Los ensayos clínicos y de eliminación de la médula espinal en un modelo murino de esclerosis lateral amiotrófica (ELA)

Hola, mi nombre es Lar Turner. Soy investigador posdoctoral en el Departamento de Neurología de la Universidad de Ingham, Alemania. Hola, mi nombre es Lin Gunda.

Soy estudiante de medicina y estoy realizando mi trabajo de tesis en este laboratorio. Hoy les mostraremos la evaluación clínica del SODG 93, un modelo murino de esclerosis lateral amiotrófica. Además, demostraremos la prueba de función motora con un llamado test de rotor y, adicionalmente, otra prueba de función motora con el agarre en alambre colgante, con el fin de realizar un análisis inmunológico.

Después de la prueba funcional de los ratones a s, un procedimiento necesario consiste en la extracción de la médula espinal, el nervio STIC y el músculo gastrocnemio. Deseamos mostrar este procedimiento quirúrgico en detalle y presentar algunos hallazgos inmunológicos ejemplares al final. Bien, pero ahora comencemos primero con las pruebas clínicas.

Este es un MOE de tipo salvaje de movimiento libre que no presenta ningún síntoma clínico como temblor muscular o Parsis en nuestro sistema de clasificación clínica. Eso correspondería a una puntuación de cuatro. Este es un MOE transgénico de A LS.

En una etapa temprana de la enfermedad, presenta un temblor severo de la extremidad trasera derecha que lo clasifica como PUNTUACIÓN tres E. Las anomalías severas de la marcha clasifican a este animal como puntuación dos. El arrastre de al menos una extremidad trasera se clasifica como puntuación clínica uno en la prueba del alambre colgante, en la que se evalúa la fuerza muscular bruta de las costillas. Cada ratón se coloca sobre un alambre hecho a medida y se gira cuidadosamente boca abajo sobre el botón cubierto de paja.

Después de entrenar tres veces consecutivas durante al menos 180 segundos, se midió la latencia para caer. A cada ratón se le dan hasta tres intentos para agarrarse a la tapa invertida durante un máximo de 180 segundos, y se registra el período más largo en comparación con el ratón tipo alambre blanco del lado derecho. El ratón transgénico con placas del lado izquierdo es muy débil y se cae de la tapa antes de alcanzar el máximo.

El aparato de barra rotatoria se utiliza para medir la coordinación motora, el equilibrio y la capacidad de aprendizaje motor. Un buen desempeño requiere un alto grado de coordinación sensoriomotora. Consiste en un huso giratorio controlado por computadora y accionado por un motor, y cinco carriles para cinco m.

Los fallos de los ratones se detectan automáticamente mediante la presión ejercida sobre la placa plástica inferior. Después de entrenar durante tres veces consecutivas de al menos 180 segundos a una velocidad constante de 15 vueltas por minuto, se mide el tiempo durante el cual un animal puede permanecer sobre el rotarod giratorio. Cada animal realiza tres ensayos y se registra la latencia más larga sin caerse.

El mos tipo salvaje sano del lado izquierdo corre sin dificultad sobre la barra rotatoria. En contraste, el mos transgénico a s del lado derecho presenta graves problemas para permanecer incluso sobre la barra rotatoria y se desliza después de un tiempo, observado desde atrás. Se observan las severas dificultades para correr del ratón retre izquierdo.

En comparación con el ratón control sano, no es capaz de mantenerse al ritmo de la velocidad del cilindro rotatorio ni puede impulsarse hacia arriba con las extremidades HIN. Para realizar un análisis inmunoquímico de la médula espinal, es necesario sacrificar a los animales. Es muy importante seguir siempre estrictamente las normas locales sobre la correcta realización de experimentos con animales.

En este contexto, en esta visión general muy simplificada de la columna vertebral y sus tejidos circundantes, se representan las principales estructuras anatómicas. Colocaremos al animal sobre su lado ventral y comenzaremos a preparar los músculos desde la bolsa dorsal. Una vez que se haya eliminado el tejido muscular, accederemos a la columna vertebral que encierra la médula espinal.

