Generación, purificación y caracterización de especies invasivas en células de proteína DISC1

El objetivo general de los siguientes procedimientos es generar un disco purificado. Un agregado capaz de invadir las células receptoras. Con el primer método se demostrarán dos métodos diferentes para lograr este objetivo.

La proteína de fusión del disco uno de la proteína fluorescente formadora de asomas está sobreexpresada en las células donantes de neuroblastoma humano NLF. A continuación, las células se lavan con PBS recogidas y se depositan sin el uso de detergentes. El ADN se digiere y las zonas agrícolas se purifican mediante un sistema de gradiente de sacarosa.

Los Agrios purificados por este método tienen una baja eficiencia de invasión celular. El enfoque alternativo es sobreexpresar los aminoácidos 5 98 a 7 85 de la proteína recombinante del disco uno en E. coli. A continuación, el fragmento de proteína se marca con DITE 5 94, se dializa y se purifica utilizando una matriz NTA de NI, que elimina cualquier disco multimérico de colorante no unido restante.

Uno de los fragmentos generados por este método tiene una alta eficiencia de invasión celular para evaluar la invasión de la célula huésped. Ya sea el disco de proteína fluorescente purificado, un risomes o el disco recombinante marcado. Un fragmento se incuba con las células receptoras de interés.

A continuación, se añade azul de Trian para apagar la fluorescencia extracelular y la invasión se visualiza mediante microscopía confocal. Hasta ahora, la agregación de proteínas no ha sido una característica reconocida de las enfermedades mentales crónicas como la esquizofrenia. Mientras que en la esquizofrenia una proteína es una célula candidata, la invasividad de los agregados de proteínas es una característica distintiva de las enfermedades de confirmación de proteínas.

Aquí mostramos con dos métodos que los agregados de proteínas del disco uno son invasivos celulares y, por lo tanto, que los trastornos relacionados con el disco uno o las neuropatías del disco uno son trastornos de confirmación de proteínas. Los dos métodos son, en primer lugar, la purificación de un disco de longitud completa, un ASOS a partir de líneas celulares de neuroblastoma y, en segundo lugar, la expresión de un disco multimérico terminal C. Un fragmento en E. coli, así como la purificación y el marcaje con el tinte fluorescente.

Mientras que el primer método sólo conduce a una invasión celular de baja eficiencia del 0,3% de las células que absorben los microsomas purificados, el fragmento de proteína pura recombinante infecta hasta el 20% de las células expuestas. Los métodos descritos aquí deberían ser transferibles a otras proteínas en las que se haya demostrado de manera convincente la formación de acrosomas o el ensamblaje multimérico. En cada uno de los platos de 10 a 10 centímetros.

Siembre 1,5 veces 10 a las seis células de neuroblastoma humano y LF en medio RPMI 1640 suplementado y crezca durante la noche. Al día siguiente, las células deben estar confluentes entre un 70 y un 80%, marcar cinco placas para la transfección con PC DNA 3.1, MRFP y EGFP, marcar con disco humano de longitud completa uno y cinco para la transfección con plásmido EGFP solo. Por cada plato de 10 centímetros, combine 15 microgramos de ADN plasmídico de 30 microlitros y 750 microlitros.

Opti MEM en un tubo de micro centrífuga y se fabrica pipeteando hacia arriba y hacia abajo, incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Luego, para transfectar las células, agregue la solución reactiva de transfección de ADN, gota a gota a las células, incube las células a 37 grados Celsius con 5% de CO 2 48 horas después de la transfección, monitoreó la expresión de MRFP disco uno de longitud completa y confirmó la formación de zonas agrícolas bajo un microscopio de fluorescencia. Algunas células albergan una inclusión masiva de proteínas fluorescentes, como se muestra aquí.

Este protocolo combina un método para purificar cuerpos de Lewy a partir de tejido cerebral y el protocolo para aislar agregados más grandes o agrozonas, ya que los métodos ya existentes se basan en el uso de detergentes, el aislamiento de proteínas libres de detergente para la aplicación en ensayos de invasividad celular es crítico. A continuación, aspire el lavado medio con PBS y agregue 400 microlitros de PBS que contiene cóctel de inhibidores de proteasa. A continuación, raspe las células y añada un mililitro de suspensión celular y 10 perlas de cerámica a un tubo de lisis de dos mililitros.

