Name: Aislamiento de la cromatina mediante la purificación de ARN (chirp) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Aprende ChIRP para mapear sitios genómicos de lncRNAs con alta resolución. Este método utiliza oligonucleótidos antisentido biotinilados para identificar regiones de ADN asociadas a ARN no codificantes.

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Damos las gracias a T. Hung, MC. Tsai, O. Manor, E. Segal, M. Kuroda, Swigut T., y yo Shestopalov para los debates. Con el apoyo de la Agencia de Ciencia, Tecnología e Investigación de Singapur (CC), el NIH R01-R01 CA118750 y HG004361-(HYC), y California Instituto de Medicina Regenerativa (HYC). HYC es un científico de Carrera Temprana del Instituto Médico Howard Hughes.

1. Sonda de Diseño Diseño anti-sentido ADN embaldosado sondas para la recuperación selectiva del ARN diana por Chirp. <ol><li> Diseño anti-sentido sondas de oligonucleótidos mediante el diseñador de la sonda en línea en <a href="http://singlemoleculefish.com">singlemoleculefish.com</a> 18. </li><li> Utilice los siguientes parámetros: número de sondas = 1 sonda / 100 pb de longitud ARN, 2) el objetivo% GC = 45, 3) longitud del oligonucleótido = 20, 4) de longitud Espacio = 60-80. Romper el ARN en segmentos, si es demasiado larga para el diseñador. Omitir las regiones de repeticiones o extensa homología. </li><li> Orden anti-sentido sondas de ADN con BiotinTEG a las 3 de alto riesgo extremo. </li><li> Sondas de etiqueta de acuerdo con sus posiciones a lo largo del ARN. Separarlos en dos grupos para que el &quot;par&quot; de piscina contiene todas las sondas de numeración 2, 4, 6, etc, y el &quot;extraño&quot; de piscina contiene sondas de numeración 1, 3, 5, etc Diluir grupo de sondas a la concentración mM 100 y almacenar a -20 ° C. </li><li> Todos los experimentos se realizaron utilizandoambos grupos, que sirven como controles internos para los demás. Real RNA-dependiente de la señal estará presente en las dos piscinas, mientras que la sonda específicos de ruidos será único para cada piscina. Esto se aplica tanto para CHIRP-qPCR y CHIRP ss. </li></ol> 2. Las células de la cosecha Recoger las células que serán usadas en el experimento CHIRP. <ol><li> Se cultivan las células en placas de cultivo de tejidos o frascos a la confluencia. Enjuague con tampón fosfato salino (PBS) de una vez trypsinize. Apaga la tripsina con un volumen de&gt; 2 veces los medios de comunicación, la pipeta hacia arriba y abajo para separar las células y resuspender en suspensión de células individuales. Transfiera todos los medios de comunicación y las células resuspendidas en 50 ml tubos Falcon. 20 millones de células son normalmente suficientes para una muestra Chirp. </li><li> Derivado células en 800RCF durante 4 min. Aspirar y medios Resuspender las células en 40 millones de 40 ml de PBS, se combinan los tubos si es necesario. Derivado células en 800RCF durante 4 min. Decantar PBS, cuidadosamente aspirar en un ángulo del líquido restante. </li></ol&gt; 3. Enlace de la Cruz-Las células y recoger sedimento celular Crosslink recogen las células con glutaraldehído para preservar la cromatina-ARN interacciones y preparar sedimento celular. <ol><li> Siga todos los pasos a temperatura ambiente. </li><li> Preparar 1% de glutaraldehído en PBS temperatura ambiente. Preparar 10 ml por 10 millones de células (0,4 ml de 25% de valores glutaraldehído + 9,6 ml de PBS). El glutaraldehído debe ser utilizado fresco. </li><li> Toque en la parte inferior de los tubos Falcon para desalojar gránulos. Resuspender pellet de células en 1% de glutaraldehído, comenzando con un pequeño volumen para evitar trozos, luego arriba hasta el volumen completo. Invertir para mezclar. Crosslink durante 10 minutos a temperatura ambiente en un agitador de extremo a extremo o rotador. </li><li> Sofocar la reacción de reticulación con el volumen 1/10o de 1,25 M de glicina a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Girar a 2000RCF durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y el precipitado lavado con 20 ml de PBS enfriado una vez, girando a 2000RCF durante 5 min. </li><li> Aspirar y resuspender el wincinera, reticulado precipitado con 1 ml de PBS enfriado por 20 millones de células. Transfiera cada ml a un tubo Eppendorf y giran a 2000RCF durante 3 min a 4 ° C. Quite la mayor cantidad posible con PBS punta de la pipeta con cuidado. </li><li> Flash congelar los gránulos de las células en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C indefinidamente. </li></ol> 4. Lisis de la célula Lisar células reticuladas para preparar lisado celular. <ol><li> Descongele gránulos congelados de células a temperatura ambiente. Toque duro para desalojar y mezclar el sedimento celular. Girar por la pastilla en el 2000RCF durante 3 min a 4 ° C. Utiliza la esquina 10 l punta de la pipeta para eliminar cualquier resto de PBS. </li><li> En una balanza electrónica (precisión de 1 mg) de tara la masa de un vacío tubo Eppendorf (los tubos pesan 1.060 gramos forma muy consistente). Pese cada pastilla y registrar su peso. Un total de 15 cm plato de células HeLa reticulados normalmente pesa 100 mg. </li><li> Suplemento tampón de lisis (10 veces la masa de sedimento, por ejemplo, 1 ml de 100 mg) con Fresh inhibidor de la proteasa, PMSF y SUPERase en (véase la lista adjunta de búfer). Mezclar bien. </li><li> Añadir un volumen 10 veces complementado tampón de lisis a cada tubo y resuspender el precipitado. Para pequeños gránulos &lt;25 mg, resuspender en 250 l de amortiguación complementado lisis. La suspensión debe ser lisa. Si no es así, dividir la suspensión en 500 ml de alícuotas y utilizar un motor mezclador de pellets para disgregar los grumos. Proceder de inmediato a tratamiento con ultrasonidos. </li></ol> 5. Sonicación ADN cizallamiento por sonicación reticuladas lisados ​​celulares. <ol><li> Someter a ultrasonidos lisado celular en Bioruptor en 15 ml tubos