Name: Microarrays de polímeros de alto rendimiento para el descubrimiento de Biomateriales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: Aprende a generar microarrays de polímeros mediante fotopolimerización en chip para evaluar biomateriales. Este método permite el cribado de materiales resistentes a la adherencia bacteriana y su aplicación en medicina regenerativa.

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La financiación de la Wellcome Trust es amablemente reconocido (número de concesión 085245/Z/08/Z). La nanotecnología Nottingham y el Centro de Nanociencia es amablemente reconocido por dar acceso al sistema Raman y de la Agencia de Desarrollo de East Midlands para la financiación de este equipo.

<ol><li>Hook, A. L., Anderson, D. G., Langer, R., Williams, P., Davies, M. C., Alexander, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+methods+applied+in+biomaterial+development+and+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">High throughput methods applied in biomaterial development and discovery.</a> Biomaterials. 31, 187-198 (2010).</li>
<li>Anderson, D. G., Levenberg, S., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter-scale+synthesis+of+arrayed+biomaterials+and+application+to+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 22, 863-866 (2004).</li>
<li>Mei, Y., Saha, K., Bogatyrev, S. R., Yang, J., Hook, A. L., Kalcioglu, Z. I., Cho, S. W., Mitalipova, M., Pyzocha, N., Rojas, F., Van Vliet, K. J., Davies, M. C., Alexander, M. R., Langer, R., Jaenisch, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+development+of+biomaterials+for+clonal+growth+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells.</a> Nature Materials. 9, 768-778 (2010).</li>
<li>Pernagallo, S., Wu, M., Gallagher, M. P., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonising+new+frontiers-microarrays+reveal+biofilm+modulating+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Colonising new frontiers-microarrays reveal biofilm modulating polymers.</a> Journal of Materials Chemistry. 21, 96-101 (2011).</li>
<li>Yang, J., Mei, Y., Hook, A. L., Taylor, M., Urquhart, A. J., Bogatyrev, S. R., Langer, R., Anderson, D. G., Davies, M. C., Alexander, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+surface+functionalities+that+control+human+embryoid+body+cell+adhesion+revealed+by+high+throughput+surface+characterization+of+combinatorial+material+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Polymer surface functionalities that control human embryoid body cell adhesion revealed by high throughput surface characterization of combinatorial material microarrays.</a> Biomaterials. 31, 8827-8838 (2010).</li>
<li>Urquhart, A. J., Anderson, D. G., Taylor, M., Alexander, M. R., Langer, R., Davies, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+surface+characterisation+of+a+combinatorial+material+library%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">High throughput surface characterisation of a combinatorial material library.</a> Advanced Materials. 19, 2486-2491 (2007).</li>
<li>Taylor, M., Urquhart, A. J., Zelzer, M., Davies, M. C., Alexander, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picoliter+water+contact+angle+measurement+on+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Picoliter water contact angle measurement on polymers.</a> Langmuir. 23, 6875-6878 (2007).</li>
<li>Urquhart, A. J., Taylor, M., Anderson, D. G., Langer, R., Davies, M. C., Alexander, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TOF-SIMS+analysis+of+a+576+micropatterned+copolymer+array+to+reveal+surface+moieties+that+control+wettability%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">TOF-SIMS analysis of a 576 micropatterned copolymer array to reveal surface moieties that control wettability.</a> Analytical Chemistry. 80, 135-142 (2008).</li>
<li>Hook, A. L., Yang, J., Chen, X., Roberts, C. J., Mei, Y., Anderson, D. G., Langer, R., Alexander, M. R., Davies, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrylate+polymers+with+hydro-responsive+topography%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Acrylate polymers with hydro-responsive topography.</a> Soft Matter. 7, Forthcoming 7194-9197 (2011).</li>
<li>Pernagallo, S., Unciti-Broceta, A., Diaz-Mochon, J. J., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+cellular+morphology+and+biocompatibility+using+polymer+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Deciphering cellular morphology and biocompatibility using polymer microarrays.</a> Biomedical Materials. 3, (2008).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

