pasos del protocolo de Protean IEF celular de 11 cm IPG tiras. </li><li> Tome las tiras IPG fuera de la célula del IEF con el fórceps. Seque el respaldo de plástico con un Kimwipe y coloque el lado tira de gel IPG en una bandeja de rehidratación limpia. Puede cubrir la bandeja de rehidratación y envolverlo con papel plástico y almacenar a - 80 ° C o proceder. </li></ol> 4. SDS electroforesis en gel de poliacrilamida <ol><li> Transferencia de la franja (hasta gel de lado) en una bandeja de 11 cm de equilibrio. </li><li> Agregar 4 ml de tampón de reducción (6 M urea, 2% SDS, 0,05 M de Tris / HCl pH 8,8, 20% de glicerol, 2% TDT) para el canal y equilibrar la tira durante 10 minutos con agitación suave. </li><li> Eliminar el buffer de reducción, añadir 4 ml de tampón de alquilación (6 M urea, 2% SDS, 0,05 M de Tris / HCl pH 8,8, 20% de glicerol, un 2,5% yodoacetamida) y equilibrar la tira durante 10 minutos con agitación suave. </li><li> Enjuague la tira IPG por inmersión del STRIp brevemente en 1 X tampón SDS funcionamiento (25 mM Tris, 192 mM glicina, 0,1% SDS, pH 8,2). </li><li> Coloque el lado del gel de la tira para arriba sobre la placa posterior de los 11 cm Criterio prefabricados 10,5% y un 14% Tris-HCl en gel de poliacrilamida SDS (Bio-Rad) y presione suavemente en el modo que se haga pleno contacto con el gel de SDS; asegurarse de que no haya burbujas atrapadas entre las dos superficies de gel. </li><li> Superposición de la tira IPG con 1 ml de solución de agarosa fundida (0,5% de agarosa, 25 mM Tris, 192 mM glicina, SDS 0,1%, azul de bromofenol) y dejar solidificar la agarosa durante 5 minutos. </li><li> Carga de 5 l de proteína marcadora 10-225 kDa (USB, P / N: 76740) en el único pozo como estándares de peso molecular. </li><li> Ejecute el gel de SDS buffer (25 mM Tris, 192 mM glicina, 0,1% SDS, pH 8.2) a 200 V a temperatura ambiente o en un cuarto frío (4 ° C), utilizando el azul de bromofenol migración frente tinte para controlar la electroforesis. </li><li> Quitar el gel de la fundición de plástico y mancha la noche agitando suavemente en azul brillante de CoomassieR-250 mancha (45,5% de metanol, el 45,5% dH2O, el 9,0% de ácido acético, 0,25% Coomassie Brilliant Blue R-250). </li><li> Agite el gel en una solución Destain (45,5% de metanol, el 45,5% dH 2 O, 9,0% de ácido acético) dos veces durante 3 horas cada uno y en Destain 2 (5% de metanol, 90% dH 2 O, 5% de ácido acético) durante la noche. Guarde el gel en el 7% de ácido acético para el análisis. </li></ol> 5. Gel de imágenes y análisis <ol><li> Capturar imágenes de los geles utilizando la cantidad Un programa de software que opera el sistema de imágenes VersaDoc (BioRad). Cultivos las áreas de imagen de manera uniforme para todos los geles en su experimento. </li><li> Cargar las imágenes recortadas en el programa PDQuest software 8.0 para crear un conjunto de experimentos. Siga el asistente de configuración experimento para definir los parámetros para la detección de puntos y el punto correspondiente a través de los geles. Revisar y perfeccionar el lugar correspondiente los resultados manualmente si es necesario. </li><li> Realizar un análisis cuantitativo y estadístico de los geles para detectar manchas de proteínas emparejado con twdiferencias estadísticamente significativas o veces o más en la expresión entre los dos grupos de gel. Crear un análisis conjunto de estos puntos de interés y recortarlas utilizando un cortador lugar EXQuest (BioRad) para la digestión de la tripsina y la LC-MS-basado en la identificación de proteínas. </li></ol> 6. En-gel tríptico digestión Para este paso un Pierce modificado en gel tríptico Compendio Kit (# 89871X, Pierce) se utiliza el