Hidrófobo sal modificada Nafion para inmovilización de enzimas y Estabilización

El objetivo general de este procedimiento es sintetizar un polímero micelar para inmovilización y estabilización enzimática. Para lograrlo, primero combine la suspensión de neón con la sal de bromuro de colina amónica y vortexee la mezcla para intercambiar la forma protonada de nafion por sales de amonio. El segundo paso consiste en secar el polímero resultante vertiendo la mezcla en un recipiente para evaporación y permitiendo que los disolventes se evaporen.

A continuación, remoje el polímero en agua desionizada durante 12 a 24 horas para eliminar la sal en exceso. Después de la extracción de la sal, enjuague el polímero con agua y luego deje secar completamente el polímero por evaporación. El paso final consiste en transferir el polímero a un vial limpio y resuspenderlo en disolvente para su uso en la inmovilización de enzimas. En última instancia, este polímero para la inmovilización de enzimas micelares se utiliza para mejorar la estabilidad de las enzimas en ensayos de actividad.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque este procedimiento parece extremadamente sencillo, pero el proceso de secado es fundamental para la fabricación de un polímero funcional. El procedimiento será demostrado por Shu, un estudiante de posgrado en mi laboratorio, para comenzar el proceso de modificación del nafion con sales de amonio de Nerium. Mida un exceso molar tres veces mayor con respecto a los grupos ácido sulfónico en el polímero de nafion de la sal de bromuro de alquilamonio.

Transfiera la sal de bromuro de alquilamonio a un vial de vidrio vigorosamente. Agite un frasco de suspensión de nafion al 5% peso por volumen durante aproximadamente 30 segundos para asegurar que el nafion esté suspendido uniformemente en la solución. Pipetee dos mililitros de la suspensión de nafion recién resuspendida y añádalos al vial de vidrio que contiene la sal de bromuro de amonio de AGU.

Vortex la muestra a 900 RPM durante 10 a 15 minutos. A continuación, vierta la solución viscosa en una bandeja de pesaje de plástico y utilice una pipeta para transferir cualquier solución residual del vial a la bandeja de pesaje. En este ejemplo, la bandeja se cubre parcialmente y se deja sobre el banco de laboratorio para permitir que los disolventes se evaporen completamente de la bandeja a una velocidad de evaporación que toma más de seis horas.

La evaporación completa de todo el disolvente a la velocidad adecuada debería dejar tras de sí una película transparente de color amarillo o marrón en el fondo de la bandeja de pesaje, como se muestra aquí. Si el disolvente se evapora demasiado rápido, se formará un material crujiente o cristalino en lugar de una película transparente, lo que indica que la estructura micelar del polímero ha sido destruida. Si la evaporación del disolvente es demasiado lenta o si se permite que la sal de amonio reaccione durante demasiado tiempo y absorba exceso de vapor de agua, se formará ya sea un gel naranja pegajoso o un material cristalino blanco.

En cualquiera de los dos casos, el procedimiento debe reiniciarse. Una vez que todo el disolvente haya evaporado a la velocidad adecuada de evaporación, llene la bandeja de pesaje con 10 a 20 mililitros de agua desionizada de 18 megaohmios por centímetro, cúbrala y deje en remojo durante 12 a 24 horas para eliminar los excesos de sales de bromuro de alquilamonio y HBr. Doce a veinticuatro horas después, aspire el agua con una pipeta y añada suficiente agua desionizada para llenar la bandeja. Tenga cuidado de pipetear siempre alejándose de la película polimérica para evitar perder parte de ella.

Lave un total de tres veces después de los lavados. Deje la bandeja de pesaje descubierta hasta que el polímero esté completamente seco. Cuando esté completamente seco, el polímero debe ser una película plástica transparente y algo frágil.

En contraste, los polímeros que no se secaron adecuadamente tendrán una apariencia muy diferente tras la extracción de la sal, como se muestra aquí. Con una espátula, retire cuidadosamente la película seca de la bandeja de pesaje y transfiérala a un vial de vidrio limpio. Añada dos mililitros de etanol y tres esferas cerámicas de mezclado, y vortexee durante cuatro horas o hasta que la película de polímero se resuspenda completamente.

La solución de nathe modificada con alquilamonio ya está lista para usarse en la inmovilización de enzimas. Si la enzima que se va a inmovilizar es una enzima seca, pese un miligramo de la enzima en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros y añada un mililitro de tampón fosfato de cien milimolar y pH siete para crear una solución de enzima de un miligramo por mililitro. Transfiera 120 microlitros de la solución de enzima de un miligramo por mililitro a un tubo nuevo.

Añada 60 microlitros de la solución de nafion modificada con amonio ALK y vortexee durante 10 segundos. La relación entre la enzima y la solución polimérica debe mantenerse en dos a uno si es necesario escalar esta mezcla para un gran número de réplicas. Finalmente, pipetee 60 microlitros de la solución de enzima-polímero en el fondo de cada una de las tres cubetas separadas de un centímetro cuadrado y déjelas secar durante la noche.