Falcon. Utilice &lt;1,5 ml de lisado en cada tubo, y para acelerar la sonicación, sonicar no más de dos tubos a la vez. </li><li> Someter a ultrasonidos en un baño de agua a 4 ° C en la posición más alta con 30 segundos en ON, OFF 45 segundos intervalos de pulso. Compruebe lisado cada 30 minutos. Continuar sonicando hasta que el lisado de células ya no se turbia. Esto puede tomar tan poco como 30 minutos y horas hasta 4. El númerode los tubos, el volumen de la muestra, la temperatura del baño, y el período de tiempo de sonicación afectará cuánto tiempo toma el proceso. Tubos probablemente sonicar a un ritmo diferente, así que la piscina juntos cada 30 minutos y redistribuir en los tubos originales para asegurar la homogeneidad. Nota: glutaraldehído reticulado células toman mucho más tiempo para sonicar que los equivalentes de formaldehído. </li><li> Al lisado se vuelve clara, transferir 5 l lisado a un tubo Eppendorf. Añadir 90 l de ADN de la proteasa K (PK) Buffer (véase la lista de amortiguación) y 5 PK l. Vortex para mezclar y centrifugar brevemente. Incubar durante 45 min a 50 ° C. </li><li> Extraer el ADN con el kit de Qiagen purificación de PCR. ADN se eluye en 30 l del buffer de elución Qiagen (EB) y comprobar el tamaño del ADN, el 1% en gel de agarosa. Si el frotis grueso de ADN es 100-500 pb, sonicación es completa. Si no es así, continúe con ultrasonidos. </li><li> Centrifugar las muestras de ultrasonidos a 16100RCF durante 10 min a 4 ° C. Combine sobrenadantes, alícuotas en muestras de 1 ml y flash de congelación en nitroge líquidon. Conservar a -80 º C. </li></ol> 6. CHIRP Hibridar sondas biotiniladas de ADN a ARN y aislar la cromatina enlazado. <ol><li> Descongele los tubos de la cromatina a temperatura ambiente. </li><li> Prepare el tampón de hibridación (véase la lista de buffers, preparar 2 ml por cada ml de la cromatina). Vortex para mezclar. </li><li> Para una muestra típica CHIRP utilizando 1 ml de lisado, quitar 10 l para INPUT ARN y 10 l de entrada de ADN y el lugar en tubos Eppendorf. Mantener en hielo hasta su uso posterior. </li><li> Transferir 1 ml de la cromatina a 15 ml tubo Falcon. Añadir 2 ml tampón de hibridación a cada tubo. Por volumen total &lt;1,5 ml, utilice tubos Eppendorf. </li><li> Descongele sondas a temperatura ambiente. NanoDrop sondas para comprobar la cantidad si no lo ha usado en mucho tiempo (100 uM sondas deberían especificaciones ~ 500-600 ng / l usando el ajuste de una sola cadena de ADN). Añadir un volumen adecuado de sondas específicas para tubos (100 pmol por sonda 1 ml de la cromatina, 1 l de 100 pmol / l sonda por 1 ml de la cromatina).Mezclar bien. Incubar a 37 ° C durante 4 horas con agitación. </li><li> Con 20 minutos restantes para la hibridación, preparar las perlas magnéticas C-1 (almacenado a 4 ° C). Utilizar 100 l por 100 pmol de las sondas. Lavar con 1 ml de tampón de lisis sin suplementos tres veces, usando la cinta magnética Dynamag-2 a cuentas separadas de búfer. </li><li> Resuspender las perlas en el volumen original de tampón de lisis, y Suplemento con fresco PMSF, PI y SUPERase en-. Después de 4 h reacción de hibridación es completa, añadir 100 l perlas a cada tubo. Mezclar bien. Incubar a 37 ° C durante 30 min con agitación. </li><li> Preparar el tampón de lavado (5 ml por muestra). Vortex para mezclar. Pre-caliente a 37 ° C. Añadir PMSF antes de su uso. </li><li> Lávese las cuentas con 1 ml de solución de lavado cinco veces. En el primer lavado, utilizar Dynamag-15 banda magnética a perlas separadas, decantación y se resuspenden en 1 ml de tampón de lavado. Transferir el volumen a 1,5 ml tubo Eppendorf. Incubar a 37 ° C con agitación durante 5 min. </li><li> En lavados posteriores, la desaceleración de cada tubo en un minicentrifuge, Ajuste de la muestra en Dynamag-2 banda magnética durante 1 min. Se decanta la muestra, limpie cualquier derrame con un Kimwipe, resuspender en 1 ml de solución de lavado. Incubar a 37 ° C con agitación durante 5 min. Repetir durante cinco lavados totales. </li><li> En el último lavado, resuspender las cuentas bien. Sacar 100 l, y reservado para el aislamiento de ARN. Reserva de 900 l para la fracción de ADN. Coloque todos los tubos de Dynamag-2 la banda magnética y quitar el tampón de lavado. Girar todos los tubos durante un breve instante, colocarlos en cinta magnética. Eliminar el último bit de buffer de lavado completamente con una fuerte punta de la pipeta 10 l. </li></ol> 7. Aislamiento del ARN Extracto de la fracción de ARN de las muestras de un pitido para cuantificar de QRT-PCR. <ol><li> Tomar muestras de 100 l de talón y 10 l de muestra ENTRADA ARN. Añadir 85 l de ARN PK buffer de pH 7,0 a ARN de entrada. Volver a suspender las bolas en 95 l de pH 7,0 ARN PK búfer. Añadir 5 K Proteinease l e incubar a 50 ° C durante 45 min con agitación de extremo a extremo. </li><li> En pocas palabras de girar todos los tubos yhervir las muestras durante 10 minutos en el bloque de calor a 95 ° C. </li><li> Enfriar en hielo, añadir 500 l TRIzol vórtice, vigorosamente durante 10 segundos. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Conservar a -80 ° C o vaya al paso 4. </li><li> Añadir 100 l de cloroformo TRIzol muestras tratadas. Vortex vigorosamente durante 10 segundos. Girar a 16100RCF en una centrífuga de mesa durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Retire ~ 400 l sobrenadante acuoso, evitando orgánica y la interfaz. </li><li> Añadir 600 l (1,5 volúmenes) 100% de etanol y mezclar bien. Haga girar la muestra a través MIRNeasy mini columnas. Lavar 1x con TAR (MIRNeasy mini kit), 2x con RPE de acuerdo al protocolo del fabricante. Eluir con 30 l de nucleasa libre de H 2 O (HNF 2 O). </li><li> Tratar el eluato de ARN con ADN libre por el protocolo del fabricante. Después de la reacción es completa, calentar la muestra durante 15 minutos a 65 ° C para inactivar completamente cualquier resto de DNasa. </li><li> Utilice 1 l de ARN aislado por pocillo de QRT-PCR análisis para confirmar lncRNArecuperación. GAPDH se utiliza a menudo como un control negativo. </li></ol> 8. El aislamiento del ADN Extracto de la fracción de ADN de muestras de un pitido para identificar o cuantificar mediante secuenciación por PCR cuantitativa. <ol><li> Prepare el tampón de elución del ADN (ver lista de buffers), 150 l por ejemplo, incluyendo la entrada de ADN. </li><li> Añadir 1 0μL RNasa A (10 mg / ml) y 10 l RNasa H (10 U / l) por ml de tampón de elución del ADN, y vórtice para mezclar. </li><li> Resuspender cada muestra de las perlas en 150 l de tampón de elución con ADN RNasas. (ENTRADA Resuspender el ADN en 140 l) Se incuba a 37 ° C durante 30 min con agitación. </li><li> Cuentas separadas y el sobrenadante de Dynamag-2 la banda magnética. Eliminar el sobrenadante y añadir a los tubos etiquetados. </li><li> Preparar una segunda alícuota de tampón de elución de ADN con 10 l de ribonucleasa A (10 mg / ml) y RNasaH (10 U / l) exactamente como se hace en 8,2). Añadir 150 l de cada muestra (incluida la entrada de ADN), se incuba, y eliminar el sobrenadante. Recoge todas sobrenadante (hombrod es ~ 300 l). </li><li> Añadir 15 PK l de cada muestra. Incubar a 50 ° C durante 45 min con agitación. </li><li> Pre-spin hacia abajo de color amarillo fase de bloqueo de tubos de gel (5PRIME). Transferir las muestras de ADN a los tubos de gel de enganche de fase, y añadir 300 l PhOH: cloroformo: isoamílico por muestra. Agitar enérgicamente durante 10 minutos, y de girar en una centrífuga de mesa a 16100RCF durante 5 min a 4 ° C. Tome acuoso de la parte superior (~ 300 l). Añadir 3 GlycoBlue l, 30 l de NaOAc y 900 l de EtOH 100%. Mezclar bien y guardar a -20 ° C durante la noche. </li><li> Haga girar las muestras a 16100RCF durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Decantar el sobrenadante con cuidado. Añadir 1 ml de EtOH 70% y agitar para mezclar. Girar a 16100RCF durante 5 min. Eliminar sobrenadante con una pipeta. Deje secar al aire durante 1 min. Resuspender en 30 l EB. </li><li> Las muestras de ADN están listos para el análisis de qPCR o la preparación de las bibliotecas de secuenciación de alto rendimiento por el protocolo de Illumina. </li></ol> 10. Los resultados representativos Figura 1 </strong&gt; representa el flujo de trabajo CHIRP. Un experimento CHIRP éxito típicamente enriquece ARN diana significativamente más ARNs no específicos. Figura 2 muestra el enriquecimiento de la telomerasa humana ARN (TERC) a partir de células HeLa por GAPDH, un ARN abundantes celulares que sirve como un control negativo. La mayoría de los ARNs TERC (~ 88%) presentes en la célula se empujado hacia abajo por la realización de chirrido, mientras que sólo el 0,46% de GAPDH RNA fue recuperada, demostrando un factor de enriquecimiento de ~ 200 veces. Las sondas no específicas, tales como sondas dirigidas LacZ ARN, que no se expresa en células de mamíferos (Figura 2), se puede utilizar como controles negativos adicionales. Regiones de ADN esperados de obligar a la lncRNA objetivo son típicamente enriquecida sobre regiones negativos cuando se mide por qPCR. Figura 3 muestra la validación qPCR de cuatro AIRE CALIENTE enlazados a sitios en fibroblastos primarios de prepucio humano que determina realizando CHIRP-ss en la misma línea celular, mientras que TERC y GAPDH ADN sitios sírve como regiones de control negativo. Tanto el &quot;par&quot; y la sonda &quot;raro&quot;, establece el enriquecimiento producido comparable de plazos previstos AIRE CALIENTE-sitios a través de las regiones negativas, un sello distintivo de los verdaderos lncRNA sitios de unión. De alto rendimiento de secuenciación de ADN CHIRP enriquecido se obtiene un mapa global de los sitios de unión lncRNA. La Drosophila lncRNA roX2 se sabe que interactúan con el cromosoma X en una forma que se requiere para la compensación de la dosis. La Figura 4 muestra roX2 perfil de unión sobre una sección del cromosoma X. Tanto &quot;incluso&quot; y &quot;extraño&quot; las muestras han sido secuenciados y sus únicos ruidos han sido eliminados para producir un registro de las señales superpuestas. Cada &quot;pico&quot; aquí indica un sitio fuerte de roX2 vinculante. La pista completa y la lista de roX2 genes diana se han descrito en Chu et al. 2011 17. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama de flujo del procedimiento CHIRPDuré. La cromatina se entrecruza con lncRNA: aductos de proteínas in vivo Biotinylated sondas suelo de baldosas se hibridan para apuntar lncRNA, y los complejos de la cromatina se purifica mediante perlas magnéticas estreptavidina, seguido de lavados rigurosos.. Nos eluir el ADN o las proteínas lncRNA unido con un cóctel de RNasa A y H. se esquematiza una supuesta secuencia de lncRNA vinculante en color naranja. Anteriormente publicado en Chu et al. 2011. 17 <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig2.jpg" /> Figura 2. CHIRP enriquece de ARN humano TERC. TERC-asDNA sondas recuperar ~ 88% de los celulares TERC RNA no detectable y GAPDH. LacZ asDNA sondas se utilizaron como controles negativos y recuperar ni ARN. La media ± desviación estándar se muestran. Anteriormente publicado en Chu et al. 2011. 17 <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig3.jpg" /> Figura 3. AIRE CALIENTE CHIRP-qPCR en humanos primariafibroblastos Eskin. NFKBIA, HOXD3 4, SERINC5 y ABCA2 son las regiones que interactúan con AIRE CALIENTE. TERC y GAPDH sirvieron como controles negativos. La media ± desviación estándar se muestran. Anteriormente publicado en Chu et al. 2011. 17 <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig4.jpg" /> Figura 4. CHIRP-ss datos de roX2 ARN en células de Drosophila SL2. &quot;Aún&quot; y &quot;extraño&quot; fueron secuenciados por separado, sus datos se unen para reflejar sólo los picos comunes en ambos. La pista fusionada se muestra. Anteriormente publicado en Chu et al. 2011. 17