protocolo. <ol><li> Añadir 200 l de solución decolorante (25 mM de bicarbonato de amonio, el 50% de acetonitrilo) a los enchufes de gel. Agitar e incubar las muestras a 37 ° C durante 30 minutos con agitación. Retire con cuidado y deseche la solución. </li><li> Repita el paso 6.1. </li><li> Añadir 30 l de tampón recién preparado la reducción (50 mM Tris [2-carboxietil] fosfina, un 22,5 mM de bicarbonato de amonio) a los tubos con los tapones de gel e incubar a 60 ° C durante 10 minutos. </li><li> Permita que las muestras que se enfríe, luego retirar y desechar el buffer de la reducción.</li><li> Añadir 30 l de tampón de alquilación (100 mM yodoacetamida, 20 mM de bicarbonato de amonio, preparada inmediatamente antes de su uso en tubos envueltos en papel de aluminio. Incubar las muestras en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 hora. </li><li> Retire y deseche el buffer de alquilación. Lave los tapones de gel mediante la adición de 200 l de solución de decoloración de cada tubo. Incubar las muestras a 37 ° C durante 15 minutos. </li><li> Retire y deseche la solución decolorante y repetir el lavado. </li><li> Añadir 50 l de acetonitrilo a los tapones de gel e incubar por 10 minutos a temperatura ambiente para permitir que se contraigan en seco, a continuación, retire con cuidado el acetonitrilo. </li><li> Repita el paso 6.8, una vez más. Piezas de gel debe verse blanca y pequeña. </li><li> Permiten que las piezas de gel se seque en un concentrador de CentriVap (Labconco, modelo EX1245) durante 10 minutos. </li><li> Engrosar las piezas de gel mediante la adición de 10 l de solución de tripsina activada (10 tripsina ng / l, 25 mM de bicarbonato de amonio). Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. </li><li> Añadir 25 l tampón de digestión (25 mM de bicarbonato de amonio) a los tubos. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante la noche con agitación. </li><li> Sonicar las muestras durante 10 minutos (Branson, modelo baño sonicador 2510) y el giro hacia abajo antes de retirar el sobrenadante a un tubo nuevo. Guardar el sobrenadante. </li><li> A fin de extraer los péptidos, se añaden 10 l de 0,1% de ácido fórmico y se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente con agitación. Sonicar las muestras durante 10 minutos, recoge el sobrenadante y se combinan con sobrenadante guardado en el paso 6.13. </li></ol> 7. Desalación microescala de los extractos peptídicos <ol><li> Eliminar el bicarbonato de amonio y otras sales en los extractos peptídicos con la ayuda de PepClean C-18 columnas de centrifugado (ThermoFisher) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Péptidos eluir dos veces con 20 l de acetonitrilo 70%, se evaporan las muestras secas por centrifugación en el Concentrador CentriVap durante 1 hora y resuspenderlos péptidos en 10 l de ácido fórmico al 0,1% para el análisis de MS. </li></ol> 8. La identificación de proteínas por HPLC-espectrometría de masas acoplada <ol><li> Independiente de 5 l de la mezcla de péptidos en un cromatógrafo de líquidos de alta eficacia (HPLC) de más de 40 minutos, utilizando un gradiente lineal de 20 a 50% de acetonitrilo con 0,2% de ácido fórmico en una Pepswift monolítica PS-DVB columna (Dionex) acoplado a un nanospray I de origen en un espectrómetro de trampa de iones de masas (LCQ Deca XP Max, Thermo Fisher Scientific) con un caudal de 400 nL / min en la punta. </li><li> Detectar péptido MS1 señales entre 400 a 1400 m / z y permiten los 3 picos de iones más intensos que ser aislado para MS2 secuenciación por CID con la exclusión dinámica. </li><li> Para la identificación de proteínas, análisis de los resultados de péptidos a través de una búsqueda de base de