Name: Generación, purificación y caracterización de especies invasivas en células de proteína DISC1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: Aprende a generar y purificar agregados de proteína DISC1 capaces de invadir células receptoras. Este método permite estudiar la invasión celular de agregados proteicos en neuroblastoma humano y neuronas in vivo.

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Este trabajo fue financiado por NEURON-ERANET descubrir (BMBF 01EW1003) para CK y JPH, DFG (Ko 1679/3-1; GRK1033) para CKVB el apoyo de una subvención de la Forschungskommission de la Facultad de Medicina de la Universidad de Düsseldorf.

1. Preparación de células de donante aggresome: Transfección de monomérico proteína fluorescente roja (mRFP) o aumento de proteína verde fluorescente (EGFP)-etiquetados humana de longitud completa (FL) DISC1 <ol><li> Seed 1,5 x 10 6/10 cm plato de neuroblastoma humano NLF (NLF, el Hospital de Niños de Filadelfia, Filadelfia, PA) en las células de diez platos de 10 cm y crecer durante la noche. Células del FNL se cultivan en RPMI-1640 suplementado con 10% FBS, penicilina / Strepomycin, L-Glutamina. El día siguiente, las células deben estar en una confluencia del 70-80%. </li><li> Transfectar transitoriamente cada placa de 10 cm con 15 g de ADN plásmido y reactivo de transfección Metafectene (Biontex, Martinsried, Alemania). En breve, para un plato de 10 cm, 15 g de ADN plásmido y 30 Metafectene l se añadieron a 750 l de Opti-MEM, se mezcló y se incubó a TA durante 20 min. 5 platos fueron transfectadas con pcDNA3.1 mRFP / EGFP-etiquetados humanos (FL) DISC1 y 5 platos con el solo eGFP-plásmido. </li></ol> 2. AggresomeLa purificación de las células del donante transfectadas El protocolo descrito aquí es una combinación de un método para purificar Lewy-Cuerpos de tejido de cerebro 13 y un protocolo para aislar grandes agregados y aggresomes 14. Dado que los métodos ya existentes se basan en el uso de detergentes, el aislamiento de detergente libre de proteínas para la aplicación en ensayos de invasividad de las células-es crítica. <ol><li> 48 h después de la transfección, controlar la expresión de eGFP y mRFP/eGFP-DISC1 y confirmar la formación de aggresomes bajo un microscopio de fluorescencia (Figura 1). </li><li> Lavar las células con PBS pH 7,4, raspar con 400 l de PBS cada una, añadir cóctel 1X inhibidor de proteasa (Roche, Indianapolis, IN) y romper las células utilizando un homogeneizador Precellys24 (Bertin Technologies, Francia). En pocas palabras, añadir 1 ml de suspensión celular a un tubo de lisis 2 ml y añadir 10 gotas de cerámica. Lisar las células con 3 x 60 pulsos por segundo. La fuerza mecánica del proceso puedeaumentar la temperatura dentro de la muestra por encima de 37 ° C, de modo se debe tener cuidado para enfriar la muestra en hielo después de que el procedimiento de lisis. </li><li> Enfriar las células en hielo y añadir 10 mM de MgCl 2, 40 U / ml de DNasa A y se incuba durante 60 min a 37 ° C </li><li> Se preparan soluciones de 80%, 50%, 20% de sacarosa (w / v) en PBS pH 7,4 (10 ml cada uno). </li><li> Preparar el gradiente de sacarosa en un tubo Falcon de 15 ml, comenzando con 2 ml de sacarosa 80%, seguido por 50% y 20%. Vierta lentamente la pendiente y tenga cuidado de no molestar a las capas ya derramado. Capa del lisado digerido en la parte superior del gradiente y se centrifuga durante 15 min a 1000 xg a 4 ° C. </li><li> Recoger cuidadosamente la interfase entre la capa de sacarosa al 50-80% con una pipeta y se mezcla con 5 volúmenes de PBS pH 7,4. Centrifugar durante 15 min a 1000 xg a 4 ° C. Repetir el lavado dos veces más. En esta interfase, aggresomes son fluorescentes y pueden ser visualizadas en un microscopio bajo luz UV. </li><li> Eliminar el sobrenadante yresuspender el precipitado en 250-500 l de PBS pH 7,4. Esta pastilla contiene la aggresomes purificado (Figura 2). </li></ol> 3. El tratamiento de los receptores SH-SY5Y células con mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes <ol><li> Seed 5 x 10 4 receptores células SH-SY5Y de neuroblastoma humano que expresan constitutivamente GFP-DISC1 (598-854) en cubreobjetos de vidrio estériles en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. SH-SY5Y células se cultivan en DMEM/F-12 medio suplementado con penicilina / estreptomicina, no aminoácidos esenciales (NEAA) y FBS 10%. </li><li> 24 horas más tarde, se añaden 10 l a cada pocillo e incubar durante 48-72 horas. </li><li> Lavar las células 3 x con PBS pH 7,4 y apagar la fluorescencia extracelular con Trypan Blue 0,04% durante 5 min. </li><li> Fijar las células con PFA al 4% en PBS pH 7,4 durante 10 min en hielo, lavar una vez con H 2 O estéril y montar los cubreobjetos sobre el portaobjetos de vidrio con ProLong oro con DAPI medio de montaje (Invitrogen, EE.UU.). </li><li> Confirme la absorción /invasión de aggresomes exógenamente aplicadas por colocalización con proteínas de contratación expresadas por las células receptoras en Z-stack imágenes. </li></ol> Sin embargo, la absorción / invasión de proteína exógena no se podría detectar esencialmente en paralelo con el reclutamiento de proteínas de la célula huésped. En nuestro ejemplo mRFP-etiquetados DISC1 aggresomes recluta soluble GFP-etiquetados DISC1 (598-854) proteína expresada por la célula huésped (ver Figura 3). Las fotografías fueron tomadas en un Zeiss LSM 510 confocal o un microscopio Zeiss Axiovision Apotome2. 