Evaluación funcional de la motilidad intestinal y la inflamación de la pared intestinal en roedores: Análisis de un modelo estandarizado de manipulación intestinal

El objetivo general de los siguientes experimentos es realizar una manipulación intestinal para estudiar el desarrollo y la resolución del íleo posoperatorio en un modelo de roedor; esto se logra mediante la manipulación estandarizada del intestino delgado entre dos aplicadores de algodón húmedos. A continuación, se analizan el tránsito gastrointestinal y el tránsito colónico para medir la motilidad posoperatoria. Luego, se realiza un análisis histoquímico y un cultivo de órganos de la capa muscular de la pared del intestino delgado, la túnica externa o la me, para examinar los niveles de inflamación.

Se obtienen resultados que muestran una fuerte infiltración de granulocitos neutrófilos en el me y una producción excesiva de óxido nítrico en cultivos de me, lo que provoca retrasos en los tiempos de tránsito gastrointestinal y colónico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el desarrollo y la solución del íleo posoperatorio, así como en la investigación de posibles medidas profilácticas o terapias. El procedimiento será demostrado por Mario Lewison, un técnico de nuestro laboratorio. Después de administrar 0,8 a 1 % de isoflurano en oxígeno a un ratón macho, coloque al animal en posición supina y utilice cinta adhesiva para fijar las extremidades.

Utilice un leve estímulo doloroso para evaluar la sedación profunda. A continuación, realice una laparotomía mediana de dos centímetros de longitud. Luego, inserte dos retractores estériles para mantener abierta la cavidad abdominal y exteriorice cuidadosamente el intestino delgado hacia la izquierda, colocándolo sobre gasa húmeda.

Utilizando dos aplicadores de algodón húmedos, evacúe el contenido luminal de todo el intestino delgado girando simultáneamente los aplicadores desde el pori hasta el ciego. Devuelva el intestino a la cavidad peritoneal sin torsión para prevenir isquemia u obstrucción mecánica, y cierre con dos capas de suturas continuas no absorbibles de poliamida 5.0. Cierre la incisión abdominal.

Coloque al animal bajo una lámpara de calor y monitórelo hasta que se recupere de la anestesia. Luego, devuelva al ratón a su jaula y permita que tenga acceso a alimento y agua. Al día siguiente.

Después de anestesiar completamente al ratón, extienda cuidadosamente su cabeza hacia atrás y use pinzas romas para sacar la lengua; llene una jeringa de un mililitro con al menos 100 microlitros de dextrano marcado con fluoresceína. Conéctela a un catéter arterial e inserte cuidadosamente el catéter, como si fuera una sonda gástrica, en el estómago. Inyecte rápidamente 100 microlitros de dextrano marcado con FITC y retire el catéter.

Permita que el animal recupere la conciencia y espere 90 minutos. Después de los 90 minutos, sacrifique al ratón y extraiga todo el tracto gastrointestinal desde el estómago hasta el recto. Coloque el intestino sobre una placa de poliestireno y evite estirarlo.

A continuación, mida la longitud total del intestino delgado y del colon. Utilice cánulas para fijar el intestino sobre la almohadilla de poliestireno. Divida el intestino delgado en 10 segmentos iguales y el colon en tres segmentos iguales.

Después de seccionar el intestino en las posiciones indicadas, enjuague las secciones una vez con un mililitro de buffer de Krebs bicarbonato, o KHB. Transfiera las secciones a tubos de dos mililitros etiquetados consecutivamente y vortexe vigorosamente; luego centrifugue las muestras. A continuación, transfiera el sobrenadante a tubos limpios de 1,5 mililitros numerados.

Almacene a cuatro grados Celsius en la oscuridad hasta el análisis. A continuación, pipete. Duplique alícuotas de cien microlitros de cada sobrenadante en una placa negra de 96 pocillos y utilice un lector de fluorescencia para leer la placa y verificar el tiempo de tránsito colónico tras anestesiar semanalmente al animal.

Examine cuidadosamente la permeabilidad del colon insertando una fístula. Introduzca la sonda a través del ano hacia el colon utilizando la sonda. Inserte una bola de vidrio de dos milímetros, tres centímetros dentro del colon, y retire la sonda.