datos de referencia del ratón Sequest (BioWorks software Thermo-Fisher Scientific) con una modificación de la cisteína estática alquiladas y modificaciones dinámicas de la fosforilación (serina, treonina, tirosina), metilaciónción (histidina), oxidación (metionina), ADP-ribosilación (arginina), y la acetilación N-terminal. Aplicar criterios de coincidencia conservadora (por ejemplo, la tolerancia péptido establece en 2 UMA y 1,00 tolerancia fragmento, proteínas contienen al menos dos péptidos pasar un Xcorr vs Estado de carga del filtro [z = 1 / x = 1.5, z = 2 / x = 2.00, z = 3 / x = 2.50, z = 4 / x = 3,00] y una probabilidad de p &lt;0,05) y cinco inspeccionar manualmente los espectros de MS para la identificación de proteínas confianza. </li></ol> 9. Los resultados representativos: Hombres y mujeres no ejercidas, el músculo esquelético murino (bíceps braquial) se extrae y se separa en un mapa en dos dimensiones 5, el primer nivel del músculo comparativo del proteoma (Figura 2). Una vez visualizado el uso de alta resolución de imágenes digitales, cerca de 800 puntos de la proteína fueron detectados en cada uno. Utilizando el mapa del proteoma masculina como una línea de base, está claro que hay numerosos lugares que el cambio en la abundancia en el proteoma de las mujeres. La intensidad de mancha se medidas del cambio en las cantidades de proteínas (Figura 3). Las identidades de las manchas de proteínas que cambian más de dos veces (hacia arriba o hacia abajo) y son estadísticamente significativas (p &lt;0,05) con un n = 5 ratones, se determinó mediante análisis de la secuencia de aminoácidos utilizando cromatografía líquida-espectrometría de masas acoplada. Estos resultados muestran que las mujeres demuestran una disminución de la abundancia de las enzimas de azúcar en el metabolismo energético y en la enzima creatina quinasa (CK) isoformas, un sistema de suministro de energía diferentes en los músculos. Los seres humanos y animales muestran mayores niveles séricos de CK macho en reposo y después del ejercicio 9,10, pero los niveles séricos de CK no se corresponden necesariamente con la cantidad de interrupciones miofibrilar 11,12. Este dimorfismo de género en la abundancia celular de CK en el músculo bíceps braquial murino es una novela finding5 y puede responder a las fisiológicamente diferentes niveles séricos de CK. Cifras: g1.jpg "/&gt; Figura 1. Un esquema general del protocolo para la proteómica comparativa. El protocolo se divide en tres grupos: preparación de muestras, análisis de la muestra, y, la identificación de proteínas. Los extremos de cada uno de estos tres grupos de protocolos también están haciendo una pausa razonable lugares, aunque los mejores resultados se obtuvo, si el protocolo general se lleva a cabo sin parar. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3536/3536fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Comparación de las mujeres proteína murina bíceps braquial puntos en relación con los puntos idénticos en bíceps braquial masculino (verde o círculos). Puntos que el aumento mayor o igual a dos veces en las mujeres con un círculo rojo (o) y los que bajaron menos que o igual a dos veces con un círculo azul (o). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3536/3536fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3 Punto Gel Análisis de Intensidad:. Del eje X, las mujeresantes del ejercicio (control, n = 5), eje Y, las mujeres solteras que pelea 0 grupo de puntos de horas de tiempo (n = 5). Línea de regresión: coeficiente de correlación = 0,919; pendiente = 0,976; interceptar = -0.0293. Puntos por encima de la línea roja y por debajo de la línea azul cambiar más de + / - dos veces.