Microarrays de polímero han sido utilizados con éxito para el descubrimiento de nuevos materiales por cientos de detección de la novela de polímero en un ensayo biológico e identificar &#39;hit&#39; materiales que posteriormente pueden ampliarse a dispositivos útiles. En este caso, la caracterización de la superficie se describe se puede emplear con posterioridad a la prueba biológica y exclusivamente en el &#39;golpe&#39; materiales para estudiar los materiales con mayor detalle. Esta estrategia puede ser de interés si HTSC no está disponible para el experimentador emplear este enfoque. Sin embargo, para utilizar completamente microarrays de polímero para estudiar las interacciones de material biológico-toda la gama de cientos de materiales deben ser analizados antes de los ensayos biológicos usando metodologías HTSC, que posteriormente se pueden utilizar para observar generales estructura-función de las tendencias. La impresión por contacto se apoya en el perno de metal se deslice hacia arriba y hacia abajo libremente dentro del soporte de pasador. Limpieza y Pin pin titular es lo más importante es asegurarse de printing se produce con éxito y debe llevarse a cabo con rigor. Antes de comenzar una impresión ejecutar el movimiento apropiado de la clavija dentro del soporte de pasador se puede probar mediante la realización de una marcha en seco, sin monómeros presentes. La etapa de limpieza debe continuar hasta que el movimiento se consigue pin reproduciblemente. Pensamiento considerable debe ir en el diseño de la mezcla de monómeros. Con el fin de producir fácilmente una biblioteca combinatoria de polímeros, cientos de copolímeros se forman mezclando una monómeros pocos en diferentes proporciones. Típicamente producir 576 bibliotecas miembros ya que esto forma una matriz 24 x 24, que es adecuada para la geometría de un portaobjetos de vidrio. Con el fin de producir una biblioteca combinatoria que explora el espacio más combinatoria el método más sencillo es mezclar 24 monómeros pairwise en la relación 2:1. Alternativamente, la inclusión de los gradientes de composición dentro de la matriz son útiles para permitir las observaciones de las tendencias, lo que permite composiciones óptimas de monómero a ser determined. Como un ejemplo de este 22 monómeros se pueden utilizar como primer componente en una mezcla de co-monómero que se diluyó secuencialmente con 1 de 6 segundos componentes. Si 5 diluciones se utilizan, por ejemplo mezclando los componentes primero y segundo en proporciones de 90:10, 75:25, 50:50, 25:75 y 10:90, esto resultaría en 488 soluciones de copolímero únicas. Para llevar el total a 576, repeticiones de los homopolímeros de los monómeros usados ​​pueden ser introducidos, que a menudo es una muestra de referencia importante. 576 soluciones de monómero debe ser dispensado en 2 384 placas de pocillos. Para la programación del robot que es más fácil tener dos placas idénticas en términos de la posición de los monómeros, por lo tanto, las soluciones de monómero se debe dividir de manera uniforme entre las dos placas. Una cantidad significativa de tiempo se pueden guardar en la preparación de las placas de código mediante el uso de pipetas multicanal, y el diseño de placas de origen debe ser determinado con el fin de explotar el uso de las pipetas multicanal. &lt;/ P&gt; Para lograr HTSC automatizado de las matrices de la posición de la mancha debe ser correctamente alineado con el aparato de caracterización. Normalmente, el paso de una serie de acrilato es 500-1000 micras y el diámetro del punto de polímero es de 300 m. La mayoría de las etapas XY tienen una resolución por debajo de 10 micras, con lo que la tolerancia es adecuada para el aparato de caracterización de la superficie de forma fiable acceder a las posiciones de la matriz una vez que las dimensiones correctas se han introducido para el software de posicionamiento de la muestra. La limitación para el posicionamiento automatizado es, de hecho, la precisión de la impresión de la matriz. Para garantizar la precisión de la impresión es importante para evitar el movimiento del sustrato en la etapa de impresión ya sea mediante una succión o abrazaderas de resorte, junto con las dimensiones apropiadas de diapositivas (nota que tanto un tamaño de EE.UU. y UE portaobjetos estándar existen). ToF-SIMS es una técnica extremadamente sensible superficie que se observó ninguna contaminación en muestras. Así, máximo cuidado debe tomarsepara evitar el contacto con la superficie. Las muestras sólo deben ser manipulados, pero la superficie de interés no en contacto con, con guantes limpios (preferiblemente polietileno) y con pinzas recién limpiadas. Por lo general se lava con cloroformo y hexano. Almacenamiento de las muestras antes de las mediciones se realiza mejor en un soporte de muestras que contiene las diapositivas, aparte, por ejemplo la. 5 soporte de diapositivas o 20 soporte de diapositivas Las matrices están diseñados específicamente para ser compatible con muchos formatos de ensayos biológicos y lecturas, es decir, el sustrato utilizado es un portaobjetos de microscopio ideal para escáneres de fluorescencia y microscopios de luz. Esto significa que el formato es muy adecuado para explorar muchos materiales biológicos interacciones. Además, el formato permite a cientos de materiales que se proyectarán en paralelo. Esto permite que muchos materiales que se proyectarán más que los métodos convencionales mediante el cual es monitoreada cada nuevo material química individualmente. El mayor alcance de las interacciones biológicas materiales permitens para la elucidación de los mecanismos de las interacciones superficiales biológicas, así como encontrar el material óptimo para una aplicación dada.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / equipo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo / Número de modelo </td></tr><tr><td> Diapositivas epoxi </td><td> Genetix </td><td> K2652 </td></tr><tr><td> Póngase en contacto con impresora </td><td> BioDot </td><td> XYZ3060 Plataforma </td></tr><tr><td> Perno del metal </td><td> Arrayit </td><td> 946MP6B </td></tr><tr><td> TOF-SIMS instrumento </td><td> ION-TOF </td><td></td></tr><tr><td> XPS instrumento </td><td> Kratos </td><td></td></tr><tr><td> WCA aparato </td><td> Krüss </td><td> DSA 100 </td></tr><tr><td> AFM </td><td> Bruker </td><td> Dimension Icono </td></tr><tr><td> RPMI-1640 medio de cultivo celular </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R0883 </td></tr><tr><td> SYTO17 </td><td> Invitrogen </td><td> S-7579 </td></tr></tbody></table>

