En tiempo real de imágenes digitales de los leucocitos del endotelio interacción en el daño por isquemia-reperfusión (IRI) del músculo cremáster Rata

La microscopía intravital de la microcirculación del tejido CRE es un método conveniente para obtener información sobre la isquemia y la lesión por reperfusión del tejido muscular estriado. En un protocolo paso a paso, mostramos cómo comenzar con una anestesia controlada por respiración bajo una monitorización adecuada mediante la cannulación arterial para mantener al animal firmemente anestesiado durante períodos prolongados. Ilustramos cómo realizar la cannulación de la vena yugular y luego describimos la preparación del tejido CRE como una lámina delgada y plana que ofrece una resolución óptica excepcional.

Proporcionamos un protocolo para la obtención de imágenes de leucocitos en lesión por isquemia-reperfusión que ha sido bien establecido en nuestros laboratorios. Este modelo puede utilizarse para analizar la activación de leucocitos en isquemia. Investigación sobre lesión por reperfusión.

Se ha implicado a la lesión por fusión isquémica en un amplio espectro de condiciones patológicas, como el infarto de miocardio, la isquemia intestinal, así como en el período posterior a trasplantes y cirugías cardiovasculares. La hiperperfusión del tejido previamente isquémico, aunque esencial para prevenir lesiones tisulares irreversibles, provoca una inflamación excesiva del tejido afectado, adyacente a la producción de especies reactivas de oxígeno, la activación del sistema del complemento y un aumento de la permeabilidad microvascular. La activación de los leucocitos es uno de los principales actores en la cascada patológica del daño tisular inflamatorio durante la reperfusión.

Aquí promovemos la microscopía intravital del sector postcapilar como un método conveniente para analizar la activación de leucocitos en la lesión por isquemia-reperfusión. Además, ilustramos errores comunes y ofrecemos consejos útiles que deberían permitir al lector comprender cabalmente y realizar con seguridad el método. Tras la aprobación del comité de ética, anestesie ratas macho con un peso corporal de 120 a 180 gramos, coloque la rata dentro de una caja de plexiglás y administre del dos al tres por ciento en volumen de isoflurano mediante un vaporizador de isoflurano.

En cuanto se alcance el nivel adecuado de anestesia, se pesa a la rata y se afeita el área cervical ventral. Coloque a la rata en posición decúbito dorsal sobre una almohadilla calefactora para mantener la temperatura corporal a 37 grados Celsius y administre isoflurano al dos por ciento en volumen mediante una máscara de silicona. Las siguientes preparaciones se realizan mejor utilizando un microscopio quirúrgico.

Realice una incisión cutánea horizontal de dos centímetros en la región de la escotadura esternal. Movilice las glándulas salivales lateralmente. Ahora tiene ante usted los músculos cervicales ventrales.

Separarlos cuidadosamente por la línea media y localizar la tráquea. Exponer de uno a dos centímetros de la tráquea y colocar una pinza microquirúrgica por debajo para elevarla. Ahora, insertar aproximadamente a la mitad del lado ventral de la tráquea un tubo de calibre 14 como tubo traqueal en la parte inferior de la tráquea, el cual previamente se habrá conectado a un ventilador para animales.

Entonces, la respiración puede controlarse por volumen con una frecuencia de 35 a 45 respiraciones por minuto. Un volumen corriente de 4,5 a cinco M y una concentración de fluoruro de ISO del 1,5 al 2 por ciento en volumen para la canulación carotídea. El músculo hioides esternal derecho se separa mediante disección roma.

Para localizar una arteria carótida, separe cuidadosamente el nervio vago de la arteria carótida y coloque la arteria sobre pinzas microquirúrgicas Anki para detener el flujo sanguíneo desde el corazón, pasando dos hilos de sutura por debajo de la arteria carótida en relación con el corazón; el hilo de sutura más distal se ata firmemente, mientras que el hilo proximal se ata flojamente alrededor de la arteria carótida. La colocación de un segundo hilo proximal evita el sangrado tras retirar las pinzas microquirúrgicas utilizando tijeras microquirúrgicas, realizando un pequeño corte en la arteria carótida entre las dos ligaduras. Introduzca un catéter de polietileno lleno con solución salina normal que esté conectado a un transductor de presión.

Retire las pinzas microquirúrgicas y avance más el catéter dentro de la arteria. Realice análisis intermitentes de gases en sangre arterial utilizando un analizador de gases sanguíneos y mantenga el pH sanguíneo dentro de los límites fisiológicos para la administración intravenosa de colorantes fluorescentes u otros fármacos de interés. Enfóquese en la zona de la vena yugular izquierda con el microscopio quirúrgico, sosteniendo una pinza en cada mano, y rompa la fina fascia para exponer la vena yugular.

Coloque la vena sobre una pinza microscópica en ángulo para detener el flujo sanguíneo. Con la pinza, pase dos trozos de hilo de sutura de igual longitud por debajo de la vena yugular de forma idéntica a la canulación carotídea; haga un pequeño corte en la vena yugular e inserte un catéter de polietileno que haya sido lavado con solución de la línea celular. Introduzca el catéter hacia el corazón y apriete el ligador más cercano al corazón.