4. Generación de DISC1 recombinante (598-785) En una publicación anterior se analizó la capacidad de varios fragmentos de la proteína DISC1 a la libre interacción basado en la presencia de dominios de asociación libre. Entre todos los fragmentos de proteína probado humana DISC1 (598-785) que se muestra la propensión fuerte multimerización 4 (Figura 4). Por lo tanto, humana DISC1 (598 a 785) se clonó en pET15b (nvagen, Madison, Wisconsin) que contiene un 6-histidina N-terminal, expresada en E. coli BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, EE.UU.), y se purificó en condiciones desnaturalizantes en 8 mol / l de urea como se ha descrito 4. En resumen, el protocolo se describe a continuación. <ol><li> BL21-(IDE3) Rosetta E. coli se cultivaron en 2 x 500 ml 2YT que contiene 5 mM-arginina-HCl, 5 mM de MgSO4, 100 g / carbencillin ml, 35 mg / ml de cloramfenicol hasta una DO 600: 0.6-0.8 y DISC1 (598-785) se indujo la expresión con IPTG 1 mM. </li><li> DISC1 (598-785) se expresó durante 4 horas a 37 ° C, la expresión se terminó mediante la recolección de las bacterias por centrifugación. </li><li> El sedimento bacteriano se resuspendió en 50 ml de tampón TE (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA) más 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 ug / ml de lisozima, 20 mM MgCl 2 y 400 U/50 ml DNasa I. Para asegurar la lisis completa, la reacción se incubó durante 30 min a TA con agitación suave. </li><li> Añadir 10 mM β-mercaptooethanol (ME) y 500 mM NaCl y se incuba durante otros 30 min. </li><li> Decantar cuerpos bacterianos de inclusión a 20,000 g durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender el sedimento en 50 ml de tampón de extracción que contiene 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazol, 500 mM NaCl, 8 M de urea y 10 mM β-ME y eliminar los restos por centrifugación a 20,000 g durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Lavar el Ni-NTA agarosa matriz con tampón de extracción. Incubar el extracto resuspendido, proteína precleared con matriz de Ni-NTA durante 2 horas a RT. </li><li> Lavar la matriz de Ni-NTA con tampón de extracción que contiene 12 mM de imidazol. </li><li> Eluir la proteína lentamente con 15 ml de tampón de elución que contiene 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazol, 8 M urea, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA y 10 mM β-ME. </li><li> Dializar la proteína por pasos a PBS pH 7,4 que contiene 10 mM β-ME. </li></ol> De 1 L cultivo bacteriano de partida, es posible aislar de hasta 50 mg de proteína de DISC1 (598-785) protEIN. α-sinucleína replegamiento Para experimentos con α-sinucleína, 500 ug de la proteína recombinante (Sigma-Aldrich, EE.UU.) se disolvió en PBS a una concentración de 1 mg / ml. Para obtener oligómeros, replegamiento se realizó durante la noche a 37 ° C como se describe en una publicación anterior 10. 5. Etiquetado de DISC1 recombinante (598-785) con DyLight594 <ol><li> Antes del proceso de etiquetado posterior, DISC1 (598-785) de proteínas tiene el ser liberado de β-ME. Por lo tanto, la proteína se dializó 3 veces con PBS pH 7,4 a una dilución de 1:2,000. </li><li> Etiqueta de 1 mg DISC1 (598-785) con DyLight 594 maleimida (Thermo Scientific, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. En resumen, se disuelve 1 mg / ml de proteína en PBS pH 7,4 y añadir 5 mM TCEP para recuperar los grupos tiol libres. Añadir 20 l de DMF disuelve el colorante a la reacción y se incuba durante 2 horas a RT. </li><li> Dializar la proteína 3 x PBS a pH7,4 en una proporción de 1:2000 durante 2 horas cada una. </li></ol> Para aumentar aún más la pureza de la proteína marcada una 6-Su etiquetados afinidad basada en la purificación en una columna de Ni-NTA se realiza. <ol start="4"><li> Lavar 1 ml de Ni-NTA matriz (Qiagen, Alemania) con 10 ml de PBS pH 7,4. </li><li> Aplique el etiquetado, la proteína dializada a la columna y se deja correr por la columna lentamente. </li><li> Lávese la proteína con 3 x 20 ml de PBS pH 7,4 </li><li> Se eluye la proteína con PBS pH 7,4, 500 mM de imidazol gota a gota mientras se monitoriza la banda de color en la columna de Ni-NTA para reducir el volumen eluido. </li><li> Dializar el eluato 3 x a 10 mM NaPi pH 7,4 a una dilución de 1:2000 durante 2 horas cada una. </li><li> Utilice una jeringa estéril de 0,45 micras filtro para filtrar el eluato, la alícuota en 5 x 100 muestras mu l y congelamiento rápido en nitrógeno líquido. La cantidad total de proteínas debe ser 0,5 a 1 mg / ml en cada alícuota de 100 l. </li></ol> opcional concentración paso <ol start="10"><li> Para las inyecciones de rata estereotácticos, la proteína se concentró 10 veces en un Speed-Vac (concentrador de Eppendorf 5301). La condición de tampón final fue de 100 mM NaPi. </li></ol> α-sinucleína Etiquetado El etiquetado y la purificación (columna de Ni-NTA) del recombinante α-sinucleína se realizó en paralelo a DISC1 (598-785). El material de partida total fue de 500 mg en vez de 1 mg por DISC1 (598-785). 