<ol><li>Fehrenbach, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFehrenbach%2C+E+%22Molecular+and+Cellular+Exercise+Physiology%22">Molecular and Cellular Exercise Physiology</a>. Mooren, F. C., Völker, K. , Human Kinetics. New York. 199-217 (2005).</li>
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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método de LC / MS proteómica que aquí se presenta es un protocolo más fiable y reproducible para un análisis rápido del primer nivel del proteoma del músculo esquelético. Además, permite una comparación razonable expediente de la especificidad de género. Proteínas de baja abundancia que requieren un fraccionamiento de la muestra de músculo para eliminar la mayor cantidad de proteínas contráctiles como sea posible, lo que aumenta las proteínas de baja abundancia. Adaptar el perfil de proteoma se puede lograr con diferentes tiras IPG rango de pH y un suplente geles de gradiente porcentaje si así lo desea. Colorantes fluorescentes más sensibles existen, pero se recomienda que cada laboratorio determine la linealidad de estas manchas en su sistema. Para un análisis más riguroso de la expresión proteica del sistema DIGE (bidimensional en gel de electroforesis sistema, GE Healthcare Life Sciences) se puede utilizar, sin embargo esto se le añade un nivel de complejidad de la metodología. Además, el protocolo descrito en este documento se puede utilizar con la mayoría de los animalestejidos mal para el que ha sido una secuencia del genoma, así como de secuenciación de novo de una proteína a partir de cualquier fuente, siempre y cuando se puede resolver en un gel de dos dimensiones, ya que se superponen fragmentos enzimática se puede generar el uso de enzimas de alta pureza, además de a la tripsina. Las muestras de tejido de otras fuentes pueden requerir algunas modificaciones en la metodología de extracción, especialmente si busca proteínas de la membrana e hidrofóbicas, sin embargo, hemos tenido buenos resultados con este protocolo con el corazón, el hígado, los riñones y los tejidos del cerebro. Otras modificaciones post-traduccionales se pueden detectar mediante la modificación del espectro de masas criterios de búsqueda de base de datos. En resumen, hemos presentado un protocolo inicial razonablemente detallado para el análisis de perfiles proteoma.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Tipo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> PepClean C-18 Giro Columnas </td><td> Consumible </td><td> ThermoFisher Científico </td><td> PI-89870 </td><td></td></tr><tr><td> Monolítica Pepswift columna (100um x 5 cm) </td><td> Consumible </td><td> Dionex </td><td> 162348 </td><td></td></tr><tr><td> Criterio prefabricado 10,5% y un 14% Tris-HCl SDS geles de poliacrilamida </td><td> Consumible </td><td> BioRad </td><td> 345-0106 </td><td></td></tr><tr><td> Readystrip tiras IPG </td><td> Consumible </td><td> BioRad </td><td> Diferentes pH rangos de </td><td></td></tr><tr><td> Ácido acético </td><td> Reactivo </td><td> Fisher Scientific </td><td> A465-1 </td><td></td></tr><tr><td> Acetona </td><td> Reactivo </td><td> Pharmco </td><td> 329000 </td><td></td></tr><tr><td> Acetonitrilo </td><td> Reactivo </td><td> Fisher Scientific </td><td> A955 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Reactivo </td><td> BioRad </td><td> 163-2111 </td><td> Superposición solución </td></tr><tr><td> De bicarbonato de amonio </td><td> Reactivo </td><td> Fluka </td><td> 40867 </td><td></td></tr><tr><td> Azul de bromofenol </td><td> Reactivo </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP114 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Lyte anfolitos </td><td> Reactivo </td><td> BioRad </td><td></td><td> Diferentes pH rangos de </td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> Reactivo </td><td> USB </td><td> 13361 </td><td></td></tr><tr><td> Commassie blue R-250 </td><td> Reactivo </td><td> ThermoFisher Científico </td><td> 20278 </td><td></td></tr><tr><td> Ditiotreitol (DTT) </td><td> Reactivo </td><td> USB </td><td> 15395 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido fórmico </td><td> Reactivo </td><td> ThermoFisher Científico </td><td> 28905 </td><td></td></tr><tr><td> Glicerol </td><td> Reactivo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G6279 </td><td></td></tr><tr><td> Glicina </td><td> Reactivo </td><td> USB </td><td> 16407 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Yodoacetamida </td><td> Reactivo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6125 </td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Reactivo </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452 </td><td></td></tr><tr><td> De aceite mineral </td><td> Reactivo </td><td> BioRad </td><td> 163-2129 </td><td></td></tr><tr><td> Dodecilsulfato de sodio </td><td> Reactivo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6026 </td><td></td></tr><tr><td> Tris base </td><td> Reactivo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 93349 </td><td></td></tr><tr><td> Tris [2-carboexyethyl] fosfina </td><td> Reactivo </td><td> ThermoFisher Científico </td><td> 77720 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina endoproteinasa, TPCK tratada, MS grado </td><td> Reactivo </td><td> Atravesar </td><td> 90055 </td><td> modificado </td></tr><tr><td> Urea </td><td> Reactivo </td><td> USB </td><td> 75826 </td><td></td></tr><tr><td> De agua </td><td> Reactivo </td><td> Burdick &amp; Jackson </td><td> 365 </td><td></td></tr><tr><td> CentriVap Concentrador </td><td> TOOL </td><td> Labconco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Exquest cortador de lugar </td><td> Herramienta </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LCQ Deca XP Max ion espectrómetro de masas de trampa </td><td> Herramienta </td><td> ThermoFisher Científico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Motorizados maja </td><td> Herramienta </td><td> Kontes Corp </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Polipropileno agitando </td><td> Herramienta </td><td> BioSpec Prod </td><td></td><td></td></tr><tr><td> barras </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PROTEAN IEF celular </td><td> Herramienta </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sonicator </td><td> Herramienta </td><td> Branson </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Además HPLC Surveyor sistema </td><td> Herramienta </td><td> ThermoFisher Científico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> VersaDoc imágenes sistema </td><td> Herramienta </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

