Evaluación funcional de la motilidad intestinal y la inflamación de la pared intestinal en roedores: Análisis de un modelo estandarizado de manipulación intestinal

El objetivo general de los siguientes experimentos es realizar una manipulación intestinal para estudiar el desarrollo y la disolución del íleo postoperatorio en un modelo de roedores, esto se logra mediante la manipulación estandarizada del intestino delgado entre dos aplicadores de algodón húmedo. A continuación, se analiza el tránsito gastrointestinal y colónico para medir la motilidad postoperatoria. A continuación, se realiza un análisis histoquímico y un cultivo de órganos del intestino delgado muscular, externo o EM para examinar los niveles de inflamación.

Se obtienen resultados que muestran una fuerte infiltración de granulocitos de neutrófilos en el me y un exceso de producción de óxido nítrico en los cultivos de me, lo que resulta en retrasos en los tiempos de tránsito gastrointestinal y colónico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el desarrollo y la solución de ilios postoperatorios, y en la investigación de una posible profilaxis o terapia, La demostración del procedimiento estará a cargo de Mario Lewison, un técnico de nuestro laboratorio. Después de administrar 0,8 a 1% de isoflurano en oxígeno a un ratón macho. Coloque al animal en posición supina y use cinta adhesiva para fijar las extremidades.

Use un estímulo de dolor leve para probar la sedación profunda. A continuación, se realiza una laparotomía mediana, de dos centímetros de longitud. A continuación, inserte dos retractores estériles para mantener el abdomen abierto y coloque cuidadosamente el intestino delgado hacia la izquierda y colóquelo sobre una gasa de algodón húmeda.

Con dos aplicadores de algodón húmedos, evacúe el contenido luminal de todo el intestino delgado haciendo rodar simultáneamente los aplicadores desde el pori hasta el ciego. Vuelva a introducir la tripa en la cavidad peritoneal sin retorcerla para evitar isquemias u obstrucción mecánica o utilice dos capas de suturas continuas de poliamida 5.0 no absorbibles. Cierre la incisión abdominal.

Coloque al animal bajo una lámpara de calefacción y vigílelo hasta que se recupere de la anestesia. A continuación, vuelve a colocar al ratón en su jaula y permítele acceder a la comida y al agua. Al día siguiente.

Después de anestesiar completamente al ratón, extienda cuidadosamente su cabeza y use pinzas romas Para sacar la lengua, llene una jeringa de un mililitro con al menos 100 microlitros de dextrano marcado con fluoresceína. Conéctelo a un catéter arterial e inserte cuidadosamente el catéter como una sonda gástrica en el estómago. Inyecte rápidamente 100 microlitros de dextrano FITC y retire el catéter.

Permita que el animal recupere la conciencia y espere 90 minutos. Después de los 90 minutos, eutanasia al ratón y extirpe todo el tracto gastrointestinal desde el estómago hasta el recto. Coloque el intestino sobre una almohadilla de poliestireno y evite estirarse.

A continuación, mida toda la longitud del intestino delgado y el colon. Use cánulas para sujetar el intestino a la almohadilla de poliestireno. Divida el intestino delgado en 10 segmentos iguales y el colon en tres segmentos iguales.

Después de seccionar el intestino en las posiciones de marcha, enjuague las secciones una vez con un mililitro de Krebs heli, tampón de bicarbonato o KHB. Transfiera las secciones a tubos de dos mililitros marcados consecutivamente y centrifugue vigorosamente las sondas en vórtice. A continuación, transfiera el supernat a tubos limpios y numerados de 1,5 mililitros.

Almacenar a cuatro grados centígrados en la oscuridad hasta el análisis. Siguiente pipeta. Duplique cien alícuotas de microlitros de cada sobrenadante en una placa negra de 96 pocillos y use un lector de fluorescencia para leer la placa y verificar el tiempo de tránsito colónico después de anestesiar semanalmente al animal.

