Name: No plasmáticos de unión de PDMS para la Fabricación de bajo costo de los dispositivos de microfluidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-11-01T00:41:54.000+00:00
Duration: 4 min 45 s
Description: Aprende a unir dispositivos microfluídicos de neuronas a vidrio sin plasma usando PDMS y fuerzas electrostáticas. Este método reversible y económico crea sellos herméticos para cultivos celulares sin equipamiento costoso.

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La preparación de dispositivos de microfluídica para el cultivo celular neuronal 1) Limpiar Corning N º 1 de 24 mm X 40 mm portaobjetos de vidrio <ul><li> Sonicar el portaobjetos de vidrio en un baño de ultrasonido agua durante 30 minutos </li><li> Enjuague el portaobjetos de vidrio con un 70% EtOH </li><li> Lavar los portaobjetos tres veces con dH 2 O </li><li> Portaobjetos secos en una campana de cultivo de tejidos durante varias horas, preferiblemente durante la noche </li></ul> Nota: Hemos bandejas especiales de metal que se carga con las diapositivas. Las diapositivas están separados de forma individual y se coloca en las ranuras de esta rejilla de metal. A continuación, puede colocar las bandejas de carga de metal en un recipiente de vidrio que se llenan de agua, lugar en el baño de ultrasonido de agua, y someter a ultrasonidos durante 30 minutos. Lavados posteriores se llevan a cabo en este plato. 2) Preparación de los dispositivos de PDMS <ul><li> Cortar el molde de PDMS de la oblea de silicio, hacer agujeros en el reparto PDSM y cuarto que </li><li> Limpiar los dispositivos PDMS primero soplando gas inerte (argón o nitrógeno) a través de ellos. A continuación, utilice la marca 3M Scotch 471 cintas para despegar cualquier residuo restante </li></ul> Nota: Es importante mantener los dispositivos boca arriba. Al principio, cuando cortamos el PDMS lejos de la oblea de silicio, la superficie en contacto con la oblea es el lado limpio: contiene los canales de microfluidos. Tratamos de ser lo más cuidadoso que nosotros, como puede para no dañar el dispositivo y mantener la cara de la limpieza hasta que estemos listos para la unión de plasma. <ul><li> Dispositivos de autoclave en recipientes de plástico </li><li> Después del autoclave, limpia No. 1 portaobjetos de vidrio Corning y el tratamiento de plasma-dispositivos que utilizan una marca de limpiador de plasma Harrick, <a href="http://www.harrickplasma.com/" target="_blank">www.harrickplasma.com</a> </li><li> Coloque los dispositivos de limpieza hacia abajo en el portaobjetos de vidrio. </li></ul> El dispositivo está ahora en plasma unida a la lámina de vidrio. 3) Los dispositivos de recubrimiento con poli L-lisina (PLL) <ul><li> PLL se agrega a un pozo en cada lado del dispositivo y permite que fluya a través de en el pozo siguiente </li></ul> =&gt; 150 ml de PLL para los grandes pozos y 30 μ l PLL para los pozos más pequeños. No tiene por qué ser exacta, siempre y cuando los pozos están llenos. Nota: Si nos fijamos en un dispositivo que se va a ver cuatro pozos: cada dos están conectados. ¿Quieres poner el PLL en un pozo para que fluya a través del dispositivo en el pozo siguiente. <ul><li> Deje que el PLL para el flujo a través del dispositivo durante unos 10 minutos y luego añadir más PLL a los pozos para llenarlos </li><li> Colocar los dispositivos que contienen PLL en una incubadora a 37 ° C durante un mínimo de 4 horas (una noche es preferible) </li><li> Aspire el exceso de PLL después del tratamiento, pero tenga cuidado de no aspirar todo el líquido fuera del dispositivo </li></ul> Nota: No es aconsejable introducir burbujas de aire a los canales o de la cámara. Sólo vacío el exceso de PLL en los pozos. <ul><li> Añadir autoclave dH 2 O a cada bien en cada lado del dispositivo y permitir que fluya hacia el otro pozo por capilaridad </li></ul> La figura 1 es un diagrama de un dispositivo de microfluidos. Observe cómo el azul (Soma lado) está conectado y el rojo (lado axonal) están conectados. Cuando hablamos de poner el PLL, el agua o los medios de comunicación, en un pozo en cada lado del dispositivo, lo que queremos decir, por ejemplo, es la siguiente: Coloque 150 ul de autoclave dH 2 O en un Pozo Azul y coloque 150 ml de autoclave dH 2 0 en una Red Well. El agua (o PLL, o los medios de comunicación, o células) fluirá a través del dispositivo a la fuente correspondiente otros. <img src="/files/ftp_upload/old/410_2008_8_27_3/410_Figure-01.png" alt="Figura 1" width="362" height="216" /> Figura 1 Nota: Tenga en cuenta que, a partir de ahora, cuando digo &quot;los medios de comunicación el lugar, las células, el agua o el PLL en el TOP pozos&quot;, me refiero al diagrama de arriba, donde el Soma se encuentra a la izquierda y los axones crecerán a la derecha. <ul><li> Aspirar el agua (de nuevo teniendo cuidado de no eliminar por completo todo el líquido desde el dispositivo), a continuación, añadir otra l 150 de autoclave dH 2 O a uno de cada bien conectados y permitir que fluya a través de la correspondiente así. </li><li> Coloque el dispositivo que contiene dH 2 O en una incubadora a 37 ° C durante 1 hora, y luego repetir la etapa de lavado de nuevo. Lavar los dispositivos de tres veces con dH 2 O durante una hora cada uno, que es el total. </li></ul> Nota: Debido