6. El tratamiento de los receptores SH-SY5Y células recombinante marcado con DISC1 (598-785) Proteínas <ol><li> Semillas 5x10 4 receptores células SH-SY5Y de neuroblastoma humano que expresan constitutivamente GFP-DISC1 (598-854) en cubreobjetos de vidrio estériles en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. </li><li> Añadir proteína marcada al medio de cultivo celular a una concentración de 5-10 mg / ml y se incuba durante 48-72 h. </li><li> Lavar las células 3 x con PBS pH 7,4 y apagar extracciónfluorescencia ellular con Trypan Blue 0,04% durante 5 min. </li><li> Fijar las células con PFA al 4% en PBS pH 7,4 durante 10 min en hielo, lavar una vez con H 2 O estéril y montar los cubreobjetos sobre el portaobjetos de vidrio con ProLong oro con DAPI medio de montaje (Invitrogen, EE.UU.). </li><li> Confirme la captación / invasión de exógenamente aplicado proteína recombinante por colocalización con proteínas de contratación expresadas por las células receptoras en Z-stack imágenes generadas por microscopía confocal de barrido láser. Sin embargo, el reclutamiento de la proteína endógena no puede ser detectado esencialmente en paralelo con la invasión de la proteína de la célula huésped, Z-Stack imágenes todavía puede confirmar la naturaleza invasiva de la proteína. </li></ol> En nuestro ejemplo rec. DISC1 (598-785) * al menos en parte reclutas soluble GFP-etiquetados DISC1 (598-854) la proteína expresada por la célula huésped (ver Figura 5). Para recombinante invasión α-sinucleína pero el reclutamiento no se muestra (Figura 5 B). Se tomaron fotosen un Zeiss LSM 510 confocal-o un microscopio Zeiss Axiovision Apotome2. La inyección del concentrado (ca. 4 l de 2,5 g / l), con la etiqueta DISC1 (598-785) * en los resultados mPFC en la difusión de la proteína alrededor del sitio de inyección que se puede detectar incluso después de la perfusión de los animales con 4% de PFA en PBS pH 7,4 con un Filterset rodamina. En nuestro ejemplo DISC1 (598 a 785) es tomada por un número distinto de neuronas y pueden ser controlados con Z-pila de imágenes (Figura 6). En general, la inyección de otras proteínas después los utiliza aquí no conducen necesariamente a la celda a la invasión. El evento de invasión es esencialmente dependiente de la naturaleza de la proteína, sin embargo una purificación limpia es un requisito previo para su posterior análisis. 7. Los resultados representativos Aggresomes consistentes recombinante FL DISC1-eGFP purificada a partir de células del FLN invadido destinatario SH-SY5Y ceLLS a la baja eficiencia (aproximadamente 0,3% 5) como se ve por colocalización con microscopía confocal (Figura 3). Como se informó anteriormente, DISC1 (598 a 785) expresada y purificada a partir de E. coli forman multímeros 4 fueron igualmente invasor de células con una eficiencia de aproximadamente 20% 5 (Figura 5A) similar a la de α-sinucleína que se usó en paralelo como control positivo (Figura 5B). DISC1 recombinante marcado (598 a 785) expresada y purificada a partir de E. coli fue también invasor de células de neuronas in vivo cuando la proteína multimérica se inyectaron estereotácticamente en la corteza prefrontal medial de la rata (Figura 6; Pum, Bader, Huston, Korth, no publicado). <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Células de neuroblastoma que expresan transitoriamente FNL FP-DISC1 (rojo). Red aggresomes fluorescentes pueden ser deteCTED dentro de las células. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Purificada mRFP-etiquetados DISC1 aggresomes después de la purificación en un gradiente de sacarosa. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Imagen fluorescente de aggresomes invadidas. mRFP-etiquetados flDISC1 aggresomes se purificaron y se incubaron con células de neuroblastoma SH-SY5Y que sobreexpresan GFP-etiquetados soluble DISC1 (598-854). Una absorción de aggresomes marcados se monitoriza mediante formación de imágenes pila Z en un microscopio láser-Scan (Zeiss LSM 510). <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. SEC-perfil de rec. DISC1 (598-785) que contiene el S704 y C704 los polimorfismos de nucleótido único (SNP). Ambas variantes muestran una interrupción de oligomerización ordenada y la formación de mult de alto peso molecularIMers (flecha roja). Este cuadro se modifica a partir de la publicación de Leliveld et al., Biochemistry, 2009. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Fluorescente Z-stack de imagen invasivas DyLight marcado DISC1 recombinante (598-785). SH-SY5Y neuroblastoma células que expresan GFP-soluble DISC1 (598-854) se incubaron con la etiqueta, la proteína recombinante a una concentración de 5 mg / ml. (A) los agregados roja muestra la invasión de rec. DISC1 (598-785) de proteínas y puntos amarillos indican una selección de soluble GFP-DISC1 (598-854) en agregados. (B) recombinante α-sinucleína (rojo) invade las células sin la contratación con una frecuencia de aproximadamente 20%. <a href="/files/ftp_upload/4132/4132fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig6.jpg" alt="La figura 6" /> Figura 6. Inmunofluorescente de imageninyecta el etiquetado, DISC1 recombinante (598-785) de proteínas. Z-stack de imágenes confirma la presencia de rec. DISC1 (598-785) de proteínas en las neuronas corticales de rata teñidas con un anticuerpo contra núcleos neuronales (NeuN, verde).

