Aislamiento de la cromatina mediante la purificación de ARN (chirp)

El objetivo general del siguiente experimento consiste en determinar las regiones de ADN asociadas con un ARN no codificante específico mediante QPCR o secuenciación de alto rendimiento. Esto se logra mediante la reticulación de células para atrapar in vivo las interacciones nativas entre ADN y ARN. Como segundo paso, las células se lisan y se someten a sonicación para solubilizar el lisado celular y romper la cromatina en fragmentos pequeños.

A continuación, se añaden oligonucleótidos antisentido biotinilados al lisado celular con el fin de enriquecer específicamente los complejos de R-N-A-D-N-A de interés; los resultados obtenidos permiten elucidar la identidad de los sitios genómicos unidos a ARN no codificantes, basándose en QPCR o en secuenciación de alto rendimiento. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la hibridación in situ con R-N-A-D-N-A (FISH), es que chirp permite obtener mapas a nivel del genoma completo de los sitios de unión de ARN no codificantes con resoluciones cercanas al par de bases. Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave en el campo de los ARN no codificantes, como cómo las rocas, los ARN y las moscas macho logran la compensación de dosis.

Las implicaciones de esta técnica abarcan el avance hacia terapias para enfermedades relacionadas con ácidos nucleicos no codificantes, ya que permite comprender mejor cómo los ARN no codificantes regulan los estados de la cromatina y la expresión génica. Para este experimento de aislamiento de cromatina mediante purificación de ARN, o ChIRP, se recolectarán 40 millones de células tras la centrifugación, se decantará el PBS y se eliminará el líquido restante aspirando cuidadosamente en un ángulo, desprendiendo el botón celular al golpear suavemente la base del tubo tipo falcon. Añada glutaraldehído al 1 % recién preparado, comenzando con un volumen pequeño y resuspendiendo el botón celular, completando luego hasta el volumen final y mezclando mediante inversión; realice la reticulación durante 10 minutos a temperatura ambiente en un agitador de extremo a extremo o rotador. Detenga la reacción de reticulación con un décimo del volumen de glicina 1,25 molar y deje en el agitador a temperatura ambiente durante cinco minutos; las células adquirirán un color naranja brillante.

A continuación, centrifugue a 2000 RCF durante cinco minutos, deseche y aspire el sobrenadante y lave el sedimento con 20 mililitros de PBS frío; centrifugue nuevamente, aspire el sobrenadante y re suspenda el sedimento entrecruzado en PBS frío. Transfiera cada mililitro de células a un tubo eppendorf y centrifugue a 2000 RCF durante tres minutos a cuatro grados centígrados. Tras la centrifugación, use una punta de pipeta para eliminar cuidadosamente la mayor cantidad posible de PBS.

Flash, congele inmediatamente todos los pellet celulares en nitrógeno líquido y almacénelos a menos 80 grados Celsius indefinidamente. Para preparar el lisado celular para chirp, descongele los pellet celulares congelados y entrecruzados a temperatura ambiente. Golpee fuertemente para desalojar y mezclar el pellet celular.

Centrifugar los pellet y usar una punta de pipeta de 10 microlitros afilada para eliminar cualquier resto de PBS en una balanza electrónica precisa hasta un miligramo. Pesar la masa de un tubo eppendorf vacío. Pesar cada pellet y registrar su peso.

Añada un volumen 10 veces mayor de tampón de lisis suplementado con inhibidor de proteasas PMSF y super ace frescos a cada tubo y resuspenda el precipitado. El lisado celular debe ser procesado inmediatamente después de su preparación. Transfiera no más de 1,5 mililitros de lisado a cada tubo cónico de 15 mililitros e inserte las sondas de sonicación atornillándolas firmemente.

A continuación, coloque los tubos en un bio ruptor y sométalos a sonicación a cuatro grados Celsius en el ajuste más alto, con intervalos de pulsos de 30 segundos encendidos y 45 segundos apagados. Verifique el lisado cada 30 minutos. Continúe la sonicación hasta que el lisado celular ya no esté turbio.

Esto puede tardar entre 30 minutos y cuatro horas, dependiendo del número de tubos, el volumen de la muestra, la temperatura del baño y el período de tiempo de sonicación. Cuando el lisado se vuelva transparente, transfiera cinco microlitros a un tubo eppendorf nuevo. Añada tampón de proteasa K para ADN y proteasa K, vortexee para mezclar y centrifugue brevemente; incube durante 45 minutos a 50 grados Celsius tras extraer el ADN con un kit de purificación para PCR.

Verifique el tamaño del ADN en un gel de agarosa al 1%. La mayor parte del espectro de ADN debe estar entre 100 y 500 pares de bases, lo que indica una sonicación completa. Centrifugue alícuotas de 1 mililitro de las muestras sonificadas a 16,100 RCF durante 10 minutos a cuatro grados Celsius, transfiera el sobrenadante a tubos eppendorf nuevos y congele rápidamente en nitrógeno líquido para comenzar el procedimiento para descongelar tubos de cromatina en temperatura ambiente para una muestra típica de chirp.