Examine cuidadosamente la permeabilidad del colon insertando una fístula. Pruebe a través del ano hasta el colon con la sonda. Inserte una bola de vidrio de dos milímetros, tres centímetros en el colon, y retire la sonda.

Inicie inmediatamente un temporizador. Coloque el ratón en una jaula transparente y vigílelo durante el tiempo que tarda la pelota en excretarse. Para el análisis histoquímico de muestras de la parte media del toal.

Después de cortar segmentos de tejido del intestino y sumergirlos en KHB frío en un plato lleno de silicona, use agujas de insectos para sujetar el mesenterio al plato. Corta los segmentos a lo largo de su borde mesentérico y estira el tejido hasta el 120% de su longitud y ancho. Asegure el tejido con agujas comenzando en el mesenterio. Mecánicamente.

Separar la muscular externa o yo de la mucosa túnica. Fijar y teñir las muestras de acuerdo con la parte escrita de este protocolo para cultivo. El yo.

24 horas después del procedimiento de manipulación intestinal, resecar todo el intestino delgado y colocarlo en frío, KHB que contiene penicilina, G y estreptomicina. Corta la tripa en trozos de tres centímetros y sujeta cada segmento en un plato de vidrio recubierto de silicona con unas tijeras finas. Retire el mesenterio y deslice el intestino sobre una aguja con pinzas afiladas.

Inci suavemente el me y con un aplicador de algodón húmedo. Quítelo de la submucosa y colóquelo en frío, KHB más Ps.A continuación, corte las tiras de ME en trozos de dos a cuatro milímetros de longitud e incube en KHB más PS frío como hielo durante 30 minutos. Enjuagar el espécimen varias veces.

A continuación, transfiera aproximadamente de 50 a 60 miligramos de mí a una placa estéril de 24 pocillos que contenga 500 microlitros de DMEM. Incubar el tejido a 37 grados centígrados y 5%CO2 durante 24 horas. Recoja el sobrenadante y centrifugue a 1000 RCF durante cinco minutos.

A continuación, congélelo en nitrógeno líquido para realizar mediciones de citocinas u óxido nítrico. Finalmente, usando una mancha de papel limpio, seque el tejido muscular durante 30 segundos y luego péselo. El parámetro más importante para evaluar la gravedad del íleo postoperatorio es el examen del tránsito gastrointestinal o TGI in vivo.

Esta figura muestra una distribución típica de dextrano FITC a lo largo del tracto gastrointestinal en ratones controles no tratados y ratones manipulados intestinalmente 24 horas después de la cirugía. Como se muestra aquí, los animales operados simuladamente mostraron un TGI normal con un centro geométrico calculado en el ciego. Mientras que la IM condujo a un retraso significativo en el TGI en el yeyuno proximal, en el análisis de la motilidad colónica utilizando una bola de vidrio, los ratones operados simuladamente excretaron la bola en 48 a 200 segundos, y la IM prolongó el tiempo de excreción a 470 a 775 segundos para medir la inflamación.

Dentro de la EM, los niveles de leucocitos se analizaron mediante histoquímica o inmunohistoquímica como se ve aquí. Se observaron pocos neutrófilos polimorfonucleares en ratones control, sin embargo, el intestino delgado condujo a su fuerte infiltración. Muchos mediadores inflamatorios liberados de las células son difíciles de detectar en los tejidos.

Los cultivos de órganos lisados permiten la detección de marcadores inflamatorios en el cultivo. El sobrenadante, un mediador representativo en la POI es el óxido nítrico, o no, que es un neurotransmisor inhibidor importante en el tracto gastrointestinal. Esta figura muestra que no se pudo detectar nno en mí.

Se observaron cultivos de órganos, sobrenadantes de control, animales en ratones operados simuladamente, niveles de nno basal. Sin embargo, los cultivos de ratones manipulados intestinalmente producen significativamente más nno después de una incubación de 24 horas una vez dominados. Esta técnica de manipulación intestinal se puede realizar en 15 minutos si se realiza correctamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir íleo postoperatorio en ratones y cómo analizar su gravedad.