microarrays de polímeros de alto rendimiento para el descubrimiento de biomateriales

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

La mezcla es una operación unitaria que combina dos o más componentes en una mezcla homogénea. Este trabajo consiste en mezclar dos corrientes viscosas líquidas utilizando un mezclador estático en línea. El mezclador es un diseño en dos y se recombinan-que emplea flujo de cizallamiento y extensionales para aumentar el contacto interfacial entre los componentes. Un prototipo dividida y se recombinan-(SAR) mezclador se construyó mediante la alineación de una serie de finas cortadas con láser de poli (metacrilato de metilo) (PMMA) placas mantiene en su lugar en un tubo de PVC. Mezcla en este dispositivo se ilustra en la fotografía en la figura. 1. Colorante rojo se añadió a una porción del fluido de prueba y se utiliza como el componente minoritario que se mezcla con el mayor (sin teñir) componente. En la entrada de la mezcladora, la capa de inyección de líquido trazador se divide en dos capas a medida que fluye a través de la sección de mezcla. En cada sección de mezcla posterior, el número de capas horizontales se duplica. En última instancia, la única corriente de colorante se dispersa uniformemente Throughout la sección transversal del dispositivo. El uso de un fluido de prueba no newtoniano de 0,2% de Carbopol y un fluido trazador dopado de composición similar, la mezcla en la unidad se visualizaron usando imágenes por resonancia magnética (MRI). La RM es una sonda experimental muy potente de química molecular y el medio ambiente físico, así como la estructura de la muestra en las escalas de longitud de micras a centímetros. Esta sensibilidad ha dado lugar a una amplia aplicación de estas técnicas para caracterizar propiedades físicas, químicas y / o biológicas de materiales que van desde humanos a los alimentos a los medios de comunicación poroso 1, 2. El equipo y las condiciones utilizadas aquí son adecuadas para líquidos de formación de imágenes que contienen cantidades sustanciales de RMN 1 H móviles tales como agua ordinaria y líquidos orgánicos incluyendo aceites. Tradicionalmente MRI ha utilizado súper imanes conductores que no son adecuados para ambientes industriales y no portátil dentro de un laboratorio (Fig. 2). Los recientes avances in la tecnología de imanes han permitido la construcción de grandes volúmenes imanes industrialmente compatibles adecuados para flujos de proceso de imagen. Aquí, MRI proporciona espacialmente resueltas concentraciones de los componentes en diferentes posiciones axiales durante el proceso de mezcla. Este documento de trabajo en tiempo real de la mezcla de fluidos altamente viscosos vía distributiva mezcla con una aplicación para productos de cuidado personal.