a la posibilidad de que el borato de la PLL se puede absorber en el PDMS, algunos en el Laboratorio de Jeon recomienda incubar los dispositivos durante la noche con autoclave dH 2 O después de un par de initial enjuagues rápida. Esto asegurará que todos los boratos se filtre fuera de la PDMS antes de la carga de las células. Si no se hace esto, puede haber una liberación de borato en los medios de comunicación a través del tiempo, lo que podría llevar a la citotoxicidad. <ul><li> Añadir Neural medio basal (NBM), con los factores necesarios (glutamax, B27, Penstrep) a los pozos de alto </li></ul> Nota: Los dispositivos pueden ser incubados durante la noche y recubierto de células al día siguiente, o se incuban con un mínimo de 3 horas con NMB + factores de las placas, las células. La preparación de las neuronas de carga en los dispositivos Utilizamos 18 días de edad corteza de rata fetal que, o bien comprar a una empresa llamada Bits del cerebro y de que se prepara aquí en el campus para nosotros. Nosotros preferimos obtener el tejido fresco. <ol><li> Obtener una corteza cerebral fetal (2 piezas de tejido) almacenados en Hibernate E </li><li> Tomar 3 pipetas de vidrio largo y el fuego a cada uno en tamaños cada vez más pequeños con una lámpara de alcohol </li><li> eliminar los tejidos de Hibernate E con una pipeta de vidrio y el lugar en 2 ml de NMB + Factores en un tubo estéril de 15 ml. </li><li> La trituración: Con una pipeta de vidrio bombilla y la corteza se pasa arriba y hacia abajo alrededor de 5 a 10 veces. Entonces, la pipeta más pequeño siguiente se utiliza para pipeta y el tejido. Por último, la más pequeña pipeta se utiliza para la pipeta y el tejido. Nos gusta para asegurarse de que no hay trozos visibles. Nota: Recientemente, el Laboratorio de Jeon comenzó a comparar las células de los tejidos almacenados en Hibernate E a las células que se han preparado a partir de los tejidos tratados inicialmente con 0,125% de tripsina en el 50% de Ca + + libre y Mg + + buffer disección de forma gratuita. El consenso es que el tejido preparado con tripsina producir células más viable que el tejido situado inicialmente en Hibernate E. Si no se va a utilizar el tejido de inmediato, entonces usted necesita para almacenar los tejidos en Hibernate E. Si usted va a utilizar el tejido de inmediato y le gustaría una mayor viabilidad, a continuación, tratar el tejido con tripsina antes de la trituración mecánica de la siguiente manera: 1) se diluye 1 ml de tripsina 0,25% (Gibco, Invitrogen) con 1 ml de Ca + + libre de Mg + + gratis buffer disección (final tripsina = 0,125%) en un tubo de 15 ml (mantener frío el hielo), 2) los tejidos lugar en el buffer e incubar inmediatamente a 37 º C durante 8 minutos, 3) agregar 10 ml DMEM/10% de SFB para detener la tripsina reacción y seguir el protocolo a continuación. </li><li> Las células se centrifugan a 1100 rpm durante 1 minuto </li><li> Los medios de comunicación aspirado cuidadosamente de la bolita de células </li><li> Añadir 1 ml de la NMB + factores de la pastilla y re-suspendido por pipeteando arriba y abajo </li><li> Pase la suspensión de células re-por gravedad a través de un filtro para eliminar los grumos (BD Falcon células colador de nylon 40 um) </li><li> Conde y células de la placa: <ul><li> En un tubo de microcentrífuga, añadir 60 NMB l + factores, 20 l de suspensión celular, y 20 l de azul de tripano y mezclar </li><li> Añadir unos 10 l de esta solución a un hemocitómetro y contar las células vivas (no azules) </li><li> Ajuste la concentración de 2,5 a 4,5 x 10 6 células / ml Nota: Por lo general, obtener una concentración de aproximadamente 2,5 a 4,5 x 106 células / ml. dependiendo del volumen de las células se resuspenden en (normalmente 1 ml NBM + B27/Glutamax/PenStrep percortex). Si el tejido ha sido elaborado con la tripsina, la producción probablemente se incrementará. </li></ul></li></ol> Revestimiento Los dispositivos <ol><li> Las celdas de carga (neuronas primarias) en un pozo del dispositivo </li><li> Placa de 5 l por dispositivo pequeño y 20 l por aparato grande Nota: Puede cargar 10 l de células en la parte superior del dispositivo y 10 l en la parte inferior del dispositivo (volumen total medio), o directamente a todos l 20 de las células en la parte superior y cromosómicas (5 l en la parte superior y cromosómicas para los dispositivos pequeños). </li><li> Incubar durante 10 minutos en una incubadora a 37 ° C lo que las células pueden empezar a colocar </li><li> Añadir l aproximadamente 150/30 de factores + NMB a cada pocillo, dependiendo del tamaño del dispositivo Nota: Los volúmenes pueden variar dependiendo del espesor de la PDMS. Todo lo que importa es que los pozos están llenos. </li></ol> Suplementario Acerca del uso de los dispositivos sin vinculación Plasma Sin el tratamiento de plasma, Christina Tu, un técnico, que lo hace con éxito todas las semanas sin plasma, dice que la carga sólo a las células de inmediato. Recuerde que debe eliminar los medios de comunicación tanto de los pozos en el lado del soma (parte del axón no importa si deja los medios de comunicación). Es el flujo de fluido que permite a las células para entrar en el canal principal. Si usted tiene los medios de comunicación en los pozos, no obtendrá el flujo de fluidos.

