MAME Modelos de 4D Live de células de imagen de un tumor: Interacciones microambiente que la progresión maligna del impacto

El objetivo general de este procedimiento es construir modelos de cultivo tridimensional en co-cultivo denominados ingeniería de arquitectura y microentorno mamarios, o MAM, para su uso en imágenes de células vivas de interacciones entre células en tiempo real. Esto se logra primero recubriendo laminillas con colágeno tipo uno DQ, o colágeno tipo uno inhibido por D, y matriz de colágeno tipo uno.

A continuación, colágeno DQ inactivo. Cuatro. Se añade matriz de membrana basal reconstituida encima del colágeno DQ solidificado, matriz de colágeno uno con fibroblastos embebidos. En el tercer paso, se dispone una suspensión de células epiteliales o tumorales encima de las cubetas, permitiendo que las células se adhieran al colágeno DQ, matriz de membrana basal reconstituida cuatro, y luego se añade medio.

Finalmente, se utiliza microscopía confocal para realizar imágenes en cuatro dimensiones (4D), que analiza una imagen en tres dimensiones espaciales más el tiempo en cultivos mixtos vivos de mama. En definitiva, la imagen 4D permite la visualización y el análisis de la interacción dinámica entre células tumorales de mama y otras células del microambiente tumoral que podrían influir en la progresión hacia un fenotipo invasivo. Una ventaja importante de esta técnica frente a métodos existentes como la imagenología intravital es que las interacciones observadas en nuestro modelo ocurren entre células de una misma especie, es decir, células tumorales humanas y células asociadas al tumor humanas, en lugar de, por ejemplo, entre células tumorales humanas y células estromales de ratón.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque es necesario visualizar primero los cultivos principales y luego se requieren habilidades moderadas y práctica para lograr el éxito. Comience colocando una cubierta rectangular de plástico esterilizada con alcohol. Introdúzcala en una placa de cultivo de 35 milímetros o utilice una placa IBI, placa mu de 35 milímetros.

Luego, mezcle el número deseado de fibroblastos con colágeno DQ. A continuación, utilizando una micropipeta de 100 microlitros, pipetee y extienda cuidadosamente 70 microlitros de la matriz de colágeno DQ con fibroblastos sobre toda la superficie del cubreobjetos y coloque la placa de cultivo en un incubador húmedo a 37 grados Celsius sin dióxido de carbono durante 30 minutos. Una vez que las matrices hayan solidificado, déjelas equilibrar durante 10 minutos en un incubador a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.

Luego, coloque la placa bajo una campana hasta que alcance la temperatura ambiente. Añada 60 microlitros de colágeno DQ, cuatro matriz de membrana basal reconstituida encima del colágeno DQ solidificado, uno, matriz de colágeno uno con fibroblastos incrustados. A continuación, utilizando la punta de una pipeta, extienda cuidadosamente la matriz de membrana basal reconstituida cuatro, colágeno DQ de manera uniforme, evitando rayar los fibroblastos en la matriz de colágeno DQ uno, colágeno uno.

Luego, transfiera el recipiente y la cubreobjetos al incubador a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 10 minutos, mientras la matriz de membrana basal reconstituida de colágeno DQ se solidifica. Al mismo tiempo, trate con tripsina las células y cuéntelas para el cultivo conjunto. Ahora, coloque 50 microlitros de la suspensión celular sobre la cubreobjetos recubierta y coloque el recipiente en un incubador a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 40 a 60 minutos para permitir que las células se adhieran al colágeno DQ. Cuatro, después de que las células se hayan adherido a la matriz, reconstituya una matriz de membrana basal y agregue dos mililitros de medio de cultivo que contenga 2% de matriz de membrana basal reconstituida al recipiente de 35 milímetros.

A continuación, incubar durante el periodo de tiempo deseado antes de la adquisición de imágenes tras lavar con PBS. Incubar las cultivos co-cultivos con rastreador de células naranja a cinco micromolar en medio MEGM en un incubador a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 45 minutos. Tras la incubación, lavar nuevamente los co-cultivos con PBS e incubarlos con medio MEGM previamente calentado durante 30 minutos en un incubador a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. Adquirir imágenes de los co-cultivos vivos con baja magnificación. Por ejemplo, a 10 x con un objetivo de inmersión en agua en un microscopio confocal, capturar secciones ópticas a intervalos de 10 micrones a lo largo de toda la profundidad de las estructuras.

Utilice las secciones ópticas para reconstruir las imágenes en 3D mediante software de velocidad o un programa similar. Cree películas de las reconstrucciones 3D para que se puedan visualizar las estructuras, las interacciones entre células y las interacciones con la matriz circundante. En este diagrama esquemático representativo de un cultivo dual, un plato IBI treat mu fue recubierto primero con colágeno, uno que contenía colágeno DQ y otro con fibroblastos como se observa aquí en magenta.

Luego se añadió una segunda capa de membrana basal reconstituida que contenía colágeno cuatro DQ. A continuación, se sembraron células tumorales en rojo encima y membrana basal reconstituida al 2%. En cultivo.

El medio representado por los puntos de color crema se superpuso con cada cambio de medio. Los productos fluorescentes de escisión de la colágeno DQ uno y cuatro se representan en verde. Durante los 23 días de este cultivo conjunto representativo de MCF 10 DCIS y WS 12 TI, hubo proliferación de las células observadas aquí y en las figuras siguientes, en rojo, así como degradación del colágeno DQ cuatro y uno observada aquí y en las figuras siguientes, en verde, y de las matrices de colágeno, indicadas por la reducción en el volumen de los cultivos conjuntos.

Las mismas culturas vivas mixtas se observaron durante los 23 días, con imágenes capturadas mediante microscopía confocal en los días tres, 16 y 23 del cultivo mixto. Las interacciones en las culturas mixtas de Mame son dinámicas y pueden cambiar con el tiempo. Por ejemplo, como se observa en este modelo 3D del cultivo mixto celular de mamíferos en el día tres, las células apenas comienzan a proliferar en las matrices en este momento, aún bastante estables, como lo demuestra la ausencia de fluorescencia verde.

Sin embargo, al día 16, mientras las células han continuado proliferando, también han comenzado a degradar la estructura de la matriz, como se observa aquí mediante los productos de escisión de colágeno DQ, uno y cuatro, en verde, y la descomposición activa de la matriz por las células, donde la matriz y las células presentan co-fluorescencia, observada en amarillo. Al día 23, casi la mitad de la matriz ha sido degradada por las células que proliferan rápidamente, en comparación con el día tres, cuando el volumen del cultivo conjunto era de 110.000 micrómetros cúbicos. Del día 16 al 23, el volumen se ha reducido a solo 46.250 micrómetros cúbicos en este día.

En la co-cultura, puede observarse la proteólisis del colágeno DQ cuatro en la superficie de las células DCIS en rojo, y la proteólisis difusa del colágeno DQ, uno en áreas cercanas a los fibroblastos en blanco. La tinción diferencial utilizada en esta co-cultura también permite observar los distintos patrones de migración y proliferación de los dos tipos celulares tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del cáncer de mama exploraran los efectos del macroentorno tumoral sobre la progresión del cáncer, mediante imágenes en vivo de las interacciones dinámicas entre las células cancerosas y las células estromáticas circundantes.