Una descripción de la formación de un microarray de polímero utilizando una técnica de fotopolimerización en el chip. La caracterización rendimiento de alta superficie mediante microscopía de fuerza atómica, las mediciones de ángulo de contacto del agua, de rayos X y espectroscopía de fotoelectrones de tiempo de vuelo espectrometría de masa iónica secundaria y un ensayo de adhesión celular también se describe.

Microarrays de polímeros de alto rendimiento para el descubrimiento de Biomateriales

El descubrimiento de nuevos biomateriales optimizados para una aplicación biológica específica se logra fácilmente mediante el uso de microarrays de polímeros, lo que permite un...

Este video describe un método para generar y utilizar una matriz micro de polímeros mediante una técnica de polimerización fotoiniciada en chip. Primero, se recubren por inmersión portaobjetos de vidrio con poli(hidroxietil metacrilato) o FEMA para producir un sustrato de baja adhesión. Se mezclan monómeros en distintas proporciones para producir una biblioteca de soluciones de monómeros.Las soluciones se transfieren a un formato de portaobjetos de vidrio mediante un dispositivo de impresión robótico y se curan con irradiación UV. El monómero se polimeriza y el disolvente se extrae al vacío. Tras la caracterización superficial de alto rendimiento, los microarreglos pueden utilizarse para ensayos de rendimiento de materiales, como los ensayos de adhesión bacteriana.El análisis de los datos de adhesión es un paso hacia el descubrimiento de nuevos biomateriales, destacando la utilidad del formato de microarreglo de polímeros. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, en los que se investiga la respuesta biológica de diferentes materiales uno por uno, es la posibilidad de realizar el cribado paralelo de cientos de materiales, que pueden manipularse fácilmente en un solo portaobjetos. Esta técnica puede adaptarse fácilmente a diversos ensayos biológicos, como el cribado de materiales que resisten la adhesión bacteriana o que favorecen la expansión de células madre.Esta técnica ha ayudado a descubrir materiales con aplicaciones potenciales para favorecer la expansión de células madre polipotentes en medicina regenerativa. También estamos muy entusiasmados con el reciente descubrimiento de materiales que resisten la adhesión bacteriana y que podrían reducir la incidencia de infecciones asociadas a dispositivos médicos. En general, los usuarios nuevos en este método tendrán dificultades para optimizar las condiciones necesarias para imprimir un microarreglo, ya que es difícil predecir las condiciones óptimas.Cometer errores incluso en pequeños detalles puede dar lugar a matrices no utilizables. También es esencial considerar la cepa bacteriana y las condiciones de cultivo que se utilizarán, ya que la adhesión y la morfología del biofilm dependen de la especie y del medio, y por lo tanto pueden variar considerablemente. Aquí utilizamos aerogen como organismo modelo y un medio químicamente definido para un ensayo de adhesión bien controlado.Nuestros colaboradores del MIT tuvieron por primera vez la idea de este método mediante la comparación con microarreglos de ADN y proteínas. Estos son métodos bien establecidos para explorar sus respectivos espacios combinatorios biológicos. Dan y Bob se dieron cuenta de que existía un espacio combinatorio químico similar que necesitaba ser explorado a partir de materiales, demostrando un procedimiento que será llevado a cabo por Andrew Hook y Chen Chang, investigadores posdoctorales en nuestro proyecto financiado por la Welcome Trust. Comience este procedimiento preparando un fondo de baja adhesión.Esta es una superficie que resiste la unión de biomoléculas, como proteínas y células. Pese dos gramos de poli hidroxietil metacrilato o FEMA en un tubo centrífugo de 50 mililitros. Luego, aforé el volumen