A Parasite Rescate y Transformación de ensayo para la detección antileishmanial contra intracelular Leishmania donovani Amastigotes en THP1 Humanos aguda línea celular de leucemia monocítica

El objetivo general de la tecnología experimental demostrada aquí es examinar los compuestos contra el crecimiento y la proliferación de la etapa intracelular de la manía de Lish. Don Avani la causa del agente para la leishmaniasis visceral con el objetivo principal de descubrir nuevos fármacos para el tratamiento de la lemanis Primero THP uno Las células de leucemia monocítica aguda humana se diferencian in vitro en macrófagos adherentes, las células THP diferenciadas y luego se infectan con cabras ProMaster de la correa Manaya Donovan parásitos, lo que permite la invasión de las cabras ProMaster en los macrófagos TP uno, su transformación en AMAs, cabras y proliferación intracelular. A continuación, los macrófagos infectados con leishmania THP one se exponen a compuestos de prueba y fármacos estándar y luego se someten a lisis controlada, rescate de una transformación de residuos de cabras maestras, cabras maestras a cabras ProMaster y cuantificación de cabras ProMaster mediante ensayos de crecimiento celular colormétrico.

Resultados obtenidos que muestran el efecto antimaníaco de los compuestos de prueba y los fármacos estándar sobre el crecimiento y la proliferación intracelular basados en la cuantificación de cabras maestras intracelulares. Lemanis es una importante amenaza para la salud mundial, especialmente en las zonas tropicales del mundo. Se necesitan urgentemente nuevos fármacos con mejores perfiles terapéuticos para tratar esta enfermedad.

En el Centro Nacional de Investigación de Productos Naturales hemos lanzado un programa multidireccional para el descubrimiento de nuevos tratamientos para enfermedades parasitarias tropicales. A diferencia de los ensayos de análisis de imágenes microscópicas y Rogen, que pueden no diferenciar entre los productos MSST vivos y muertos, este SA mide solo los productos MST intracelulares vivos. Hemos optimizado un ensayo de rescate y transformación de parásitos con células TP one diferenciadas infectadas in vitro con el liman para el cribado del compuesto puro y el extracto de producto natural y la determinación de la eficacia frente a la limania intracelular.

Los detalles experimentales de este ensayo serán demostrados por el Sr. Ra, que es el biólogo de investigación y desarrollo en mi laboratorio y realiza este ensayo, y el Sr. RA Sahu, que también trabaja como biólogo de investigación y desarrollo en mi laboratorio. Hay cuatro pasos básicos en el ensayo. El primer paso es la siembra y la diferenciación terminal de las células THP uno.

El segundo paso es la infección in vitro de células TP one diferenciadas con cabras L mania proma. El tercer paso es el tratamiento de los macrófagos infectados con la manía de Lish con los compuestos de prueba o los fármacos estándar. Y el cuarto paso es la cuantificación del crecimiento y la proliferación de cabras parásitas con análisis de imágenes microscópicas o ensayos de rescate y transformación de parásitos.

Coseche un cultivo de macrófagos THP one de cuatro días de antigüedad y prepare una suspensión celular en nuestro PMI suplementada con FPS activado al 10% de calentamiento con una concentración de 2,5 veces 10 a las cinco células por mililitro. Agregue 25 nanogramos por mililitro de PMA a las células para desencadenar la diferenciación. A continuación, transfiera 200 microlitros de suspensión celular a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y a cada cámara de un portaobjetos de vidrio de 16 cámaras una vez que las células hayan sido colocadas, coloque el portaobjetos y la placa de 96 pocillos en una incubadora a 37 grados Celsius e incube las células durante la noche para permitir que se produzca una diferenciación celular casi completa.

Para la infección. Use un cultivo de parásitos de cabras ProMaster de cinco a seis días de edad en el que la mayoría de los organismos se encuentran en la etapa cínica infecciosa. A diferencia de las cabras ProMaster en etapa procíclica, que son células elipsoides cortas con un gel corto, motil semanal y que a menudo se encuentran en rosetas, los organismos metacíclicos infecciosos se pueden reconocer por su forma cilíndrica larga y su alta motilidad.

Coseche los parásitos y prepare una suspensión de cabra ProMaster de 2,5 veces 10 a los seis parásitos por mililitro en 2%F-B-S-R-P-M-I recupere los cultivos celulares diferenciados de THP de la incubadora que procesa la placa de 96 pocillos y el portaobjetos de vidrio. Paralelamente, retire el supinato de los cultivos, luego lave las células agregando medio libre de suero anterior a la guerra. Retire el medio libre de suero y reemplácelo con 200 microlitros por pocillo de suspensión de cabra ProMaster, logrando una proporción de 10 parásitos por cada célula THP.

Para los pozos de control, agregue 200 microlitros de medio F-P-S-R-P-M-I al 2% en lugar de la suspensión de parásitos. Después de agregar los parásitos, incubar los cocultivos a 37 grados centígrados durante 24 horas para permitir que la infección ocurra a partir de soluciones madre del medicamento que se va a probar. Prepare seis diluciones seriales de uno a cinco en 2%F-B-S-R-P-M-I, tales concentraciones de cada dilución son el doble de la prueba final prevista.