<ol><li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nat Protoc. 1 (4), 2128-2136 (2006).</li>
<li>Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí se demuestra cómo utilizar el dispositivo de microfluidos neuronas sin necesidad de un limpiador de plasma. Nos referimos a esta unión como no plasma.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Reactivo</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Sylgard 184 con agente de curado. Consulte a Dow Corning para encontrar un distribuidor cercano</td></tr><tr><td>Cornig No. 1 Cover Glass</td><td>Cubreobjetos</td><td>Corning</td><td>Corning No. X2935 244</td><td>Disponible a través de Fisher Scientific, número de catálogo de Fish 12-531D</td></tr><tr><td>B27</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>B27 es un suplemento comercial disponible a través de Invitrogen bajo su línea Gibco de reactivos para cultivo celular.</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>Glutamax está disponible a través de Invitrogen bajo su línea Gibco de reactivos para cultivo celular.</td></tr><tr><td>Placa de Petri de 60 mm</td><td>Herramienta</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13A</td><td>Se utilizan placas de Petri estériles de poliestireno de 60 mm para alojar el dispositivo unido al vidrio.</td></tr><tr><td>Polilisina</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1274</td><td></td></tr><tr><td>Tubo BD Falcon de 50 ml</td><td>Herramienta</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon No. 352098</td><td>Disponible a través del número de catálogo de Fisher Scientific 14-959-49A</td></tr><tr><td>Tubo BD Falcon de 15 ml</td><td>Herramienta</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon No. 352097</td><td>Disponible a través del número de catálogo de Fisher Scientific 14-959-70C</td></tr></tbody></table>