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C. Chu y Chang HY se nombran como inventores en una solicitud de patente basada en este método.

Aquí se describe CHIRP-ss, un método de asignación en vivo sitios lncRNA vinculantes en todo el genoma. Los parámetros clave para el éxito son las piscinas abiertas de mosaico sondas de oligonucleótidos y el entrecruzamiento glutaraldehído. El diseño de las sondas de afinidad es sencillo dada la secuencia de ARN y no requiere conocimiento previo de la estructura del ARN o dominios funcionales. Nuestro éxito con roX2, TERC, y AIRE CALIENTE - tres ARN en lugar de dos especies diferentes - sugiere que CHIRP-ss es probable generalizable a muchos lncRNAs. Al igual que con todos los experimentos, los controles de asistencia y adecuada están obligados a interpretar los resultados. LncRNA diferentes pueden requerir un ajuste de las condiciones, y el cambio razonable de condiciones, como la selección de sondas de afinidad o reticulantes diferentes, puede poner de relieve diferentes aspectos de las interacciones ARN-cromatina. Al igual que el chip-ss, no todos los eventos son necesariamente vinculantes funcional, y se requieren estudios adicionales para determinar las consecuencias biológicas de ARN occupancy en la cromatina. No obstante, prevemos muchas aplicaciones interesantes de esta tecnología para los investigadores de otras asociadas a la cromatina lncRNAs, que ahora se cuentan por miles 8,9. Así como chip-ss ha abierto la puerta a todo el genoma de la exploración de las interacciones proteína-ADN, chirrido-ss estudios de la &quot;interactoma ARN&quot; puede revelar muchas nuevas vías de la biología.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Lista de buffers:</td></tr><tr><td colspan="4">Disuelva un gránulo de inhibidor completo de proteasas en 1 ml de agua como solución stock 50x. Prepare PMSF 100 mM en isopropanol (solución stock 100x). Superase-in se utiliza como solución stock 200x. Almacene todo a -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Buffer de lisis:</td></tr><tr><td colspan="4">50 mM Tris-Cl pH 7.0&lt;br/&gt;10 mM EDTA&lt;br/&gt;1% SDS&lt;br/&gt;Añada siempre PMSF, inhibidor de proteasas (P.I.) y Superase-in recién preparados antes de usar, excepto al lavar las perlas</td></tr><tr><td colspan="4">Buffer de Proteinasa K (para ADN)</td></tr><tr><td colspan="4">100 mM NaCl&lt;br/&gt;10 mM Tris-Cl pH 8.0 (para ARN, use pH 7.0)&lt;br/&gt;1 mM EDTA&lt;br/&gt;0.5% SDS&lt;br/&gt;Añada 5% en volumen de proteinasa K (Ambion AM2546 20 mg/ml) recién preparado antes de usar</td></tr><tr><td colspan="4">Buffer de hibridación</td></tr><tr><td colspan="4">750 mM NaCl&lt;br/&gt;1% SDS&lt;br/&gt;50 mM Tris-Cl pH 7.0&lt;br/&gt;1 mM EDTA&lt;br/&gt;15% formamida (almacene en la oscuridad a 4 &amp;deg;C)&lt;br/&gt;Añada siempre PMSF, P.I. y Superase-in recién preparados antes de usar</td></tr><tr><td colspan="4">Buffer de lavado</td></tr><tr><td colspan="4">2x cloruro sódico y citrato sódico (SSC) (diluido a partir del stock 20x SSC de Invitrogen)&lt;br/&gt;0.5% SDS&lt;br/&gt;Añada siempre PMSF recién preparado antes de usar</td></tr><tr><td colspan="4">Buffer de elución de ADN</td></tr><tr><td colspan="4">50 mM NaHCO3&lt;br/&gt;1% SDS</td></tr><tr><td colspan="4">Tabla de reactivos y equipos específicos:</td></tr><tr><td>Glutaraldehído (grado EM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882-10x10ml</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador motorizado de tubos</td><td>VWR international</td><td>V8185-904</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de proteasas</td><td>Roche Group</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Superase-in</td><td>Ambion</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ambion.com/catalog/CatNum.php?AM2696">AM2696&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Biorruptor</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Falcon (para sonicación)</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificación de PCR</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Perlas magnéticas C-1</td><td>Invitrogen</td><td>65002</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-25G</td><td></td></tr><tr><td>Imán DynaMag-15</td><td>Invitrogen</td><td>123-01D</td><td></td></tr><tr><td>Imán DynaMag-2</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>Kit MIRNeasy mini</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Rnasa H</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>R0601K</td><td></td></tr><tr><td>Rnasa A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Gel de bloqueo de fase pesado</td><td>5 PRIME</td><td>2302810</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:cloroformo:isoamilo</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Ricca</td><td>RSOC0020-1C</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>JT Baker</td><td>4057-06</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Buffer de elución (EB)</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Invitrogen</td><td>15557-036</td><td></td></tr><tr><td>SDS al 10%</td><td>Invitrogen</td><td>15553-027</td><td></td></tr><tr><td>ADN-&lt;em&gt;libre&lt;/em&gt;</td><td>Ambion</td><td>AM1906</td><td></td></tr><tr><td>Kit de buffers</td><td>Ambion</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Invitrogen</td><td>15515-026</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de la cromatina mediante la purificación de arn (chirp)