Se puede utilizar una concentración similar a la de los controles, se pueden utilizar fármacos antimaníacos estándar como la anfotericina b pentamidina, el melter, el Fosse y el gluconato de sodio stib antes de añadir los fármacos a los cocultivos. Lave repetidamente las celdas TP one en la placa y deslícelas como se describió anteriormente. Lave las celdas al menos cinco veces para eliminar las cabras ProMaster no internalizadas.

A continuación, añada 100 microlitros de 2%F-B-S-R-P-M-I y 100 microlitros de cada solución de fármaco a cada pocillo o cámara, e incube la placa y dialícela a 37 grados centígrados durante 48 horas después del tratamiento farmacológico. Lave la cámara. Deslizar tres veces en medio libre de suero.

Despegue las cámaras de plástico del portaobjetos y fije las celdas sumergiendo el portaobjetos en metanol durante 30 segundos. Coloque el portaobjetos en una campana de riesgo biológico con flujo de lámina para permitir que se seque. Mientras tanto, prepare una solución cinco veces mayor de ciberverde.

Una vez que el portaobjetos esté seco, sumérgelo en verde cibernético para teñir el ADN celular y parásito. Incubar la muestra en la oscuridad durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después del paso de tinción, lave el portaobjetos con agua y déjelo secar.

Usando un medio de montaje, coloque un deslizamiento de cubierta de vidrio sobre la guía. A continuación, observe las muestras con un microscopio fluorescente y capture imágenes de cada cámara en células no infectadas: solo el núcleo de los macrófagos es visible en las células infectadas. Los núcleos y canlas del parásito se pueden ver en el citoplasma celular que atestiguan la presencia de parásitos Donny intracelulares.

Para cuantificar la infección, utilice la imagen J para calcular el porcentaje de infectividad, que es el número de núcleos de cabra maestra am multiplicado por 100 sobre el número de núcleos de macrófagos para el ensayo de rescate del parásito. Primero lavar el cocultivo de la placa de 96 pocillos tres veces con medio RPMI libre de suero a células liso a 20 microlitros de 0.05% S-D-S-R-P-M-I. A cada pocillo agite el plato durante 30 segundos.

Luego agregue 180 microlitros de 10% F-B-S-R-P-M-I por pocillo. El tiempo de tratamiento con SDS no debe exceder los 30 segundos para obtener una lisis controlada del macrófago sin ningún efecto sobre la viabilidad de un maestro rescatado. Las cabras incuban la placa a 26 grados centígrados durante 48 horas para permitir la transformación y proliferación de las cabras rescatadas en cabras pro amo.

Para cuantificar las cabras pro master, agregue 10 microlitros de azul de alamar a cada pocillo de la placa de 96 pocillos e incube a 26 grados centígrados durante la noche. Después de esta incubación, cuantifique los parásitos vivos leyendo la placa en un fluorímetro de fluorescencia estándar. En ausencia de fármacos, el porcentaje de infección aumenta con el número de cabras maestras presentes en relación con el número de macrófagos.

Además, la cantidad de parásitos supervivientes determinada por el ensayo de rescate se correlaciona bien con el porcentaje de infección en presencia de concentraciones crecientes de anfotericina. B.El número de parásitos rescatados disminuye en función de la dosis. El ensayo de rescate y transformación del parásito se puede resumir con vistas microscópicas secuenciales.

Esta imagen muestra células intactas de THP one en cultivo infectadas con cabras Amma de exuberante manía. Estas células THP infectadas se someten a lisis controlada para rescatar cabras amma vivas. Las cabras Amma vivas rescatadas de las células infectadas THP en cultivo de transformación en cabras ProMaster.

Estas cabras ProMaster transformadas crecen y proliferan en la cultura. El número total de cabras ProMaster en cultivo es directamente proporcional al número de cabras oma, intracelulares vivas. Este ensayo ha sido optimizado para la licencia de control de células THV infectadas con limania.

El objetivo fue optimizar las condiciones para el tratamiento con detergente, que permitirá casi completar la lisis de las células THV one con un efecto mínimo sobre el TY de los códigos MST de rescate. Este paso es muy crítico en este ensayo. El demostrador de ensayo de rescate de parásitos aquí también se puede aplicar para airear la infectividad de diferentes especies de parásitos linia que causan ácido leishman cutáneo o mu cutáneo en diferentes líneas celulares de micro corazón, y también diferentes campos de lenia como aislados o líneas celulares de parásitos manipuladas genéticamente.

Tanto el rescate de parásitos como el análisis de imágenes como SA muestran resultados comparables. Tienen el potencial de automatización y aplicación para el cribado a gran escala. Hemos aplicado con éxito este ensayo para el cribado de más de 16.000 fracciones preparadas por fraccionamiento de alto rendimiento de productos naturales aceptados disponibles en nuestro centro.

También hemos optimizado el análisis de imágenes mediante la combinación de las imágenes capturadas bajo filtros DIC y fluoresceína y la cuantificación de la infección con la imagen IM j. Image J es un programa de procesamiento de imágenes basado en Java disponible públicamente desarrollado originalmente en los NIH. A través de este ensayo, se han identificado varias fracciones de productos naturales con compuestos novedosos como nuevas pistas para el descubrimiento del tracto interno.