músculo esquelético dimorfismo de género de proteómica

Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Contracción bruto en el músculo esquelético está determinada principalmente por un número relativamente pequeño de las proteínas contráctiles, sin embargo, este tejido es también muy adaptable a los factores ambientales, tales como un ejercicio de resistencia por la hipertrofia y atrofia por desuso. Es lo que muestra la remodelación y adaptación a los factores de estrés (calor, isquemia, metales pesados, etc.) 2,3. El daño puede ocurrir en el músculo por músculo ejerce una fuerza, mientras que el alargamiento, el 4 llamado contracción excéntrica. Las proteínas contráctiles puede ser dañado en tales esfuerzos y necesita ser reparado, degradados y / o resintetizado, estas funciones no son parte de las proteínas contráctiles, sino de otras proteínas y mucho menos abundantes en la célula. Para determinar qué subconjunto de proteínas está implicada en la mejora de este tipo de daño, el proteoma global debe ser establecido antes del ejercicio 5 y luego seguir como consecuencia del ejercicio para determinar el diferencialexpresión de la proteína y por lo tanto poner de relieve las proteínas candidatas en las adaptaciones a los daños y su reparación. Además, la mayoría de los estudios de los músculos esqueléticos se han realizado en el macho de la especie y por lo tanto puede no ser representativa de músculo femenino. En este artículo se presenta un método para extraer las proteínas de los músculos de forma reproducible hombres y mujeres, y los separa por electroforesis bidimensional en gel seguido de imágenes de alta resolución digital 6. Esto proporciona un protocolo de puntos (y de las proteínas identificadas posteriormente), que muestran una diferencia estadísticamente significativa (p &lt;0,05) de dos veces el aumento o disminución, aparecen o desaparecen del estado de control. Estos se extirpa, se digieren con tripsina y se separaron por cromatografía líquida de alta presión, acoplado a un espectrómetro de masas (LC / MS) para la identificación de proteínas (LC / MS / MS) 5. Esta metodología (Figura 1) se puede utilizar en muchos tejidos con poca o ninguna modificación (hígado, cerebro, oídot etc.).

Un conjunto de straight-forward de los métodos para aislar y determinar la identidad de las proteínas más abundantes se expresa en el músculo esquelético. Cerca de 800 puntos se vislumbran en un gel bidimensional de los músculos de 10 mg, lo que permite la determinación de los específicos de género expresión de la proteína. Estos métodos dan resultados equivalentes en la mayoría de los tejidos.

Músculo Esquelético dimorfismo de género de Proteómica

La contracción global en el músculo esquelético está determinada principalmente por un número relativamente pequeño de proteínas contráctiles; sin embargo, este tejido es también notablemente...