Alrededor de la vena y el catéter, utilizamos una imagenología cremastérica de aluminio en etapa cuatro que adopta rápidamente la temperatura deseada de la almohadilla calefactora. Se realiza una incisión inicial en la piel y en el fiso espermático externo por encima del escroto, en el extremo más distal, seguida de una dilatación cuidadosa del espacio subdérmico mediante tijeras finas. Tan pronto como se expone el tejido, se humedece con una solución salina precalentada.

Se elimina cuidadosamente el tejido conectivo entre la fascia espermática externa y el músculo CRE maestro para liberar los músculos del trimestre de los tejidos circundantes. La superfusión continua durante la disección hidrata el tejido, lo que facilita la visibilidad y la eliminación, como el extremo distal del CRE maestro S para sujetar y extender ligeramente el extremo del S en el interior del extremo distal del saco en la cara ventral y alargar la incisión proximalmente. Utilizando tijeras microquirúrgicas, se categorizan cuidadosamente los vasos sanguíneos que sangran a lo largo de las líneas de incisión.

Utilizando un Cory térmico, el músculo cremaster abierto queda plano sobre la dosis del pedestal de aluminio, aún conectado mediante delgados ligamentos a los EPI debajo del testículo, incluyendo una pequeña arteria y vena. Use el ery para sellar los vasos y cortar los ligamentos conectivos entre el tejido discal y el tejido cremasteriano. Empuje suavemente el testículo aislado de vuelta hacia el canal inguinal.

Además de la primera fijación, que son cuatro picazones del tejido, y con cuidado adhiera los hilos extendiendo radialmente el tejido cremaster sobre la plataforma de aluminio. Coloque los dos extremos de un catéter de polietileno cerca del tejido cremaster para el montaje de la superfusión. Dibuje una línea de gel de petrolato alrededor del músculo cremaster utilizando una jeringa para crear una cámara de fluido.

Coloque un cubreobjetos cuadrado sobre el tejido cric y sujete firmemente los bordes a la línea de vaselina. El tejido cremastérico ya está listo para la imagenología microscópica. La configuración básica in vivo puede variar.

Utilizamos un microscopio intra vital de epifluorescencia equipado con una fuente luminosa LED de 470 nanómetros para la laminación EP. Con un objetivo de inmersión en agua, alcanzamos un aumento de aproximadamente 800 x y registramos la observación mediante una cámara digital de alta resolución. Para la imagen de epifluorescencia, el experimento debe realizarse en una habitación oscura.

Para la marcación de leucocitos, inyecte rumina seis J por vía intravenosa a través del catéter yugular a una concentración de 0,4 miligramos por kilogramo de peso corporal. Elija un vaso postcapilar para la observación. El tamaño del vaso debe oscilar entre 20 y 60 micrómetros y el flujo sanguíneo debe ser suficiente.

Antes de que ocurra la isquemia, deje que el tejido se estabilice durante 30 minutos. Posteriormente, realice una grabación de 30 segundos para establecer los valores basales de la rodadura y adherencia de los leucocitos. Coloque suavemente una pinza vascular bemer alrededor del extremo muy proximal del tejido cremaster expuesto utilizando fórceps de aplicación.

Retire la pinza del vaso después de 30 minutos de isquemia. Se pueden realizar grabaciones posteriores durante todo el período de reperfusión. Para la cuantificación del rodamiento de leucocitos, defina una línea virtual que cruce verticalmente el vaso, la cual debe ser consistente en todos los registros.

Cuente manualmente el número de leucocitos rodantes que pasan la línea dentro de los 30 segundos. Para la cuantificación de leucocitos adherentes, defina una sección vascular de 200 micrómetros que sea constante en todos los registros.

Cuente el número de leucocitos claramente visibles que permanecen estáticos durante 30 segundos. Los resultados representativos se proporcionan dentro del protocolo escrito. Aunque la lesión por isquemia-reperfusión ha sido implicada en diversos sistemas orgánicos, aquí describimos un método para analizar la interacción leucocito-endotelial en la lesión por reperfusión del tejido muscular estriado.

Por lo tanto, particularmente relevante para la cirugía de colgajo libre, ya que se asume que la lesión tisular post isquémica de otros órganos implica los mismos mecanismos inflamatorios. El método descrito puede utilizarse para obtener conocimientos fundamentales sobre los mecanismos patológicos en la lesión por isquemia-reperfusión. La inducción de isquemia en el músculo cremástero puede realizarse fácilmente y refleja perfectamente condiciones clínicamente relevantes, como la cirugía de colgajo libre.

Además, modificaciones como la isquemia fría o la isquemia tibia o la superperfusión crónica con sustancias que influyen en la inflamación pueden aplicarse fácilmente. La inyección intraoral puede ser el método de elección cuando se necesita un tratamiento, horas o días antes de la grabación.