hasta 50 mililitros con etanol al 95% en agua.Luego, coloque el tubo en un agitador durante aproximadamente 24 horas o hasta que el FEMA se haya disuelto completamente, sosteniendo el vidrio luminoso con pinzas. Sumerja en vidrio funcional epoxi. Introduzca en la solución de FEMA para recubrir todo excepto cinco milímetros de él.Los grupos epoxi forman enlaces covalentes con el recubrimiento de FEMA. La porción sin recubrir puede servir como control positivo durante un período de un segundo. Retire el portaobjetos de la solución de FEMA, luego invierta el portaobjetos y colóquelo en una posición casi horizontal para que se seque.Una vez que la lámina esté seca, colóquela en un portaobjetos. Deje las láminas recubiertas con FEMA en condiciones atmosféricas durante una semana para permitir la evaporación completa del disolvente. A continuación, para preparar las soluciones de monómero, pipetee cinco microlitros de solución de iniciador fotoquímico y 15 microlitros de monómeros de acrilato y metacrilato solubles en dimetilformamida en una placa fuente de 384 pocillos.Un volumen total de 20 microlitros es ideal para la formación de manchas. Una vez que se han preparado las soluciones, se utiliza un robot de impresión por contacto con una plataforma X, Y, Z para generar el microarreglo. El robot emplea puntas ranuradas de 220 micrómetros de diámetro que contienen ranuras que funcionan como depósitos para la transferencia de solución.Comience colocando los alfileres y el soporte de alfileres en un recipiente que contiene diclorometano durante 10 minutos. Luego, después de permitir que los alfileres se sequen, vuelva a colocar el soporte en la cabeza de impresión. A continuación, cargue los alfileres en el soporte.Luego cargue 10 portaobjetos de vidrio para blotting y portaobjetos recubiertos con FEMA en el robot. Normalmente, se imprimen tres matrices por cada portaobjeto. A continuación, utilizando tubos, conecte la estación de lavado del robot a una botella que contenga 2,5 litros de dimetilformamida fresca.Cargue la placa que contiene la solución de monómero en el robot. Llene completamente la cámara del robot con Argón para reducir el nivel de oxígeno por debajo de 2000 PPM. A este nivel bajo, los radicales de polimerización no deberían ser apagados por el oxígeno.Mediante un dispositivo regulador de humedad, establezca la humedad para que se mantenga entre 30 y 40 % dentro de la cámara del robot; incluir humedad permite que el FEMA se hinche, lo que facilita que el polímero formado se interpenetre en la capa de FEMA y quede atrapado físicamente en la superficie. Para iniciar la impresión, presione "ir" en el software del ordenador asociado. Los pasadores descenderán entonces hacia las soluciones de monómero a una velocidad de 25 milímetros por segundo.Luego, se mantendrán en solución durante 2,5 segundos y se retirarán a una velocidad de 25 milímetros por segundo. A continuación, el extremo de la aguja se pone en contacto con las laminillas FEMA, dispensando aproximadamente 2,4 nanolitros de solución desde la parte del cabezal de la aguja. El tiempo total de contacto para cada contacto es de 10 milisegundos, y la velocidad de acercamiento y retirada es de 175 milímetros por segundo.A continuación, se secan las puntas mediante contacto repetido con portaobjetos de vidrio para eliminar la solución de monómero del exterior de la punta. La secuencia de secado utilizada consiste en 33 contactos con un portaobjetos de vidrio limpio. Las primeras cuatro posiciones realizarán 10, 5, 4 y 3 contactos, respectivamente.Las siguientes cuatro posiciones formarán dos contactos, y las últimas tres posiciones formarán un contacto tras la impresión. Los pasadores se lavan en un baño de flujo de DMF con agitación durante 30 segundos. Concurrentemente, los portaobjetos impresos se irradian con una fuente de UV de onda corta de 