El objetivo general de este procedimiento es determinar la especificidad sexual de las diferencias en los perfiles del proteoma del músculo esquelético. Esto se logra primero mediante la trituración y homogenización completa de tejidos del músculo bíceps braquial de ratones macho y hembra para extraer la mayor parte de las proteínas. A continuación, la muestra se aplica a una tira de gel IEF y las proteínas se separan según su punto isoeléctrico, seguido de una electroforesis SDS-PAGE, que realiza la separación en una segunda dimensión según el tamaño. Tras la tinción y obtención de imágenes de los geles, se comparan los perfiles proteómicos de las muestras musculares de machos y hembras, y se extraen los puntos con diferencias significativas en abundancia entre ambos sexos.Finalmente, las proteínas en los tapones de gel se digieren con tripsina. Los péptidos resultantes se extraen del gel y se someten a cromatografía líquida en nanoescala y análisis por espectrometría de masas para su identificación. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la expresión diferencial de proteínas en dos o más condiciones experimentales mediante electroforesis en gel bidimensional y proteómica basada en espectrometría de masas.Aunque este método puede ofrecer información sobre la especificidad muscular según el sexo, también puede aplicarse a otras células, tejidos, órganos o fluidos en distintos estados fisiológicos. La doctora Kalina Diva, directora técnica del Centro de Proteómica del Smith College, demostrará el procedimiento. Después de aislar, limpiar y picar el músculo esquelético de ratón, utilice 45 microlitros de tampón de extracción por gramo de tejido; consulte el protocolo escrito para esta y todas las demás recetas de tampones. Mediante un pistilo motorizado, homogenice el tejido siete veces durante 15 segundos cada vez a cuatro grados Celsius, enfriando dos minutos en hielo entre cada homogenización.Centrifugar las muestras a 15,800 G durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Guardar el sobrenadante y medir su volumen. Desechar el precipitado para precipitar las proteínas en tres volúmenes de hielo.Acetona fría de grado reactivo por volumen de sobrenadante. Vortexee los tubos durante 15 segundos, luego centrifugue a 15.800 Gs durante 10 segundos para formar los pellet. Deseche el sobrenadante y re suspenda los pellet en tampón de extracción con el pistilo motorizado y varillas de agitación de polipropileno; precipite las proteínas una segunda vez añadiendo tres volúmenes adicionales de acetona.Después de resuspender el precipitado y el tampón de extracción, determine la concentración de proteína y/o almacene las muestras a menos 20 grados Celsius. Para realizar el enfoque isoeléctrico de las proteínas, retire una tira IPG lista del congelador a menos 20 grados Celsius y déjela equilibrar a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos. Vortexee la muestra y pipetee de 600 a 800 microgramos de proteína en una línea recta en el borde posterior de un canal en la bandeja de rehidratación de la muestra, dejando aproximadamente un centímetro en cada extremo.Utilizando pinzas, retire la cubierta de plástico de la tira IPG, asegurándose de manipular únicamente los extremos de la tira y evitando cualquier contacto con el gel. Observe el extremo marcado como positivo de la tira y colóquelo en el lado izquierdo de la bandeja. Coloque la tira IPG con el lado del gel hacia abajo encima de la muestra.Evite atrapar burbujas debajo. Deje que se rehidrate durante una hora. Cubra la tira con 2.5 mililitros de aceite mineral.Cubra la bandeja con una tapa y déjela hidratarse durante la noche. Al día siguiente, a temperatura ambiente, coloque una mecha de papel en ambos extremos del canal de enfoque y humedezca cada una con 10 microlitros de agua millipore. Retire la tira IPG y sosténgala verticalmente durante aproximadamente 10 segundos.Para drenar el aceite, absorba el respaldo de plástico con una toallita Kim. Coloque la tira IPG con el lado del gel hacia abajo y el extremo básico hacia la izquierda. En la bandeja de enfoque, cubra la tira con 2,5 mililitros de aceite mineral.Coloque la bandeja en la celda protean IEF y programe un protocolo de tres pasos a una temperatura predeterminada de la celda de 20 grados Celsius, una corriente máxima de 50 microamperios por tira y sin tiempo de rehidratación. Una vez finalizado el programa, transfiera la tira de gel con la cara hacia arriba a una bandeja de equilibración de 11 centímetros. Añada cuatro mililitros de tampón reductor al canal y equilibre la tira durante 10 minutos con agitación suave.Retire el tampón de reducción y agregue cuatro mililitros de tampón de alquilación al canal. Equilibre la tira con agitación durante 10 minutos adicionales. Enjuague la tira IPG sumergiéndola brevemente en tampón de electroforesis 1XSDS. A continuación, coloque la tira con la cara del gel hacia arriba sobre la placa posterior de un criterio de 11 centímetros.Coloque un gel precolado de poliacrilamida tris-HCl-SDS del 10,5 al 14 % e insértelo suavemente para que haga contacto completo con el gel SDS. Asegúrese de que no queden burbujas atrapadas entre las dos superficies del gel. Cubra la tira IPG con un mililitro de solución de agarosa fundida y deje que solidifique durante cinco minutos.Luego, cargue cinco microlitros de marcador de proteínas en el pozo individual. Corra el gel en tampón SDS a 200 voltios a temperatura ambiente o a cuatro grados Celsius. Cuando el frente de colorante alcance la parte inferior del gel, retírelo del molde de plástico y tiña durante la noche agitando suavemente en azul