Lis las células utilizando tres pulsos de 62 en un homogeneizador de lisa 24 precelular. La fuerza mecánica del proceso puede aumentar la temperatura dentro de la muestra por encima de los 37 grados centígrados. Por lo tanto, se debe tener cuidado de enfriar la muestra en hielo Después del procedimiento de lisis, después de enfriar las células en hielo, agregue 10 milimolares de cloruro de magnesio 40 unidades por mililitro de ADN e incube durante 60 minutos a 37 grados centígrados con agitación.

Prepare 10 mililitros de 80%, 50% y 20% de peso de sacarosa por volumen en PBS. Luego, en un tubo cónico de 15 mililitros, prepare el gradiente de sacarosa comenzando con dos mililitros de sacarosa al 80%, seguidos de dos mililitros de sacarosa al 50% y dos mililitros de sacarosa al 20%. Vierta el degradado lentamente y tenga cuidado de no alterar las capas ya vertidas.

A continuación, coloque el lisado digerido sobre el gradiente y centrifugue durante 15 minutos a 1000 veces G a cuatro grados centígrados. Una vez desactivada la ruptura, recoja cuidadosamente la interfaz entre la capa de sacarosa del 50 al 80% con una pipeta y mezcle con cinco volúmenes de una centrífuga de tubo cónico de 15 mililitros durante 15 minutos a 1000 veces G a cuatro grados centígrados. Retire con cuidado el sobrenadante y mantenga la zona agrícola que contiene pellets.

Repita el lavado dos veces más en esta interfaz. Las zonas agrícolas son fluorescentes y se pueden visualizar en el microscopio bajo luz ultravioleta después del último lavado, desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 250 a 500 microlitros de PBS. Este pellet contiene las zonas agro purificadas.

Agregue 10 microlitros de disco MRFP, una suspensión de asome a cada pocillo de una placa de 24 pocillos que contiene células de neuroblastoma humano SHSY cinco Y. Expresando constitutivamente el disco soluble de GFP uno C terminal en cubreobjetos de vidrio estéril e incubar durante 48 a 72 horas después de la incubación. Lave las células tres veces con PBS y apague la fluorescencia extracelular con azul de trian al 0,04% durante cinco minutos.

A continuación, lavar con PBS para eliminar el azul triano. A continuación, coloque el plato en hielo y agregue 4% de PFA y PBS durante 10 minutos para fijar las celdas. A continuación, lavar una vez con agua estéril y montar los cubreobjetos en portaobjetos de vidrio con oro prolongado con medio de montaje DPI.

Confirmar la absorción en la invasión de exógenamente. Zonas de agresión aplicadas por colocalización con proteínas reclutadas expresadas por células receptoras en imágenes de Zack. Este Zack abarca aproximadamente seis micrómetros de profundidad.

24 imágenes tomadas en pasos de 200 nanómetros. La fluorescencia del disco MRFP en una zona agri que se muestra en rojo recluta el disco terminal citosólico de GFPC. Un fragmento mostrado en colocalización verde se presenta como amarillo e indica que las zonas agrícolas han entrado en el citosol receptor y han reclutado la proteína del disco uno, anteriormente soluble.

En esta parte del protocolo, el disco humano uno estará etiquetado con DITE 5 94. Esta D permite la monitorización directa de la proteína recombinante sin necesidad de tinción inmunológica adicional. Comience por liberar la proteína preparada como se describe en el documento adjunto del mercaptoetanol en vara, dializándola tres veces en dos litros de PBS a una dilución de uno a 2000.

Junto a la etiqueta, un disco de miligramos, uno con DITE 5 94 IDE, disuelva un miligramo por mililitro de proteína en PBS y agregue cinco milimolares de TCEP para recuperar los grupos TH libres, agregue 20 microlitros del colorante disuelto DMF a la reacción e incube durante dos horas a temperatura ambiente usando un casete de diálisis SLI con un corte de peso molecular de 10, 000. Daltons dializa la proteína tres veces en PBS en una proporción de uno a 2000 durante dos horas cada vez. A continuación, para aumentar aún más la pureza de la proteína marcada.

Se realiza una purificación de afinidad basada en etiquetas de silbido en una columna NTA de NI. Lavar un mililitro de matriz NI NTA con 10 mililitros. A continuación, PBS aplica la proteína de dializado marcada a la columna y deja que corra sobre ella.