La estabilidad de la enzima dentro de la película polimérica puede evaluarse entonces mediante ensayos de actividad enzimática, como se demuestra. A continuación, para iniciar este ensayo, agregue los siguientes reactivos en el vial recubierto con el polímero nafión modificado y la enzima deshidrogenasa dependiente de NAD: 1,3 mililitros de pirofosfato de sodio 50 milimolar, 1,5 mililitros de nicotinamida adenina dinucleótido 15 milimolar recién preparado o NAD y 0,1 mililitros de agua.

Coloque el vial en un espectrofotómetro UV-visible ajustado a una longitud de onda de 340 nanómetros. Añada 0,1 mililitros de etanol al vial y mezcle los reactivos pipeteando suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo cinco veces; para el blanco, utilice 0,1 mililitros de agua adicional en lugar de los 0,1 mililitros de etanol. Cinco minutos después de haber añadido los reactivos al vial, registre la absorbancia a 340 nanómetros.

Registre la absorbancia nuevamente 20 minutos después de añadir los reactivos al vaso de reacción cuarzo (qve); estos dos puntos de datos se graficarán para obtener una pendiente que pueda utilizarse en los cálculos de actividad para evaluar la actividad enzimática específica de pq inmovilizada. Pipetee estos reactivos en el qve coprocesado con el polímero de nafion modificado y la deshidrogenasa dependiente de PQQ. 1,5 mililitros de fosfato de sodio y 200 microlitros de sulfato de pH metílico 600 micromolar o PMS.

Coloque el vete en un espectrofotómetro UV visible ajustado a una longitud de onda de 600 nanómetros y cero. El espectrómetro añade 100 microlitros de una mezcla de 700 microlitros de cloro endemol o DCIP y 200 microlitros del sustrato de interés. Mezcle los reactivos pipeteando suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo cinco veces para un blanco.

Utilice 200 microlitros de agua en lugar del sustrato de interés. Cinco minutos después de que se agregaron los reactivos, registre la absorbancia a 600 nanómetros.

Registre la absorbancia nuevamente 20 minutos después de agregar los reactivos para iniciar este ensayo. Añada a la Q VET coelectrodeposicionada con el polímero de nafion modificado y glucosa oxidasa. Dos mililitros de una solución que contiene los siguientes componentes: ácido para-hidroxibenzoico 0,2 molar, azida sódica al 0,02 %, 128 unidades de peroxidasa, cuatro aminoantipirina 0,3 milimolar, fosfato potásico 1 molar y glucosa 50 milimolar.

Prepare la solución pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces. Coloque el Q vet en un espectrofotómetro UV visible ajustado a una longitud de onda de 510 nanómetros. Cinco minutos después de que los reactivos se agregaron al qve.

Registre la absorbancia a 510 nanómetros. Luego registre nuevamente la absorbancia a los 20 minutos posteriores a la adición de los reactivos. Esta tabla muestra los resultados del ensayo de la actividad de la glucosa deshidrogenasa dependiente de NAD inmovilizada y de polímeros de nafion modificados seleccionados.

Se observó que la glucosa deshidrogenasa dependiente de NAD inmovilizada presentaba una actividad específica menor que la del enzima en solución con tampón. Esto se debe a que las membranas poliméricas reducen el transporte de moléculas grandes, y aunque la glucosa, sustrato del ensayo, es pequeña, el coenzima NAD debe difundirse hacia dentro y hacia fuera de la membrana. Para la deshidrogenasa dependiente de NAD, la limitación en el transporte provocada por la inmovilización en el polímero disminuye la actividad enzimática observada.

La siguiente tabla muestra los resultados de ensayos de actividad de la glucosa deshidrogenasa dependiente de PQQ inmovilizada en polímeros de nafion modificados seleccionados. Es importante observar aquí la mayor actividad de las enzimas inmovilizadas en la mayoría de las películas de nafion en comparación con las enzimas en solución tampón. Dado que la glucosa deshidrogenasa dependiente de PQQ es una proteína asociada a membrana, el nafion modificado hidrofóbico proporciona un entorno más similar a una membrana que el tampón, lo que estabiliza mejor la glucosa deshidrogenasa dependiente de PQQ activa y, por tanto, mejora la actividad enzimática.

Por último, los resultados representativos del ensayo de actividad específica de la glucosa oxidasa. En esta tabla se muestran los polímeros de nafion inmovilizados y modificados seleccionados. Los ensayos enzimáticos para cada uno de los polímeros con cada una de las tres enzimas muestran que las tendencias en la actividad específica relativa, en comparación con la enzima en solución, son una función del sistema enzimático.

Por consiguiente, debe optimizarse el polímero exacto necesario para cada enzima. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el paso de secado es crítico para este procedimiento en particular.