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

RNAs no codificantes largos son los principales reguladores de los estados de la cromatina de importantes procesos biológicos como la compensación de la dosis, la impresión y la expresión de genes en el desarrollo 1,2,3,4,5,6,7. El reciente descubrimiento de miles de lncRNAs en asociación con determinados complejos de la cromatina modificación, tales como el complejo Polycomb represiva 2 (PRC2) que media la histona H3 lisina 27 trimethylation (H3K27me3), sugiere que las funciones generales de lncRNAs numerosos estados en la gestión de la cromatina en un gen específico 8,9 de la moda. Mientras que algunos lncRNAs se cree que actúa en cis de los genes vecinos, lncRNAs otros trabajan en trans para regular los genes yacimiento lejano. Por ejemplo, Drosophila lncRNAs roX1 roX2 y regiones se unen numerosos en el cromosoma X de las células masculinas, y son fundamentales para la compensación de la dosis 10,11. Sin embargo, la ubicación exacta de sus sitios de unión no se conocen en alta resolución. Del mismo modo, humana lncRNA AIRE CALIENTE puede afectar a la ocupación de PRC2 hientos de los genes en todo el genoma 3,12,13, pero ¿cómo se logra la especificidad no está claro. LncRNAs también puede servir como andamios modulares para contratar el montaje de complejos de proteínas múltiples. El clásico de acción trans ARN andamio es el TERC ARN que sirve como la plantilla y andamio para la telomerasa complejo 14; AIRE CALIENTE también puede servir como un andamio para PRC2 y un desmetilasa H3K4 complejo 13. Los estudios previos de cartografía de ocupación del ARN en la cromatina han revelado una sólida perspectiva de 15,16, pero sólo en un lugar único gen a la vez. Los sitios de ocupación de la mayoría de lncRNAs no se conocen, y las funciones de regulación de la cromatina en lncRNAs han sido en su mayoría infiere de los efectos indirectos de la perturbación lncRNA. Al igual que la cromatina immunoprecipitation seguida de microarrays o la secuenciación profunda (chip-chip o chip siguientes, respectivamente) ha mejorado enormemente nuestra comprensión de las interacciones proteína-ADN en una escala genómica, aquí se ilustra una recentemente publicada estrategia para asignar tiempo de ocupación en todo el genoma ARN en alta resolución 17. Este método, Aislamiento cromatina por purificación del RNA (CHIRP) (Figura 1), se basa en la captura de afinidad de destino lncRNA: complejo cromatina por embaldosado antisentido-oligos, que luego se genera un mapa de sitios de unión genómicas a una resolución de varios cientos de bases con sensibilidad alta y baja de fondo. Chirp es aplicable a muchos lncRNAs porque el diseño de sondas de afinidad es sencillo dada la secuencia de ARN y no requiere conocimiento de la estructura del ARN o dominios funcionales.