Utilizando un mililitro de lisado, retire 10 microlitros para la entrada de ARN y 10 microlitros para la entrada de ADN, y colóquelos en tubos einor. Mantenga en hielo hasta nuevo uso. Transfiera un mililitro de cada muestra de cromatina a un tubo cónico de 15 mililitros.

Agregue dos mililitros de tampón de hibridación a cada tubo. A continuación, descongele las sondas a temperatura ambiente. Estos oligonucleótidos biotinilados dispuestos en mosaico están etiquetados de acuerdo con sus posiciones a lo largo del ARN y separados en dos grupos.

El grupo par contiene todas las sondas con números pares. Y el grupo impar contiene las sondas con números impares. Todos los experimentos se realizan utilizando ambos grupos, que sirven como controles internos el uno para el otro.

Uno de los aspectos más desafiantes del protocolo verdadero es que todos los pasos de hibridación y lavado deben realizarse a 37 grados. Para garantizar una temperatura experimental constante, realice todos los pasos dentro o cerca de un horno de hibridación. Añada el volumen apropiado de sondas a tubos específicos. Mezcle bien e incube a 37 grados durante cuatro horas con agitación; 20 minutos antes de que finalice la hibridación.

Prepare las perlas magnéticas C una. Utilice 100 microlitros por cada 100 pico moles de sondas. Lave tres veces con un mililitro de tampón de lisis sin suplemento utilizando el imán Dyna mag dos tiras para separar las perlas del tampón.

Después del último lavado, resuspenda las perlas en el volumen original de tampón de lisis y suplemente con PMSF fresco y un inhibidor de proteasas. Cuando la reacción de hibridación de cuatro horas esté completa, agregue 100 microlitros de perlas a cada tubo y mezcle bien. Incube a 37 grados Celsius durante 30 minutos con agitación y lave las perlas con un mililitro de tampón de lavado precalentado a 37 grados Celsius en el primer lavado.

Utilice una tira magnética Dyna Mag 15 para separar las perlas, deseche el sobrenadante y resuspenda en un mililitro de tampón de lavado; transfiera a un tubo EOR de 1,5 mililitros. Incube a 37 grados Celsius con agitación durante cinco minutos en los lavados subsiguientes, centrifugue brevemente cada tubo en una minicentrífuga y coloque la muestra en una tira magnética Dyna Mag 2 durante un minuto para desechar el sobrenadante. Elimine cualquier goteo con una toallita Kim y resuspenda en un mililitro.

Tampon de lavado, incubar a 37 grados Celsius con agitación durante cinco minutos. Repetir para un total de cinco lavados; en el último lavado, resuspender. Suspender bien las perlas, retirar 100 microlitros y reservar para el aislamiento de ARN; reservar 900 microlitros para la fracción de ADN.

Coloque todos los tubos en la tira magnética para tubos Dyna Mag y retire el tampón de lavado. Después de una breve centrifugación, coloque nuevamente el tubo en la tira magnética con una punta de pipeta de 10 microlitros fina. Retire completamente el tampón de lavado restante de cada tubo.

Las fracciones de ARN y ADN se aíslan posteriormente de las muestras de chirp para su cuantificación y secuenciación. Esta figura muestra el enriquecimiento de telomerasa humana, ARN o Turk en células HELOC frente a GA dh. Un ARN celular abundante que sirve como control negativo.

La mayoría del ARN Turk presente en la célula, aproximadamente el 88 %, se precipitó mediante la realización de chirp, mientras que solo el 0,46 % del ARN de GA DH se recuperó, lo que demuestra un factor de enriquecimiento de aproximadamente 200 veces. Pueden utilizarse sondas no específicas, como las dirigidas al ARN de LAC Z, que normalmente no se expresa en células de mamíferos, como controles negativos adicionales. Las regiones de ADN que se espera que se unan al objetivo. Los ARN largos no codificantes suelen estar enriquecidos en comparación con las regiones negativas cuando se miden mediante QPCR.

Esta figura muestra la validación mediante qPCR de cuatro sitios unidos a hot air en fibroblastos primarios de prepucio humano, determinados mediante la realización de chirp SSE en la misma línea celular, mientras que los sitios de ADN Turk y GA DH sirven como regiones de control negativo. Tanto los conjuntos de sondas pares como impares produjeron un enriquecimiento comparable de los sitios unidos a hot air esperados frente a las regiones negativas. Un rasgo distintivo de los verdaderos sitios de unión de ARN largo no codificante.

Se puede obtener un mapa global de los sitios de unión de ARN no codificantes largos mediante la secuenciación de alto rendimiento del ADN enriquecido por CHIRP, como lo ilustra este dato del ARN no codificante largo trla Rocks dos, que se sabe que interactúa con el cromosoma X de una manera necesaria para la compensación de dosis. Ambas muestras, pares e impares, se secuenciaron por separado y sus ruidos únicos se eliminaron para producir una pista de señales solapadas, donde cada pico indica un sitio fuerte de unión de Rocks dos. Al intentar este procedimiento, es importante aplicar correctamente la técnica libre de ARNas.

Otros métodos, como el análisis por transferencia de proteínas, pueden realizarse para responder preguntas adicionales, como qué proteínas interactúan con el ARN no codificante de interés tras su desarrollo. CHI allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del ARN mapearan la interacción del ARN en células en cultivo y tejidos fijados.