Comience inmediatamente un temporizador. Coloque el ratón en una jaula transparente y obsérvelo durante el tiempo que tarde en excretar la bola. Para el análisis histoquímico de muestras mediototales.

Después de cortar segmentos de tejido del intestino y sumergirlos en KHB frío en un recipiente con fondo de silicona, utilice agujas para insectos para fijar el mesenterio al recipiente. Corte los segmentos a lo largo del borde mesentérico y estire el tejido hasta un 120 % de su longitud y anchura. Sujete el tejido con agujas comenzando por el mesenterio. Mecánicamente.

Separar la muscularis externa o me de la túnica mucosa. Fijar y teñir las muestras según la parte escrita de este protocolo para el cultivo. El me.

24 horas después del procedimiento de manipulación intestinal, reseque todo el intestino delgado y colóquelo en KHB frío que contenga penicilina, G y estreptomicina. Corte el intestino en segmentos de tres centímetros de longitud y sujete cada uno sobre un recipiente de vidrio recubierto de silicona utilizando tijeras finas. Retire el mesenterio y deslice el intestino sobre una aguja oscilante con pinzas finas.

Corte suavemente la ME utilizando un aplicador de algodón húmedo. Séquela de la submucosa y colóquela en KHB frío más Ps. A continuación, corte las tiras de ME en trozos de dos a cuatro milímetros de longitud e incube en KHB helado más PS durante 30 minutos. Enjuague la muestra varias veces.

Luego, transfiera aproximadamente de 50 a 60 miligramos de me a una placa estéril de 24 pocillos que contenga 500 microlitros de DMEM. Incube el tejido a 37 grados Celsius y 5 %CO2 durante 24 horas. Recopile el sobrenadante y centrifugue a 1000 RCF durante cinco minutos.

Luego, rompa rápidamente y congele en nitrógeno líquido para mediciones de citocinas o óxido nítrico. Finalmente, usando un trozo limpio de papel absorbente, seque el tejido muscular durante 30 segundos y luego péselo. El parámetro más importante para evaluar la gravedad del íleo posoperatorio es el examen del tránsito gastrointestinal o TGI in vivo.

Esta figura muestra una distribución típica del dextrano marcado con FITC a lo largo del tracto gastrointestinal en controles no tratados y en ratones con manipulación intestinal, 24 horas después de la cirugía. Como se observa aquí, los animales sometidos a cirugía simulada mostraron un tránsito gastrointestinal normal, con un centro geométrico calculado en el ciego. Mientras que la Im provocó un retraso significativo en el tránsito gastrointestinal en el yeyuno proximal; en el análisis de la motilidad colónica mediante una bola de vidrio, los ratones sometidos a cirugía simulada expulsaron la bola entre 48 y 200 segundos, y la Im prolongó el tiempo de expulsión entre 470 y 775 segundos para medir la inflamación.

En el intestino delgado, los niveles de leucocitos se analizaron mediante histoquímica o inmunohistoquímica, como se observa aquí. Se observaron pocos neutrófilos polimorfonucleares en los ratones control; sin embargo, la lesión del intestino delgado provocó una infiltración intensa. Muchos mediadores inflamatorios liberados por las células son difíciles de detectar en el tejido.

Los cultivos de lisados de órganos permiten la detección de marcadores inflamatorios en el cultivo. El sobrenadante, un mediador representativo en el íleo postoperatorio, es el óxido nítrico, o NO, que es un neurotransmisor inhibitorio importante en el tracto gastrointestinal. Esta figura muestra que NO no pudo detectarse en ME.

En el cultivo de órganos, en los sobrenadantes de controles y en animales de ratones sometidos a cirugía simulada, se observaron niveles basales de nno. Sin embargo, los cultivos de ratones con manipulación intestinal producen significativamente más nno tras una incubación de 24 horas. Una vez dominada, esta técnica de manipulación intestinal puede realizarse en menos de 15 minutos si se lleva a cabo correctamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir el íleo posoperatorio en ratones y cómo analizar su gravedad.