Chirp es una técnica novedosa y rápida a los sitios de unión del Mapa del Genoma de los ARNs no codificantes de largo (lncRNAs). El método tiene la ventaja de la especificidad de los oligonucleótidos antisentido baldosas para permitir la enumeración de los sitios genómicos lncRNA enlazados.

Aislamiento de la cromatina mediante la purificación de ARN (chirp)

Los ARN largos no codificantes son reguladores clave de los estados de la cromatina en procesos biológicos importantes como la compensación de dosis, la impronta y el desarrollo...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en determinar las regiones de ADN asociadas con un ARN no codificante específico mediante QPCR o secuenciación de alto rendimiento. Esto se logra mediante la reticulación de células para atrapar in vivo las interacciones nativas entre ADN y ARN. Como segundo paso, las células se lisan y se someten a sonicación para solubilizar el lisado celular y romper la cromatina en fragmentos pequeños.A continuación, se añaden oligonucleótidos antisentido biotinilados al lisado celular con el fin de enriquecer específicamente los complejos de R-N-A-D-N-A de interés; los resultados obtenidos permiten elucidar la identidad de los sitios genómicos unidos a ARN no codificantes, basándose en QPCR o en secuenciación de alto rendimiento. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la hibridación in situ con R-N-A-D-N-A (FISH), es que chirp permite obtener mapas a nivel del genoma completo de los sitios de unión de ARN no codificantes con resoluciones cercanas al par de bases. Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave en el campo de los ARN no codificantes, como cómo las rocas, los ARN y las moscas macho logran la compensación de dosis.Las implicaciones de esta técnica abarcan el avance hacia terapias para enfermedades relacionadas con ácidos nucleicos no codificantes, ya que permite comprender mejor cómo los ARN no codificantes regulan los estados de la cromatina y la expresión génica. Para este experimento de aislamiento de cromatina mediante purificación de ARN, o ChIRP, se recolectarán 40 millones de células tras la centrifugación, se decantará el PBS y se eliminará el líquido restante aspirando cuidadosamente en un ángulo, desprendiendo el botón celular al golpear suavemente la base del tubo tipo falcon. Añada glutaraldehído al 1 % recién preparado, comenzando con un volumen pequeño y resuspendiendo el botón celular, completando luego hasta el volumen final y mezclando mediante inversión; realice la reticulación durante 10 minutos a temperatura ambiente en un agitador de extremo a extremo o rotador. Detenga la reacción de reticulación con un décimo del volumen de glicina 1,25 molar y deje en el agitador a temperatura ambiente durante cinco minutos; las células adquirirán un color naranja brillante.A continuación, centrifugue a 2000 RCF durante cinco minutos, deseche y aspire el sobrenadante y lave el sedimento con 20 mililitros de PBS frío; centrifugue nuevamente, aspire el sobrenadante y re suspenda el sedimento entrecruzado en PBS frío. Transfiera cada mililitro de células a un tubo eppendorf y centrifugue a 2000 RCF durante tres minutos a cuatro grados centígrados. Tras la centrifugación, use una punta de pipeta para eliminar cuidadosamente la mayor cantidad posible de PBS.Flash, congele inmediatamente todos los pellet celulares en nitrógeno líquido y almacénelos a menos 80 grados Celsius indefinidamente. Para preparar el lisado celular para chirp, descongele los pellet celulares congelados y entrecruzados a temperatura ambiente. Golpee fuertemente para desalojar y mezclar el pellet celular.Centrifugar los pellet y usar una punta de pipeta de 10 microlitros afilada para eliminar cualquier resto de PBS en una balanza electrónica precisa hasta un miligramo. Pesar la masa de un tubo eppendorf vacío. Pesar cada pellet y registrar su peso.Añada un volumen 10 veces mayor de tampón de lisis suplementado con inhibidor de proteasas PMSF y super ace frescos a cada tubo y resuspenda el precipitado. El lisado celular debe ser procesado inmediatamente después de su preparación. Transfiera no más de 1,5 mililitros de lisado a cada tubo cónico de 15 mililitros e inserte las sondas de sonicación atornillándolas firmemente.A continuación, coloque los tubos en un bio ruptor y sométalos a sonicación a cuatro grados Celsius en el ajuste más alto, con intervalos de pulsos de 30 segundos encendidos y 45 segundos apagados. Verifique el lisado cada 30 minutos. Continúe la sonicación hasta que el lisado celular ya no esté turbio.Esto puede tardar entre 30 minutos y cuatro horas, dependiendo del número de tubos, el volumen de la muestra, la temperatura del baño y el período de tiempo de sonicación. Cuando el lisado se vuelva transparente, transfiera cinco microlitros a un tubo eppendorf nuevo. Añada tampón de proteasa K para ADN y proteasa K, vortexee para mezclar y centrifugue brevemente; incube durante 45 minutos a 50 grados Celsius tras extraer el ADN con un kit de purificación para PCR.Verifique el tamaño del ADN en un gel de agarosa al 1%. La mayor parte del espectro de ADN debe estar entre 100 y 500 pares de bases, lo que indica una sonicación completa. Centrifugue alícuotas de 1 mililitro de las muestras sonificadas a 16,100 RCF durante 10 minutos a cuatro grados Celsius, transfiera el sobrenadante a tubos eppendorf nuevos y congele rápidamente en nitrógeno líquido para comenzar el procedimiento para descongelar tubos de cromatina en temperatura ambiente para una muestra típica de chirp.Utilizando un mililitro de lisado, retire 10 microlitros para la entrada de ARN y 10 microlitros para la entrada de