no plasmáticos de unión de pdms para la fabricación de bajo costo de los dispositivos de microfluidos

Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices

En este video, que muestra cómo utilizar el dispositivo de microfluidos neuronas sin la unión de plasma. En algunos casos puede ser conveniente a los dispositivos de forma reversible de bonos para el vidrio Corning No. tapa 1. Esto puede ser debido, tal vez, a un limpiador de plasma que no están disponibles. En otros casos, puede ser deseable para quitar el dispositivo de la copa después de que el cultivo de neuronas de ciertos tipos de microscopio o de inmunotinción, aunque no es necesario remover el dispositivo para la tinción de las neuronas ya que se puede teñir en el dispositivo. Algunos investigadores, sin embargo, todavía prefieren a retirar el dispositivo. En este caso, la unión reversible del dispositivo a la cubierta de vidrio hace que sea posible. Hay algunas desventajas de no plasma la unión de los dispositivos en que no tan fuerte de un sello se forma. En algunos casos, los axones pueden crecer en las ranuras en vez de a través de ellos. Además, como el vidrio y PDMS son hidrofóbicos, los líquidos no fácilmente entrar en el dispositivo por lo que es necesario a veces para obligar a los medios de comunicación y otros reactivos en el dispositivo. Líquidos entrarán en el dispositivo a través de la acción capilar, pero tarda mucho más en comparación con los dispositivos que se han plasma en condiciones de servidumbre. El limpiador de plasma crea temporal cargos hidrofílico en el cristal y el dispositivo que facilite el flujo de líquidos a través del dispositivo después de la unión en cuestión de segundos. Para los que no plasma dispositivos vinculados, el flujo de líquido a través de los dispositivos de toma varios minutos. También es importante tener en cuenta que los dispositivos que se utilizan con las organizaciones no plasma la unión deben ser esterilizados en primer lugar, mientras que los dispositivos de plasma tratados no deben ser esterilizados antes de su uso debido a que el limpiador de plasma esterilizarlos.

En este video se muestra cómo utilizar el dispositivo de microfluidos neuronas sin la unión de plasma.

No plasmáticos de unión de PDMS para la Fabricación de bajo costo de los dispositivos de microfluidos

En este video, demostramos cómo utilizar el dispositivo microfluídico para neuronas sin realizar un sellado por plasma. En algunos casos, puede ser deseable realizar un sellado reversible...