brillante de Kumasi.Agite el gel en la solución de fijación dos veces durante tres horas cada vez y deje en fijación dos durante la noche. Almacene el gel en ácido acético al 7 % para su análisis. Después de obtener la imagen del gel, realice un análisis comparativo de los patrones de manchas entre geles y corte las manchas de interés; añada 200 microlitros de solución de fijación a los tapones de gel, vortexee y incube las muestras a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación.Luego, retire con cuidado y deseche la solución y repita. Añada 30 microlitros de tampón reductor recién preparado a los tubos que contienen los tapones de gel e incube a 60 grados Celsius durante 10 minutos. Deje que las muestras se enfríen.Luego retire y deseche el tampón. Añada 30 microlitros de tampón de alquilación e incube las muestras en la oscuridad a temperatura ambiente durante una hora; después, retire y deseche el tampón de alquilación. Lave los tapones de gel añadiendo 200 microlitros de solución desnaturalizante a cada tubo e incube las muestras a 37 grados Celsius durante 15 minutos.Retire y deseche la solución de retención y repita el lavado. A continuación, agregue 50 microlitros de acetonitrilo a los tapones de gel y incúbelos durante 10 minutos a temperatura ambiente para permitir que se sequen y encogieran. Luego, retire cuidadosamente el acetonitrilo y repita con los trozos de gel.Debería verse blanco y pequeño. Deje secar los trozos de gel en un concentrador durante 10 minutos. Haga hinchar los trozos de gel añadiendo 10 microlitros de solución de tripsina activada.Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Añadir 25 microlitros de tampón de digestión a los tubos. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante la noche con agitación, sonicar las muestras durante 10 minutos y centrifugarlas antes de transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.Para extraer más péptidos, agregue 10 microlitros de ácido fórmico al 0,1 % a los tapones e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente con agitación; sonicar las muestras durante 10 minutos. Recopile el sobrenadante y combínelo con el sobrenadante previamente guardado. Luego, las proteínas pueden desalinizarse y prepararse para cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) acoplada a espectrometría de masas; se extrajo y separó músculo esquelético de machos y hembras sin ejercicio en un mapa bidimensional.En el primer nivel del proteoma muscular comparativo, una vez visualizado mediante imágenes digitales de alta resolución, se detectaron alrededor de 800 puntos proteicos en cada uno, como se observa aquí. Utilizando el mapa del proteoma masculino como referencia, es evidente que existen numerosos puntos cuya abundancia cambia en el proteoma femenino: los puntos proteicos que aumentaron en un valor mayor o igual a dos veces en las hembras están marcados con un círculo rojo, y aquellos que disminuyeron en un valor mayor o igual a dos veces están marcados con un círculo azul. Las identidades de los puntos proteicos que varían más de dos veces hacia arriba o hacia abajo y que son estadísticamente significativos con una N de cinco ratones se determinaron mediante análisis de secuencia de aminoácidos utilizando cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas.En este gráfico, el eje X representa a ratones hembra antes del ejercicio, y el eje Y representa un grupo en el punto de tiempo de una sola sesión a cero horas. Los resultados muestran que las hembras presentan una disminución abundante en el metabolismo energético de azúcares, enzimas y en isoformas de la enzima creatina quinasa, un sistema de suministro energético diferente en los músculos. Tanto humanos como animales muestran niveles séricos más altos de CK en hombres en reposo y tras el ejercicio, pero los niveles séricos de CK no necesariamente se correlacionan con la cantidad de miofibrilar.Este dimorfismo por sexo en la abundancia celular de CK en el músculo biceps braquial de ratones es un hallazgo novedoso y podría explicar los niveles séricos de CK fisiológicamente diferentes. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el inmunoblot cuantitativo para verificar los resultados. Después de ver este video, deberíamos tener una buena comprensión de cómo preparar y separar muestras para el perfilado proteómico diferencial.

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Medicina

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Adultas y embrionarias del músculo esquelético Cultura Microexplant y aislamiento de células madre de músculo esquelético

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Humano<em&gt; vasto externo</em&gt; Esquelético biopsia muscular utilizando el Weil-Blakesley Conchotome

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La coloración de Immunohistochemical de las isoformas de cadena pesada de miosina ha surgido como discriminador de estado de la técnica del tipo de fibra del músculo esquelético (es decir, tipo I, tipo IIA, tipo IIX, tipo IIB). Aquí, presentamos un protocolo de tinción junto con un algoritmo novela semi-automatizado que facilita la rápida evaluación de la morfología del tipo de fibra y fibra.

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Fibras musculares esqueléticas cortas, intermedias y largas intactas obtenidas por disociación enzimática de seis músculos de las extremidades posteriores de ratones: más allá del flexor corto de los dedos

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Músculo Esquelético dimorfismo de género de Proteómica

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