Aislamiento de la cromatina mediante la purificación de ARN (chirp)

El objetivo general del siguiente experimento es determinar las regiones de ADN que están asociadas con un ARN no codificante específico mediante QPCR o secuenciación de alto rendimiento. Esto se logra mediante la reticulación de células para atrapar las interacciones nativas D-N-A-R-N-A in vivo. Como segundo paso, las células se lisan y se someten a sonicación para solubilizar el lisado celular y la cromatina en pequeños fragmentos.

A continuación, se añaden oligonucleótidos antisentido biotinilados al lisado celular con el fin de enriquecer específicamente para los complejos R-N-A-D-N-A de interés, se obtienen resultados que dilucidan la identidad de los sitios genómicos unidos a ARN no codificantes basados en QPCR o secuenciación de alto rendimiento. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como R-N-A-D-N-A FISH, es que el chirp permite mapas de todo el genoma de sitios de unión de ARN no codificantes a resoluciones cercanas al par de bases. Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave en el campo del ARN no codificante, como la forma en que las rocas, los ARN y las moscas macho logran la compensación de dosis.

Las implicaciones de esta técnica, el grado hacia las terapias de las enfermedades relacionadas con la NA no codificante, ya que permite comprender mejor cómo el ARN no codificante regula los estados de cromatina y la expresión génica. Para este aislamiento de cromatina por purificación de ARN o experimento de chirp, se recolectarán 40 millones de células después de la centrifugación, se decantará el PBS y se eliminará el líquido restante aspirando cuidadosamente en un ángulo desalojado la pastilla celular golpeando la parte inferior del tubo de halcón. Añadir glutaraldehído al 1% recién preparado, empezando por un pequeño volumen y volver a suspender el rellenado de pellets celulares hasta el volumen completo y luego invertir para mezclar la reticulación durante 10 minutos a temperatura ambiente en un agitador o rotador de extremo a extremo, apagar la reacción de reticulación con un décimo volumen de glicina molar 1,25 y dejar en un agitador a temperatura ambiente durante cinco minutos, Las celdas se volverán de color naranja brillante.

A continuación, centrifugar a 2000 RCF durante cinco minutos, decantar y aspirar el sobrenadante y lavar el pellet con 20 mililitros de PBS refrigerado, centrifugar de nuevo, aspirar el sobrenadante y volver a suspender el paladar reticulado lavado con PBS refrigerado. Transfiera cada mililitro de células a un tubo de einor y gire a 2000 RCF durante tres minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, utilice una punta de pipeta para eliminar con cuidado la mayor cantidad posible de PBS.

Flash, congele todos los gránulos celulares en nitrógeno líquido y almacene a menos 80 grados centígrados indefinidamente. Para preparar el lisado celular para el chirrido, descongele los gránulos celulares reticulados congelados a temperatura ambiente. Golpee con fuerza para desalojar y mezclar el pellet de celda.

Gire los gránulos y use una punta de pipeta afilada de 10 microlitros para eliminar cualquier resto de PBS en una balanza electrónica con una precisión de un miligramo. Desgarra la masa de un tubo de einor vacío. Pesa cada pellet y registra su peso.

Agregue 10 veces el volumen de tampón de lisis suplementado con un inhibidor de proteasa fresco PMSF y super ace en cada tubo y vuelva a suspender el pellet. El lisado celular debe realizarse inmediatamente después de su preparación. Transfiera no más de 1,5 mililitros de lisado en cada tubo falcon de 15 mililitros e inserte las sondas de sonicación atornillándolas firmemente.

A continuación, coloque los tubos en una bioruptura, sonique a cuatro grados centígrados en la configuración más alta con 30 segundos en intervalos de pulso de 45 segundos. Revise el lisado cada 30 minutos. Continúe sonicateando hasta que el lisado celular ya no esté turbio.

Esto puede tardar de 30 minutos a cuatro horas, dependiendo del número de tubos, el volumen de la muestra, la temperatura del baño y el período de tiempo de sonicación. Cuando el lisado se vuelva transparente, transfiera cinco microlitros a un tubo de einor nuevo. Agregue el tampón de proteasa K de ADN y el vórtice de proteasa K para mezclar y centrifugar brevemente, incubar durante 45 minutos a 50 grados centígrados después de extraer el ADN con un kit de purificación de PCR.

Verifique el tamaño del ADN en un gel de 1%aros. La mayor parte del frotis de ADN debe ser de 100 a 500 pares de bases, lo que indica una centrífuga de sonicación completa. Un mililitro de alícuotas de muestras sonicadas a 16, 100 RCF durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, transfiera el sobrenadante a tubos de einor frescos y congele rápidamente en nitrógeno líquido para comenzar el procedimiento de chirp descongelar tubos de cromatina a temperatura ambiente para una muestra de chirp típica.

Con un mililitro de lisado, retire 10 microlitros para la entrada de ARN y 10 microlitros para la entrada de ADN y colóquelos en tubos de einor. Manténgalo en hielo hasta más allá. Utilice la transferencia de un mililitro de cada muestra de cromatina a un tubo de halcón de 15 mililitros.