365 nanómetros a una densidad de 30 milivoltios por centímetro cuadrado.Una vez que finaliza el lavado y la irradiación, se imprime el siguiente portaobjetos. Si la impresión parece exitosa, irradie las matrices con UV a 365 nanómetros durante 10 minutos adicionales. Las matrices recién impresas se colocan en una estufa al vacío ajustada a menos de 50 militorr durante una semana para eliminar el monómero no polimerizado y el disolvente tras la impresión y la extracción al vacío.El éxito de la polimerización de las manchas de polímero puede evaluarse mediante microscopía óptica sencilla para identificar cualquier morfología anómala de las manchas; normalmente, las manchas deben presentarse circulares y uniformes, como se muestra en esta figura a la izquierda. La causa más probable de un cambio en la geometría es una punta dañada o sucia, o un contaminante de polvo en las soluciones de monómero. Si esto ocurre, será necesario repetir el proceso para un pequeño número de combinaciones de monómeros.Pueden observarse manchas deformadas, por ejemplo, una mancha central con satélites de manchas pequeñas como se muestra a la derecha, o una forma similar a un huevo frito, donde hay una mancha central sobre una mancha más grande y plana. Esto puede deberse a una separación de fases antes de la impresión, relacionada con diferencias en la viscosidad, hidrofilicidad, volatilidad o tensión superficial de los monómeros, y sugiere que la combinación de monómeros no es compatible con este formato. La realización de mapas químicos adicionales de las manchas poliméricas también es un paso importante, y a veces necesario, de control de calidad para determinar la distribución de las químicas de los materiales a través de las manchas y del arreglo, así como la caracterización superficial de alto rendimiento o HTSC de los microarreglos generados.El uso de esta técnica también permite correlacionar el rendimiento biológico con las propiedades fisicoquímicas. Esto posibilita el estudio de la interacción de materiales biológicos. HTSC utiliza mediciones del ángulo de contacto con agua, espectrometría de masas de iones secundarios por tiempo de vuelo, microscopía de fuerza atómica y espectroscopía fotoelectrónica de rayos X.En particular, la TOF SIMS proporciona un análisis químicamente rico de la muestra que puede utilizarse para correlacionar la respuesta celular con una entidad molecular. En algunos casos, puede predecirse el comportamiento biológico. Los espectros de TOF SIMS demuestran la dependencia química de la interacción de un material biológico e informan el desarrollo de materiales de interfaz humana (HI).Una vez que se ha caracterizado la superficie del microarreglo polimérico, puede utilizarse para el estudio de interacciones biológicas. A continuación, demostramos el uso del microarreglo para realizar un ensayo de adhesión bacteriana. Comience inoculando 10 mililitros de LB con una sola colonia de Pseudomonas marcada con GFP.Los Aerogen crecen a 37 grados Celsius con agitación de 200 RPM durante la noche. Mida la DO a 600 nm del cultivo bacteriano nocturno y diluya el cultivo hasta una DO a 600 nm de 0,01 en 15 mililitros de RPMI 1640. Mientras tanto, lave las laminillas de matriz y esterilice agua destilada durante 10 minutos para eliminar cualquier componente soluble de las matrices, como monómero no polimerizado, todos los ligamentos y solvente.Luego, seque las laminillas al aire en un gabinete de flujo laminar. A continuación, coloque las laminillas del microarreglo lavadas en una placa de Petri limpia y esterilícelas con luz ultravioleta durante 10 minutos. Cuando el cultivo bacteriano esté listo, transfiera la laminilla con el microarreglo a una placa de Petri y agregue 15 mililitros del medio RPMI 1640 inoculado.Coloque otro portaobjetos con matriz en una segunda placa de Petri y agregue 15 mililitros de RPMI 1640 