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No hay conflictos de interés declarado.

En este estudio se describe la purificación de mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes a partir de una línea celular de neuroblastoma transfectadas, la preparación y el etiquetado de una especie de proteína recombinantes DISC1 y su aplicación en experimentos de invasión celular de las células receptoras in vitro e in vivo. La purificación de nativos mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes fue desarrollado a partir de protocolos para aislar Lewy cuerpo como las estructuras y los agregados más grandes 13, 14, pero modificado para evitar el uso de detergentes y para reducir al mínimo el riesgo de falsos positivos de células invasión que pudiera ocurrir debido a la penetración de la membrana detergente facilitado. Una mejora posible futuro podría ser el de aumentar aún más la pureza de los aggresomes por sonicación a completamente membranas separadas restantes y el citoesqueleto de los aggresomes. Al aumentar la pureza total, el número de eventos de invasión total de la registrada para las grandes ma aggresomesy se incrementará 5. Si la definición limitada de nuestra sugerido 3-fases sacarosa es suficiente para aggresomes de especies de otra proteína tiene que ser probado, en este sentido al protocolo descrito aquí debe ser considerado como un punto de partida para una optimización individual. Los aggresomes purificados resultó ser bastante robusto en nuestras manos, los pasos adicionales de lavado (sin detergente) para eliminar las trazas de sacarosa no redujo significativamente el rendimiento global. En una publicación anterior describimos que ensamblaje de oligómeros de DISC1 es dependiente de dominios de multimerización distintas en el extremo C-terminal 4 (Figura 4). Elegimos este fragmento para la expresión recombinante soluble en E. coli y la posterior purificación y Ni-NTA. Para controlar su multimerización y comparar su invasividad de las células con un descrito invasor de células como proteína α-sinucleína, la etiqueta DISC1 (598-785) con el colorante fluorescente DyLight594, y se comparó suinvasividad de células con el de la etiqueta igualmente α-sinucleína. La célula-invasividad del fragmento recombinante DISC1 se incrementó drásticamente en comparación con el de la nativa de longitud, completo DISC1 aggresomes, probablemente debido a su menor tamaño y pureza muy superior. Una vez más, la pureza parece jugar un papel decisivo en la celda de invasividad. En nuestro ejemplo los aggresomes invasivos reclutados proteína soluble homólogo de la línea celular diana que se expresa de forma recombinante en una forma soluble, es decir, células dispersas forman. La expresión de una proteína fluorescente (por ejemplo, GFP o RFP) en la línea de célula receptora es una ventaja, ya que permite la colocalización de aggresomes invasoras y las proteínas recombinantes dentro del límite de la célula receptora a través de imágenes Z-pila. Invasor de células aggresomes DISC1 y fragmentos multiméricos expresada y purificada a partir de E. coli podría ser un rasgo característico de algunas enfermedades conformacionales de proteínas relacionadas con DISC1, DISC1opathies 15. Solución de Problemas: Bajo rendimiento aggresome después de la purificación en gradiente de sacarosa: El gradiente de sacarosa presenta en este protocolo funciona bien con eGFP/mRFP-DISC1 (FL) aggresomes. Aggresomes consistentes en otras proteínas podrían ser de dimensiones variables por lo tanto, las concentraciones de sacarosa debe ser optimizado por otros usuarios. Purificación insuficiente de la proteína recombinante: Cualquier contaminantes bacterianos en el proceso de purificación de la proteína recombinante también será etiquetado en pasos posteriores del protocolo. Para evitar contaminaciones, ejecute la proteína en una SDS-PAGE y confirmar que la proteína recombinante es de al menos 95% de pureza por tinción con Coomassie Blue-. Para garantizar la más alta calidad y el rendimiento, el protocolo tiene que ser optimizado para cada proteína individual. Bajo ef etiquetadodeficiencia de proteínas recombinantes: Cualquier contaminaciones que contienen grupos SH libres disminuirá etiquetado eficiente de la proteína. Por lo tanto, la diálisis extensa y Ni-NTA purificación basado es obligatoria.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo nombre </td><td> Empresa </td><td> El número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td> Medio es dependiente de la línea de células huésped. La línea receptor celular óptimo debe ser determinado por el usuario. </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-033 </td><td> Medio es dependiente de la línea celular receptora. La línea receptor celular óptimo debe ser determinado por el usuario. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Metafectene </td><td> Biontex </td><td> T020-1.0 </td><td> Otros reactivos de transfección podría funcionar también, pero no se probaron con el protocolo. </td></tr><tr><td> Ni-NTA agarosa </td><td> Qiagen </td><td> 30210 &lt;/ Td&gt; <td> Los experimentos se realizaron con Ni_NTA agarosa de Qiagen, otros proveedores deben trabajar también. </td></tr><tr><td> DNasa I </td><td> Roche </td><td> 04716728001 </td><td> No hay necesidad de RNasa libre de DNasa en el proceso de purificación aggresomes. </td></tr><tr><td> Sacarosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-062 </td><td> Medio libre de suero funciona así </td></tr><tr><td> Penicilina / Estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td> Suplemento para SH-SY5Y y medianas NLF </td></tr><tr><td> No esencial-aminoácidos (NEAA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7145 </td><td> Suplemento para SH-SY5Y medio </td></tr><tr><td> 0,4% de azul de tripano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8154 </td><td> Reactivo tóxico </td></tr><tr><td> DyLight 594 Maleimide </td><td> Thermo Fisher Scientific- </td><td> 46608 </td><td> Reducción de colorante reactivo cisteína para formar enlaces tioéter estables. También disponible en otros colores. </td></tr><tr><td> Prolongar oro con DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36935 </td><td> Este volumen de solución líquida Antifade dio mejores resultados en nuestras manos. </td></tr><tr><td> Cóctel inhibidor de la proteasa </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> Disolver una mesa en 500 l de H 2 O para la solución 100X. </td></tr><tr><td> Sintético a-sinucleína </td><td> Sigma </td><td> S7820 </td><td> Replegamiento como se describe en el texto. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla de reactivos específicos. </td></tr><tr><td> Precellys 24 </td><td> Bertin Tecnologías </td><td> 03119.200.RD000 </td><td> No hemos probado homogénea otro mecániconizers distintos del presente. Otro método detergente libre homogeneización podría funcionar también, pero no se han probado para este protocolo. </td></tr><tr><td> 5301 Concentrador (SpeedVac) </td><td> Eppendorf </td><td> 5301 000.210 </td><td> Sólo es necesario si la proteína tiene que ser concentrado. </td></tr><tr><td> LSM 510 y Apotome2 Axiovision </td><td> Zeiss </td><td> Vea el catálogo de los fabricantes </td><td> Ambos microscopios albergan la capacidad de realizar pila Z de imágenes. Este es un requisito previo para una evaluación sólida y seria de eventos de invasión. </td></tr><tr><td> Cultivo de células de material plástico </td><td> Nunc </td><td> Platos de 10 cm # 172958, placas de 24 pocillos # 142475 </td><td> El uso de material plástico diferente podría influir en la interacción de proteínas recombinantes o aggresomes y las superficies de plástico. No hemos probado otros materiales que los descritos aquí. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla de material y equipos específicos. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Número </td><td> Buffer nombre </td><td> contenido </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Medio de crecimiento bacteriano </td><td> 16 g / l de Bacto triptona, 10 g / l de extracto de levadura Bacto, 5 g / l de NaCl, 5 mM-arginina-HCl, 5 mM de MgSO4, 100 ug / ml carbencillin, 35 mg / ml de cloramfenicol </td><td> Crecer las bacterias a OD 600: 0.6-0.8 inducir la expresión con IPTG 1 mM. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Tampón de resuspensión bacteriana </td><td> 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 ug / ml de lisozima, 20 mM MgCl 2 y 400 U/50 ml de DNasa I </td><td> Resuspender pellet bacteriano a partir de 1 L overnight cultura en 50 ml de tampón de resuspensión. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Tampón de extracción de proteínas </td><td> 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazol, 500 mM NaCl, 8 M de urea y 10 mM de b-ME </td><td></td></tr><tr><td> 4. </td><td> Ni-NTA columna de tampón de lavado </td><td> 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazol, 500 mM NaCl, 8 M de urea y 10 mM de b-ME, 12 mM imidazol </td><td> Tampón modificado de extracción con 12 mM de imidazol añadido. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Ni-NTA columna de tampón de elución </td><td> 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazol, 8 M urea, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA y 10 mM de b-ME </td><td> El tampón de elución contiene 10 mM de b-ME, que se dializó después. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> PBS </td><td> 8 g / l NaCl, 0,2 g / l KCl, 1,44 g / l de Na 2 HPO 4, 0,24 g / l de KH 2 PO 4, ajustar a pH 7,4 </td><td></td></tr><tr><td>7. </td><td> Etiquetado de búfer </td><td> PBS que contenía 5 mM TCEP </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Tabla de recetas. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

generación, purificación y caracterización de especies invasivas en células de proteína disc1

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

La agregación de proteínas es visto como una característica general de las condiciones crónicas, degenerativas del cerebro como, por ejemplo, en las enfermedades neurodegenerativas enfermedad de Alzheimer (Aß, tau), enfermedad de Parkinson (α-sinucleína), enfermedad de Huntington (poliglutamina, huntingtina), y otros. Agregación de proteínas se cree que ocurre debido a proteostasis perturbado, es decir, el desequilibrio entre el surgimiento y la degradación de las proteínas mal plegadas. Es de destacar que las mismas proteínas que se encuentran agregadas en las formas esporádicas de estas enfermedades que son mutantes en las variantes raras de formas familiares. La esquizofrenia es una enfermedad crónica progresiva del cerebro que en muchos casos va junto con un déficit cognitivo permanente e irreversible. En un enfoque de genes candidatos, se investigó si Interrumpido en la esquizofrenia 1 (DISC1), un gen clonado en una familia escocesa con la vinculación con enfermedad mental crónica 1, 2, se puede encontrar en forma de agregados insolubles en el brain de casos esporádicos de esquizofrenia 3. Uso de la CC SMRI, hemos identificado en aproximadamente el 20% de los casos con CMD pero no los controles normales o pacientes con enfermedades neurodegenerativas sarkosyl insoluble en DISC1 inmunorreactividad después de fraccionamiento bioquímico. Estudios posteriores in vitro revelaron que la propensión de agregación de DISC1 fue influenciado por la enfermedad asociada a polimorfismo S704C 4, y que DISC1 aggresomes generados in vitro fueron invasor de células 5, similar a lo que se había mostrado para Aß 6, tau 7-9, α -sinucleína 10, poliglutamina 11, o agregados de SOD1 12. Estos resultados nos impulsó a proponer que al menos un subconjunto de casos con CMD, aquellos con DISC1 agregada podría ser trastornos conformacionales de proteínas. Aquí se describe cómo generar DISC1 aggresomes en células de mamíferos, purificarlos en un gradiente de sacarosa y utilizarlos para studi invasividad celulares. Del mismo modo, se describe cómo generar una exclusiva multimérica C-terminal fragmento DISC1, etiqueta y purificarlo para estudios de invasividad de las células. Uso de los multímeros recombinantes de DISC1 logramos invasividad de las células similar al de una etiquetados de manera similar sintético α-sinucleína fragmento. También se muestra que este fragmento se recoge en vivo cuando estereotácticamente inyectado en el cerebro de los animales receptores.