Agregue dos mililitros de tampón de hibridación a cada tubo. A continuación, descongele las sondas a temperatura ambiente. Estos oligonucleótidos biazuleados biotinilados se marcan según sus posiciones a lo largo del ARN y se separan en dos grupos.

El grupo par contiene todos los sondeos con números pares. Y el grupo impar contiene sondas con números impares. Todos los experimentos se realizan utilizando ambos grupos, que sirven como controles internos entre sí.

Uno de los aspectos más desafiantes del protocolo verdadero es que todos los pasos de hibridación y lavado deben realizarse a 37 grados. Para asegurar una temperatura experimental constante, realice todos los pasos dentro o cerca de un horno de habitación, Agregue el volumen apropiado de sondas a tubos específicos. Mezcle bien, incube a 37 grados durante cuatro horas con agitación 20 minutos antes de que se complete la hibridación.

Prepara las cuentas magnéticas C one. Utilice 100 microlitros por cada 100 picos moles de sondas. Lave con un mililitro de tampón de lisis suplementado sin su, tres veces usando el imán de dos tiras Dyna mag para separar las perlas del tampón.

Después del lavado final, resus suspenda las perlas en el volumen original de tampón de lisis y complemente con superin fresh PMSF e inhibidor de proteasa. Cuando se complete la reacción de hibridación de cuatro horas, agregue 100 microlitros de perlas a cada mezcla de tubos. Incubar bien a 37 grados centígrados durante 30 minutos agitando las perlas de lavado con un mililitro de tampón de lavado precalentar a 37 grados centígrados en el primer lavado.

Use una tira magnética dyna mag 15 para separar las perlas, decantar y volver a suspender en un tampón de lavado de mililitros, transfiéralo a un tubo EOR de 1,5 mililitros. Incubar a 37 grados centígrados con agitación durante cinco minutos en lavados posteriores, girar cada tubo en una mini centrífuga y colocar la muestra en una tira magnética dyna mag two para decantar la muestra durante un minuto. Limpie las gotas con una toallita Kim y vuelva a suspender en un mililitro.

Lavar el tampón, incubar a 37 grados centígrados agitando durante cinco minutos. Repita para un total de cinco lavados en el último lavado Resus. Suspender bien las perlas, retirar 100 microlitros y reservar para el aislamiento del ARN, reservar 900 microlitros para la fracción de ADN.

Coloque todos los tubos en la tira magnética del tubo magnético dyna mag y retire el tampón de lavado. Después de un breve giro, vuelva a colocar el tubo en la tira magnética con una punta de pipeta afilada de 10 microlitros. Retire el tampón de lavado restante por completo de cada tubo.

Posteriormente, las fracciones de ARN y ADN se aíslan de las muestras de chirp para su cuantificación y secuenciación. Esta figura muestra el enriquecimiento de telomerasa, ARN o Turk humano de las células HELOC sobre GA dh. Un ARN celular abundante que sirve como control negativo.

La mayoría del ARN turco presente en la célula, alrededor del 88%, fue reducido mediante la realización de chirridos, mientras que solo se recuperó el 0,46% del ARN DH de GA, lo que demuestra un factor de enriquecimiento de aproximadamente 200 veces. Las sondas no específicas, como las sondas dirigidas a LAC ZRNA, que generalmente no se expresa en células de mamíferos, se pueden usar como controles negativos adicionales. Se espera que las regiones de ADN se unan al objetivo. El ARN largo no codificante suele enriquecerse sobre regiones negativas cuando se mide mediante QPCR.

Esta figura muestra la validación de QPCR de cuatro sitios unidos por aire caliente en fibroblastos primarios del prepucio humano determinados mediante la realización de chirp SSE en la misma línea celular, mientras que los sitios de ADN Turk y GA DH sirven como regiones de control negativas. Tanto los conjuntos de sondas pares como los impares produjeron un enriquecimiento comparable de los sitios de aire caliente esperados sobre regiones negativas. Un sello distintivo de los verdaderos sitios de unión de ARN largo no codificante.

Se puede obtener un mapa global de sitios de unión de ARN largo no codificante mediante la secuenciación de alto rendimiento de ADN enriquecido con chirp, como se ilustra en estos datos del ARN largo no recubierto TRLA Rocks dos, que se sabe que interactúa con el cromosoma X de una manera que se requiere para la compensación de dosis. Tanto las muestras pares como las impares se secuenciaron por separado y se eliminaron sus ruidos únicos para producir una pista de señales superpuestas donde cada pico indica una fuerte visión de rocas que se unen mientras se intentaba este procedimiento. Es importante ejercitar la técnica correcta de ARN libre siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como el doblot de proteínas, con el fin de responder a preguntas adicionales como qué proteínas están interactuando con el ARN no clínico de interés después de su desarrollo. CHI allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del ARN mapearan el aact de RN en células de cultivo y tejidos fijos.