ADN, y colóquelos en tubos einor. Mantenga en hielo hasta nuevo uso. Transfiera un mililitro de cada muestra de cromatina a un tubo cónico de 15 mililitros.Agregue dos mililitros de tampón de hibridación a cada tubo. A continuación, descongele las sondas a temperatura ambiente. Estos oligonucleótidos biotinilados dispuestos en mosaico están etiquetados de acuerdo con sus posiciones a lo largo del ARN y separados en dos grupos.El grupo par contiene todas las sondas con números pares. Y el grupo impar contiene las sondas con números impares. Todos los experimentos se realizan utilizando ambos grupos, que sirven como controles internos el uno para el otro.Uno de los aspectos más desafiantes del protocolo verdadero es que todos los pasos de hibridación y lavado deben realizarse a 37 grados. Para garantizar una temperatura experimental constante, realice todos los pasos dentro o cerca de un horno de hibridación. Añada el volumen apropiado de sondas a tubos específicos. Mezcle bien e incube a 37 grados durante cuatro horas con agitación; 20 minutos antes de que finalice la hibridación.Prepare las perlas magnéticas C una. Utilice 100 microlitros por cada 100 pico moles de sondas. Lave tres veces con un mililitro de tampón de lisis sin suplemento utilizando el imán Dyna mag dos tiras para separar las perlas del tampón.Después del último lavado, resuspenda las perlas en el volumen original de tampón de lisis y suplemente con PMSF fresco y un inhibidor de proteasas. Cuando la reacción de hibridación de cuatro horas esté completa, agregue 100 microlitros de perlas a cada tubo y mezcle bien. Incube a 37 grados Celsius durante 30 minutos con agitación y lave las perlas con un mililitro de tampón de lavado precalentado a 37 grados Celsius en el primer lavado.Utilice una tira magnética Dyna Mag 15 para separar las perlas, deseche el sobrenadante y resuspenda en un mililitro de tampón de lavado; transfiera a un tubo EOR de 1,5 mililitros. Incube a 37 grados Celsius con agitación durante cinco minutos en los lavados subsiguientes, centrifugue brevemente cada tubo en una minicentrífuga y coloque la muestra en una tira magnética Dyna Mag 2 durante un minuto para desechar el sobrenadante. Elimine cualquier goteo con una toallita Kim y resuspenda en un mililitro.Tampon de lavado, incubar a 37 grados Celsius con agitación durante cinco minutos. Repetir para un total de cinco lavados; en el último lavado, resuspender. Suspender bien las perlas, retirar 100 microlitros y reservar para el aislamiento de ARN; reservar 900 microlitros para la fracción de ADN.Coloque todos los tubos en la tira magnética para tubos Dyna Mag y retire el tampón de lavado. Después de una breve centrifugación, coloque nuevamente el tubo en la tira magnética con una punta de pipeta de 10 microlitros fina. Retire completamente el tampón de lavado restante de cada tubo.Las fracciones de ARN y ADN se aíslan posteriormente de las muestras de chirp para su cuantificación y secuenciación. Esta figura muestra el enriquecimiento de telomerasa humana, ARN o Turk en células HELOC frente a GA dh. Un ARN celular abundante que sirve como control negativo.La mayoría del ARN Turk presente en la célula, aproximadamente el 88 %, se precipitó mediante la realización de chirp, mientras que solo el 0,46 % del ARN de GA DH se recuperó, lo que demuestra un factor de enriquecimiento de aproximadamente 200 veces. Pueden utilizarse sondas no específicas, como las dirigidas al ARN de LAC Z, que normalmente no se expresa en células de mamíferos, como controles negativos adicionales. Las regiones de ADN que se espera que se unan al objetivo. Los ARN largos no codificantes suelen estar enriquecidos en comparación con las regiones negativas cuando se miden mediante QPCR.Esta figura muestra la validación mediante qPCR de cuatro sitios unidos a hot air en fibroblastos primarios de prepucio humano, determinados mediante la realización de chirp SSE en la misma línea celular, mientras que los sitios de ADN Turk y GA DH sirven como regiones de control negativo. Tanto los conjuntos de sondas pares como impares produjeron un enriquecimiento comparable de los sitios unidos a hot air esperados frente a las regiones negativas. Un rasgo distintivo de los verdaderos sitios de unión de ARN largo no codificante.Se puede obtener un mapa global de los sitios de unión de ARN no codificantes largos mediante la secuenciación de alto rendimiento del ADN enriquecido por CHIRP, como lo ilustra este dato del ARN no codificante largo trla Rocks dos, que se sabe que interactúa con el cromosoma X de una manera necesaria para la compensación de dosis. Ambas muestras, pares e impares, se secuenciaron por separado y sus ruidos únicos se eliminaron para producir una pista de señales solapadas, donde cada pico indica un sitio fuerte de unión de Rocks dos. Al intentar este procedimiento, es importante aplicar correctamente la técnica libre de ARNas.Otros métodos, como el análisis por transferencia de proteínas, pueden realizarse para responder preguntas adicionales, como qué proteínas interactúan con el ARN no codificante de interés tras su desarrollo. CHI allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del ARN mapearan la interacción del ARN en células en cultivo y tejidos fijados.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aquí estamos presentando una inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) Procedimiento para el análisis de localización en todo el genoma de las isoformas de la proteína que se diferencian en un dominio de unión a las histonas. Estamos aplicando a CHIP-Seq análisis para identificar los objetivos de la histona desmetilasa KDM5A/JARID1A/RBP2.