Lentamente, la solución perderá una parte de su color azul debido a la unión de la proteína a la matriz NTA, el colorante libre no marcado permanecerá en el flujo. Una vez introducida la solución proteica. La columna, lavar la columna tres veces con 20 mililitros de PBS para eluir la proteína, agregue dos mililitros de PBS que contengan 500 milimolares ole a la columna.

Ajuste la válvula a velocidad lenta y eluya gota a gota mientras monitorea la banda coloreada en la columna N NI NTA. Para ser aludido, esta fracción coloreada del eluido contiene una proteína recombinante marcada, transfiera el EIT a un casete de diálisis SLI y dialice el EIT tres veces a 10 milimolares NAPI a una dilución de uno a 2000 durante dos horas cada uno en dos litros después de la diálisis. Empuje el EIT a través de un filtro de jeringa estéril de 0,45 micrómetros, luego alícuota en muestras de cinco veces 100 microlitros y congele rápidamente en nitrógeno líquido.

La cantidad total de proteína debe ser de 0,5 a un microgramo por mililitro en cada alícuota de 100 microlitros. Para evaluar el carácter invasivo de la proteína, agregue un medio que contenga de cinco a 10 microgramos por mililitro marcado con un disco recombinante, una proteína, a cada pocillo de una placa de 24 pocillos que contenga células receptoras de neuroblastoma humano SH, SY, cinco Y. Expresando constitutivamente el disco de etiqueta GFP soluble en un extremo C en cubreobjetos de vidrio estéril, incube durante 48 a 72 horas.

Apagar, fijar la fluorescencia extracelular y montar las células como se hizo para las células tratadas con la zona agrícola confirman la invasión de la proteína recombinante aplicada exógenamente por Zack Imaging. Cuando se toma la proteína marcada, se detecta dentro del perímetro de las células receptoras en imágenes generadas por microscopía confocal. Este Zack abarca aproximadamente cinco micrómetros de profundidad a 24 pasos de 220 nanómetros.

En este caso, el disco recombinante uno, fragmento 5 98 a 7 85, que se muestra en rojo, es absorbido por las células receptoras que expresan el disco soluble marcado con GFP terminal C, uno que se muestra en verde, para determinar la invasividad del disco. Se purificaron a partir de células NLF y se aplicaron a las células receptoras SH SY cinco Y, como se describe en esta foto, como se muestra aquí. El disco uno marcado con A-M-R-F-P acrosoma, invadió un neuroblastoma humano SH, SY cinco células Y que expresan GFP soluble marcado con C terminal con disco uno uno.

Además, el disco uno marcado con MRFP fue capaz de reclutar el disco uno soluble marcado con GFP en agregados insolubles para determinar la invasividad del disco recombinante uno marcado con luz DIA se aplicó a células de neuroblastoma SH SY cinco Y que expresan el disco uno soluble de GFP como se muestra aquí. La proteína del disco recombinante uno, las malteras que se muestran en rojo invadieron la célula receptora, los puntos amarillos indican un reclutamiento de disco terminal C marcado con GFP soluble uno en agregados, el disco recombinante uno marcado y purificado a partir de E. coli también fue invasivo para las neuronas in vivo cuando la proteína multimérica se inyectó estereotácticamente en la corteza prefrontal medial de una rata. Las imágenes de Zack confirman la presencia de una proteína recombinante del disco uno en una neurona cortical de rata teñida con un anticuerpo contra los núcleos neuronales.

Acabamos de mostrarte dos métodos para generar agregados de disco uno para estudiar la invasión celular. Usando cualquiera de estos métodos, podemos investigar los efectos celulares de la absorción de agregados del disco uno sin las variables potencialmente confusas de la expresión de genes recombinantes por transfección de ADN extraño. Estas técnicas se pueden aplicar para investigar los efectos biológicos de la patología de la proteína disco uno in vitro en células, e in vivo mediante inoculación intracerebral u otra administración en modelos animales.

Estamos seguros de que estas técnicas también pueden ser transferidas a otros agregados de proteínas eventualmente con ligeras modificaciones en el protocolo adoptado para cada proteína en particular. Al realizar este procedimiento, asegúrese de dedicar tiempo al análisis diligente de las imágenes de microscopía confocal.