La generación, purificación y la invasión celular de aggresomes intracelulares, citoplasmáticas de longitud completa de proteína DISC1 de cultivos celulares y de un marcado, multimérica fragmento de la proteína recombinante en DISC1<em&gt; E. coli</em&gt; Se describen. Invasividad de las células se muestra para las células receptoras en cultivo celular y para las neuronas<em&gt; In vivo</em&gt; Después de la inoculación cerebro estereotácticos.

Generación, purificación y caracterización de especies invasivas en células de proteína DISC1

La agregación proteica se considera una característica general de las afecciones cerebrales degenerativas crónicas como, por ejemplo, en las enfermedades neurodegenerativas: la enfermedad de Alzheimer (Aβ, tau), la enfermedad de Parkinson (α-sinucleína), la enfermedad de Huntington (poliglutamina, huntingtina) y otras. Se cree que la agregación proteica ocurre debido a una proteostasis alterada, es decir, el desequilibrio entre la aparición y la degradación de proteínas mal plegadas. Cabe destacar que las mismas proteínas se encuentran agregadas en formas esporádicas de estas enfermedades que presentan mutaciones en variantes raras de formas familiares. La esquizofrenia es una afección cerebral crónica y progresiva que en muchos casos conlleva un déficit cognitivo permanente e irreversible. Mediante un enfoque de gen candidato, investigamos si el gen Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), un gen clonado en una familia escocesa con vinculación a enfermedades mentales crónicas1, 2, podría encontrarse como agregados insolubles en el cerebro de casos esporádicos de esquizofrenia3. Utilizando el SMRI CC, identificamos en aproximadamente el 20 % de los casos con CMD, pero no en los controles normales ni en pacientes con enfermedades neurodegenerativas, inmunorreactividad de DISC1 insoluble en sarkosyl tras el fraccionamiento bioquímico. Estudios posteriores in vitro revelaron que la propensión a la agregación de DISC1 estaba influenciada por el polimorfismo S704C asociado a la enfermedad4, y que los aggresomas de DISC1 generados in vitro eran invasivos celulares5, de manera similar a lo que se había demostrado para los agregados de Aβ6, tau7-9, α-sinucleína10, poliglutamina11 o SOD112. Estos hallazgos nos llevaron a proponer que al menos un subconjunto de casos con CMD, aquellos con DISC1 agregado, podrían ser trastornos conformacionales de las proteínas. Aquí describimos cómo generamos aggresomas de DISC1 en células de mamíferos, los purificamos en un gradiente de sacarosa y los utilizamos para estudios de invasividad celular. Del mismo modo, describimos cómo generamos un fragmento C-terminal de DISC1 exclusivamente multimérico, lo marcamos y lo purificamos para estudios de invasividad celular. Utilizando los multímeros recombinantes de DISC1, logramos una invasividad celular similar a la de un fragmento sintético de α-sinucleína marcado de manera similar. También demostramos que este fragmento es captado in vivo cuando se inyecta estereotácticamente en el cerebro de animales receptores.