Después de sacrificar al animal y perfundirlo con una solución que contiene paraformaldehído, se puede extraer la médula espinal. El animal se coloca sobre una mesa de operaciones y se fijan firmemente las extremidades a los lados con el fin de exponer la parte posterior del ratón. Se humedece al animal para aplanar el pelaje y facilitar la incisión cutánea siguiente.

Para ello, se utiliza un escalpelo afilado. Tenga cuidado de estirar la piel hacia ambos lados. Para facilitar el corte, se debe preparar el músculo de la pata.

También debe hacerse una incisión en su piel. Una vez completada la incisión en la piel, se retira suavemente hacia un lado. Con un par de pinzas, después de retirar los músculos de la pata y el nervio ciático, continuamos acercándonos a la médula espinal y colocamos el animal en una nueva mesa de operaciones.

Ahora es fácil identificar el cráneo, el cuello, los músculos y la columna vertebral. Tras identificar todas estas estructuras, es sencillo pasar al siguiente paso. Es necesario eliminar los músculos del cuello y el ligamento nu.

Tenga cuidado de no incisionar demasiado profundamente y dañar la columna vertebral. En el siguiente paso, los músculos paravertebrales se eliminan por completo para exponer la columna vertebral. Para acceder a la columna espinal, se deben realizar varias ectomías.

Comenzamos desde la parte cervical de la columna vertebral, incluyendo la articulación occipital atlantoidea. Para realizar la laminectomía, debemos cortar el arco vertebral con el fin de poder eliminar todos los procesos vertebrales del cuerpo vertebral. Como se explicó anteriormente, la laminectomía comienza con el corte de los arcos vertebrales.

Luego se puede retirar la lámina. Nuevamente, tenga cuidado de no lesionar la médula espinal, ya que aún se deben eliminar muchas más láminas. Es muy útil utilizar tijeras anguladas e incisionar varios arcos vertebrales de ambos lados al mismo tiempo.

Luego tire de los procesos dorsales para retirar completamente las láminas vertebrales y el acercamiento. Observe que el par de tijeras debe insertarse con cuidado lo más lateralmente posible al lado del canal espinal. Es necesario retirar las partes laterales restantes de la columna vertebral para facilitar la extracción completa posterior de la médula espinal.

Un punto de referencia anatómico de la médula espinal son las llamadas expansiones cervical y lumbar. Después de finalizar las ectomías de toda la médula espinal, asegúrese de que también secciona todas las raíces ventrales de la médula espinal y la libere de la duramadre de las meninges. A continuación, se corta la médula espinal cervical.

Hacia craneal y se inicia nuevamente la extracción. Tocar la médula espinal con mucha precaución para no dañar este tejido, ya que esto podría causar limitaciones severas para un posterior análisis inmunoquímico. La extracción de la médula espinal continúa luego a nivel torácico y prosigue hacia la parte lumbar.

Finalmente, se vuelve a cortar, esta vez al lado de la cola de caballo. Ahora podemos liberarla por completo. Aquí se observa la médula espinal colocada justo al lado de su ubicación original en la columna vertebral.

Finalmente, se coloca en una solución fijadora de paraformaldehído. Como ejemplo clásico de análisis inmunohistoquímico de la médula espinal, puede aplicarse un anticuerpo que reconozca la colina acetiltransferasa para identificar las neuronas motoras en el asta anterior de la médula espinal. Aquí se observa un gran número de neuronas motoras en un animal silvestre sano.

En contraste, el animal transgénico con ELA en fase terminal sí presenta un número mucho menor de neuronas motoras en el cuerno anterior. Tras ver este artículo en video, usted debería haber aprendido el examen clínico básico del ratón SOD1G93A, un modelo de esclerosis lateral amiotrófica.

Se han demostrado dos pruebas de comportamiento motor: la prueba del rotor y la prueba del alambre colgante. Estas pruebas ofrecen una buena posibilidad para evaluar la función motora básica. Son fáciles de realizar, sensibles en la detección de déficits motores y eficientes en cuanto al tiempo.

La parte principal de este video consiste en una demostración de la técnica de preparación de la médula espinal. Esta técnica, por supuesto, puede aplicarse a cualquier otro modelo de enfermedad en ratón y es un paso esencial para el posterior análisis inmunoquímico de la patología de la enfermedad en la médula espinal. Gracias por verlo.

Esperamos que este artículo en video sea útil para sus futuros experimentos.