Análisis de todo el genoma con chip para identificar objetivos específicos para cada isoforma Gene

Análisis de la interacción de la cromatina por género Secuenciación Paired-End (Chia-PET) es un método...

La cromatina Análisis de Interacción con la etiqueta de secuenciación pareadas final (Chia-PET) para el mapeo de la cromatina y la comprensión de las interacciones Reglamento Transcripción

Se describe un método robusto para la inmunoprecipitación de la cromatina utilizando células T primarias. El método se basa en los enfoques estándar, pero utiliza un conjunto específico de condiciones y reactivos que mejoran la eficiencia de unas cantidades limitadas de células. Es importante destacar que, se presenta una descripción detallada de la fase de análisis de datos.

Immunoprecipitation cromatina eficiente utilizando limitación de las cantidades de biomasa

La combinación de inmunoprecipitación de la cromatina y la secuenciación de ultra-alto rendimiento (chip-ss) puede identificar y mapear las interacciones proteína-ADN en un tejido o línea celular dada. Contorno es cómo generar una plantilla de chip de alta calidad para la posterior secuenciación, utilizando la experiencia con el factor de transcripción TCF7L2 como un ejemplo.

Generación de Plantilla ADN Immunoprecipitation cromatina alta calidad para la secuenciación de alto rendimiento (chip-ss)

Al combinar nativa y reticular inmunoprecipitación de cromatina con una elevada resolución Espectrometría de Masas, enfoque ChroP permite diseccionar la arquitectura proteómico compuesta de modificaciones de las histonas, variantes y proteínas no histonic sinergizantes en cromatina dominios funcionalmente distintos.

El Enfoque ChroP Combina chip y la espectrometría de masas para diseccionar Locus específicos proteómicos Paisajes de la cromatina

La identificación de moléculas asociadas con regiones genómicas específicas de interés es necesaria para comprender los mecanismos de regulación de las funciones de estas regiones. Este protocolo describe los procedimientos para realizar la inmunoprecipitación de cromatina mediada por moléculas de unión al ADN (enChIP) para la identificación de proteínas y ARN asociados con una región genómica específica.

El aislamiento de regiones genómicas específicas e identificación de moléculas asociadas por enChIP

Aquí, describimos una inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) y el protocolo de preparación de biblioteca de ChIP-seq para generar perfiles de epigenómica global de muestras embrionarias de pollo baja abundancia.

Cromatina (ChIP) de la inmunoprecipitación protocolo para muestras embrionarias baja abundancia

Se describe un protocolo paso a paso para cromatina tándem inmunoprecipitación secuenciación (tChIP-Seq) que permite el análisis de modificaciones específicas del tipo de célula genoma histona.

TChIP-Seq: Perfiles de celular-tipo-específico epigenoma

Este protocolo se centra en la preparación de cromatina a partir de tejidos congelados a presión y es adecuado para la inmunoprecipitación de cromatina reticulada (X-ChIP) seguida de un análisis cuantitativo de PCR (X-ChIP-qPCR) o enfoques de secuenciación de próxima generación (X-ChIP-seq).

Extracción de cromatina del tejido hepático quimérico congelado para el análisis de inmunoprecipitación de la cromatina

Aquí presentamos un protocolo para capturar las interacciones ADN-ADN de cromatina asociadas al ARN para mapear la organización del genoma tridimensional relacionada con el ARN.

Método de interacción ADN-ADN con cromatina asociada a ARN

Aprende ChIRP para mapear sitios genómicos de lncRNAs con alta resolución. Este método utiliza oligonucleótidos antisentido biotinilados para identificar regiones de ADN asociadas a ARN no codificantes.

Aislamiento de la cromatina mediante la purificación de ARN (chirp)

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