El objetivo general de los siguientes procedimientos es generar discos purificados. Uno agrega capaces de invadir células receptoras. Se demostrarán dos métodos diferentes para lograr este objetivo, utilizando el primer método.La proteína fluorescente que forma el complejo disco uno está sobreexpresada en células donadoras de neuroblastoma humano NLF. Luego, las células se lavan con PBS, se recogen y se lisan sin el uso de detergentes. El ADN se digiere y las zonas de agarosa se purifican utilizando un sistema de gradiente de sacarosa.Los agrios purificados mediante este método tienen una baja eficiencia de invasión celular. El enfoque alternativo consiste en sobreexpresar los aminoácidos 598 a 785 de la proteína recombinante disc una en E. coli. Luego, el fragmento proteico se marca con DITE 594, se dializa y se purifica utilizando una matriz NI NTA, lo que elimina cualquier resto de colorante no unido y el disc multimérico.Los fragmentos uno generados mediante este método tienen una alta eficiencia de invasión celular para evaluar la invasión de células hospedadoras. Ya sea el disco purificado de proteína fluorescente, los uno risomas o el disco recombinante marcado. Se incuban fragmentos uno con las células receptoras de interés.Azul de trian se agrega luego para eliminar la fluorescencia extracelular y la invasión se visualiza mediante microscopía confocal. Hasta ahora, la agregación de proteínas no ha sido una característica reconocida de las enfermedades mentales crónicas como la esquizofrenia. Donde la proteína uno interrumpida en la esquizofrenia es un candidato para la invasividad celular, la agregación de proteínas es una característica distintiva de las enfermedades por mal plegamiento proteico.Aquí mostramos mediante dos métodos que los agregados de la proteína disc uno son invasivos para las células, y por lo tanto que las alteraciones relacionadas con disc uno o las neuropatías asociadas a disc uno son trastornos conformacionales de proteínas. Los dos métodos son, en primer lugar, la purificación de disc completo, un ASOS proveniente de líneas celulares de neuroblastoma, y en segundo lugar, la expresión de un fragmento multimérico del extremo C-terminal de disc uno en *E. coli*, así como la purificación y marcado con un colorante fluorescente.Si bien el primer método solo provoca una baja eficiencia de invasión celular del 0,3 % de las células que incorporan los microsomas purificados, el fragmento proteico recombinante purificado infecta hasta el 20 % de las células expuestas. Los métodos descritos aquí deberían ser transferibles a otras proteínas en las que se haya demostrado convincentemente la formación del acrosoma o el ensamblaje multimérico. En cada uno de los 10 platos de 10 centímetros.Siembre 1,5 × 10⁶ células de neuroblastoma humano y células LF en medio RPMI 1640 suplementado y cultive durante la noche. Al día siguiente, las células deben estar entre un 70 y un 80 % confluentes; etiquete cinco placas para transfección con PC DNA 3.1 MRFP y disc humano completo marcado con EGFP, y otras cinco para transfección solo con el plásmido EGFP. Para cada placa de 10 centímetros, combine 15 microgramos de ADN plasmídico, 30 microlitros de met afectante y 750 microlitros.Opti MEM en un tubo de microcentrífuga y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo; incube a temperatura ambiente durante 20 minutos. Luego, para transfectar las células, agregue la solución del reactivo de transfección de ADN gota a gota sobre las células, e incube las células a 37 grados Celsius con 5 %CO₂. 48 horas después de la transfección, supervise la expresión de MRFP de longitud completa del disco uno y confirme la formación de zonas de aglomeración mediante microscopía de fluorescencia. Algunas células albergan inclusiones masivas de proteína fluorescente como se muestra aquí.Este protocolo combina un método para purificar cuerpos de Lewy a partir de tejido cerebral y el protocolo para aislar agregados más grandes o zonas de agregación, ya que los métodos ya existentes se basan en el uso de detergentes, siendo fundamental el aislamiento de proteínas libres de detergentes para su aplicación en ensayos de invasividad celular. A continuación, aspire el medio y lave con PBS, y añada 400 microlitros de PBS que contenga una mezcla de inhibidores de proteasas. Luego raspe las células y añada un mililitro de suspensión celular y 10 esferas cerámicas a un tubo de lisis de dos mililitros.Lise las células utilizando tres pulsos de 62 segundos en un homogenizador pre-célula lyse 24. La fuerza mecánica del proceso puede aumentar la temperatura dentro de la muestra por encima de 37 grados Celsius. Por lo tanto, se debe tener cuidado de enfriar la muestra en hielo. Después del procedimiento de lisis, tras enfriar las células en hielo, agregue cloruro de magnesio 10 milimolar y 40 unidades por mililitro de ADNasa, e incube durante 60 minutos a 37 grados Celsius con agitación.Prepare 10 mililitros de cada solución de sacarosa al 80 %, 50 % y 20 % peso por volumen en PBS. Luego, en un tubo cónico de 15 mililitros, prepare el gradiente de sacarosa comenzando con dos mililitros de sacarosa al 80 %, seguido de dos mililitros de sacarosa al 50 % y dos mililitros de sacarosa al 20 %. Vierta el gradiente lentamente y tenga cuidado de no perturbar las capas ya depositadas.A continuación, coloque el lisado digerido encima del gradiente y centrifugue durante 15 minutos a 1000 veces G a cuatro grados Celsius. Con la rotura, recopile cuidadosamente la interfase entre las capas de sacarosa del 50 al 80 % con una pipeta y mezcle con cinco volúmenes en un tubo cónico de 15 mililitros; centrifugue durante 15 minutos a 1000 veces G a cuatro grados Celsius. Retire cuidadosamente el sobrenadante y conserve el pellet que contiene la zona de agregación.Repita el lavado otras dos veces en esta interfase. Las agrizonas son fluorescentes y pueden visualizarse al microscopio bajo luz ultravioleta tras el último lavado; deseche el sobrenadante y resuspenda el precipitado en 250 a 500 microlitros de PBS. Este precipitado contiene las agrizonas purificadas.Añada 10 microlitros de disco MRFP, una suspensión de asoma a cada pocillo de una placa de 24 pocillos que contiene células de neuroblastoma humano SHSY cinco Y. Exprese constitutivamente GFP soluble disco uno en el