Los laboratorios que habitualmente realizan fotolitografía y litografía suave suelen disponer de lo que se conoce como limpiador de plasma. Un limpiador de plasma posee una bobina eléctrica que genera un gas parcialmente ionizado compuesto por electrones, iones, átomos y moléculas neutros. El plasma crea especies reactivas en la superficie del vidrio y del dispositivo, las cuales, cuando se colocan juntos, formarán un enlace permanente.El plasma también hace que la superficie del dispositivo sea hidrofílica, lo que facilita la adición de líquidos. En algunos casos, sin embargo, no es deseable un enlace permanente e irreversible. Además, muchos laboratorios no tienen acceso a un limpiador de plasma.Para abordar esta preocupación hoy, se demostrará la unión reversible no plasmática del dispositivo neuronal al portaobjetos, donde las fuerzas electrostáticas entre el PDMS y el vidrio forman un sello hermético y adecuado para el cultivo celular. Me gustaría presentarles a Kiana Lee. Ella realizará las demostraciones hoy.Las laminillas Corning número 1 de 24 milímetros por 40 milímetros se limpian utilizando una sonicación en baño de agua. Los vidrios se colocan en un portaportas de acero inoxidable que luego se introduce en un recipiente de vidrio lleno con agua desionizada. El recipiente de vidrio se coloca entonces en el baño de sonicación. Las laminillas de vidrio se someten luego a sonicación durante 30 minutos. Después de la sonicación, se descarta el agua desionizada del recipiente de vidrio. Se coloca etanol al 70 % en el recipiente de vidrio con las laminillas, que luego se introduce en una cabina de seguridad biológica estándar para mantenerlas estériles.Después de enjuagar con etanol al 70 %, se retira el estante de acero inoxidable del recipiente de vidrio y se dejan secar completamente las portaobjetos de vidrio durante varias horas o durante la noche. A continuación, dentro de la cabina de seguridad biológica, se recubren las portaobjetos de vidrio con PLL sumergiéndolas en un recipiente lleno de solución de PLL. Se deja remojar las portaobjetos de vidrio en la solución de PLL durante un mínimo de tres horas o durante la noche.Después del recubrimiento con PLL, se retira el líquido de PLL del recipiente y luego se enjuagan cuidadosamente las laminillas de vidrio con agua desionizada. Después de enjuagar varias veces la laminilla de vidrio recubierta con PLL con agua, se llena el recipiente con agua y se deja remojar las laminillas de vidrio durante varias horas. Tras remojar durante varias horas en agua desionizada, se aspira el agua del recipiente.Las laminillas de vidrio se enjuagarán rápidamente y luego se retirarán del recipiente, colocándose en una rejilla de acero inoxidable y dejándose secar durante la noche. En una cabina de seguridad biológica, los dispositivos para neuronas se introducen en la cabina y se enjuagan cuidadosamente con etanol al 70 % para esterilizarlos. A continuación, se aspira el exceso de etanol del dispositivo. Luego, los dispositivos se dejan secar durante la noche dentro de la cabina de seguridad biológica al día siguiente.Este dispositivo estéril para neuronas se coloca simplemente sobre el vidrio limpio, estéril y tratado con PLL. El PDMS forma un sello reversible con el vidrio que es hermético al líquido. El dispositivo se une al vidrio aplicando presión suave, y luego se añaden inmediatamente las células o el medio al dispositivo.Esperar demasiado tiempo para agregar medio o células al dispositivo después del ensamblaje puede dificultar que el líquido ingrese al dispositivo. Es importante tener en cuenta que el líquido no entra fácilmente en los dispositivos no tratados con plasma tan rápidamente como en un dispositivo tratado con plasma. Los dispositivos tratados con plasma son inicialmente hidrofílicos justo después del tratamiento con plasma, y los líquidos fluyen fácilmente hacia el interior del dispositivo hidrofílico, mientras que el flujo a través de los dispositivos no unidos con plasma es mucho más lento.En algunos casos, puede ser necesario utilizar una pipeta para forzar el líquido hacia el dispositivo. En este video, le hemos mostrado cómo unir sin plasma el dispositivo neuronal al cubreobjetos. Este es un método eficiente y económico para unir de forma reversible BLO, PDMS a superficies de vidrio.Esperamos que este video le haya resultado informativo y útil. Eso es todo desde el John Lab. Gracias por vernos.

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