estéril como control. Incube las placas a 37 grados Celsius durante 72 horas con agitación a 60 RPM tras la incubación. Lave los portaobjetos tres veces con 15 mililitros de PBS estéril durante cinco minutos a 100 RPM.Luego, lave las laminillas dos veces con 15 mililitros de agua destilada estéril para eliminar la sal de fosfato. Tras el lavado, deje que las laminillas se sequen al aire en un gabinete de flujo laminar.Una vez que las láminas estén secas, deben leerse con un escáner de fluorescencia lo más pronto posible para evitar la degradación de la GFP, utilizando la tecnología y el software de imagen adecuados. La fluorescencia debida a la adhesión bacteriana se calcula restando la fluorescencia del control con medio únicamente de la muestra inoculada, con el fin de identificar materiales que resisten la adhesión bacteriana.Se generaron microarreglos y se realizaron ensayos de adhesión bacteriana según los métodos descritos en este video. Como se observa aquí, el microarreglo de polímeros contiene materiales con baja adhesión bacteriana, que presentan baja fluorescencia, y con alta adhesión bacteriana, que presentan alta fluorescencia. Los tres arreglos mostrados aquí son réplicas; cuando se promedian los valores de fluorescencia de las tres réplicas, se presentan como una representación tridimensional.Como se muestra aquí, la interpretación visual cuantitativa se simplifica. La escala de intensidad a la derecha representa los valores de los datos de fluorescencia. A un nivel básico, la identificación de materiales con baja fluorescencia proporciona un medio para identificar rápidamente materiales que cumplen una aplicación biológica específica, como la resistencia a la adhesión bacteriana.Sin embargo, estos resultados también se pueden combinar con el HTSC para investigar las correlaciones entre propiedades específicas de los materiales y su rendimiento biológico. Este análisis puede esclarecer las relaciones entre estructura y función, identificando así los mecanismos que sustentan la interacción biológica con los materiales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo prepararse para imprimir una matriz micro de polímeros y también tener una idea clara de la manera en que las matrices micro de polímeros pueden utilizarse para estudiar la respuesta bacteriana a los materiales.Una vez dominado, un microarreglo de polímero puede imprimirse en dos días si se realiza correctamente. La preparación de los monómeros lleva aproximadamente un día y la impresión del arreglo toma alrededor de seis horas. El ensayo de adhesión bacteriana requiere cinco días, lo que aumenta el tiempo necesario para cultivar la cultura sobrepuesta como un inóculo. Incubando la micromatriz en la cultura bacteriana durante 72 horas y detectando la señal mediante un escáner de micromatrices, bien. Al realizar este procedimiento, es importante mantener limpios el pin y los soportes del pin.Es muy frustrante si, a mitad de un ensayo, el pin queda atascado en posición vertical y ya no puede hacer contacto con la superficie porque el pin o el soporte del pin no se limpiaron adecuadamente. No olvide que trabajar con DMF y monómeros tóxicos puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben incluir precauciones como la extracción en el procedimiento.

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Bioingeniería

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Perfil de polímeros de microarrays (MAPP) para análisis de glicanos de alto rendimiento

Aprende a generar microarrays de polímeros mediante fotopolimerización en chip para evaluar biomateriales. Este método permite el cribado de materiales resistentes a la adherencia bacteriana y su aplicación en medicina regenerativa.

Microarrays de polímeros de alto rendimiento para el descubrimiento de Biomateriales

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