extremo C-terminal sobre cubreobjetos de vidrio estériles e incube durante 48 a 72 horas tras la incubación. Lave las células tres veces con PBS y bloquee la fluorescencia extracelular con azul de trian al 0,04 % durante cinco minutos.Luego, lave con PBS para eliminar el azul de trian. A continuación, coloque la placa sobre hielo y agregue PFA al 4 % en PBS durante 10 minutos para fijar las células. Después, lave una vez con agua estéril y monte las laminillas sobre portaobjetos con medio de montaje prolongado gold con DPI.Confirme la incorporación en la invasión de forma exógena. Aplique zonas de agregación mediante la colocalización con proteínas reclutadas expresadas por las células receptoras en imágenes Zack. Este Zack abarca aproximadamente seis micrómetros de profundidad.24 imágenes tomadas a intervalos de 200 nanómetros. La fluorescencia del disco MRFP de una zona agri mostrada en rojo recluta el dominio GFPC citosólico del disco. Un fragmento mostrado en verde indica una colocalización que aparece en amarillo y señala que las zonas agri han entrado en el citosol del receptor y reclutaron la proteína del disco uno, anteriormente soluble.En esta parte del protocolo, el disco humano uno se etiquetará con DITE 5 94. Este D permite el monitoreo directo de la proteína recombinante sin necesidad de tinción inmunológica adicional. Comience por liberar la proteína preparada según se describe en el documento adjunto del beta-mercaptoetanol mediante diálisis tres veces en dos litros de PBS a una dilución de uno a 2000.A continuación, marque un disco de un miligramo con DITE 5 94 IDE, disuelva un miligramo por mililitro de proteína en PBS y agregue TCEP cinco milimolar para recuperar los grupos SH libres. Añada 20 microlitros del colorante disuelto en DMF a la reacción e incube durante dos horas a temperatura ambiente. Utilizando una cinta de diálisis SLI con un corte de peso molecular de 10.000 daltons, realice diálisis de la proteína tres veces en PBS en una relación de uno a 2000, durante dos horas cada vez. A continuación, para aumentar aún más la pureza de la proteína marcada.Se realiza una purificación por afinidad basada en etiqueta his sobre una columna de NTA-Ni. Lave una matriz de NTA-Ni de un mililitro con 10 mililitros de PBS, luego aplique la proteína dializada marcada a la columna y deje que pase a través de la columna.Lentamente, la solución perderá parte de su color azul debido a la unión de la proteína a la matriz NTA; el colorante libre no marcado permanecerá en el flujo que atraviesa. Una vez que la solución proteica haya pasado a través de la columna, lave la columna tres veces con 20 mililitros de PBS para eluir la proteína y agregue dos mililitros de PBS que contenga 500 milimolar de ole a la columna.Coloque la válvula a baja velocidad y eluya gota a gota mientras monitorea la banda coloreada en la columna N NI NTA. Para hacer referencia, esta fracción coloreada del eluato contiene una proteína recombinante marcada; transfiera el EIT a una cinta de diálisis SLI y realice diálisis del EIT tres veces frente a NAPI 10 milimolar con una dilución de uno a 2000 durante dos horas cada vez en dos litros. Después de la diálisis, pase el EIT a través de un filtro estéril de jeringa de 0,45 micrómetros, luego divídalo en alícuotas de cinco muestras de 100 microlitros y congélelas rápidamente en nitrógeno líquido.La cantidad total de proteína debe ser de 0,5 a un microgramo por mililitro en cada alícuota de 100 microlitros. Para evaluar la invasividad de la proteína, añada medio que contenga de cinco a 10 microgramos por mililitro de proteína recombinante marcada disc one a cada pocillo de una placa de 24 pocillos que contenga células de neuroblastoma humano SH SY cinco Y receptoras. Incube durante 48 a 72 horas células que expresan constitutivamente la etiqueta GFP soluble en el extremo C-terminal de disc one sobre laminillas de vidrio estériles.Detenga la fluorescencia extracelular, fije y monte las células como se hizo con las células tratadas con la zona agri; confirme la invasión de la proteína recombinante aplicada exógenamente mediante Zack Imaging. Cuando la proteína marcada es incorporada, se detecta dentro del perímetro de las células receptoras en imágenes generadas por microscopía confocal. Este Zack abarca aproximadamente cinco micrómetros de profundidad en 24 pasos de 220 nanómetros.Aquí, el fragmento recombinante del disco uno, del 5 98 al 7 85, mostrado en rojo, es incorporado por células receptoras que expresan el disco uno soluble con etiqueta GFP en el extremo C, mostrado en verde, para determinar la invasividad del disco uno. Se purificaron agregados de disco uno completos con etiqueta MRFP, denominados zonas agro, a partir de células NLF y se aplicaron a células receptoras SH-SY5Y, como se describe en esta foto, tal como se muestra aquí. El disco uno con etiqueta A-M-R-F-P en el acrosoma invadió una célula de neuroblastoma humano SH-SY5Y que expresa el disco uno soluble con etiqueta GFP en el extremo C.Además, el disco uno etiquetado con MRFP fue capaz de reclutar el disco uno soluble etiquetado con GFP en agregados insolubles para determinar la invasividad. El disco uno recombinante marcado con DIA ligero se aplicó a células de neuroblastoma SH-SY5Y que expresan disco uno soluble con GFP, como se muestra aquí. La proteína disco uno recombinante, mostrada en rojo, invadió la célula receptora; los puntos amarillos indican el reclutamiento del disco uno soluble etiquetado con GFP en su extremo C-terminal hacia agregados. El disco uno recombinante expresado y purificado a partir de E. coli también mostró invasividad celular hacia neuronas in vivo cuando la proteína multimérica se inyectó estereotácticamente en la corteza prefrontal medial de una rata. La imagen de Zack confirma la presencia de la proteína disco uno recombinante en neuronas corticales de rata, teñidas con un anticuerpo contra núcleos neuronales.Acabamos de mostrarle dos métodos para generar agregados de la proteína disc uno para estudiar la invasión celular. Mediante cualquiera de estos métodos, podemos investigar los efectos celulares de la absorción de agregados de disc uno sin las variables potencialmente confusas de la expresión génica recombinante mediante la transfección de ADN foráneo. Estas técnicas pueden aplicarse para investigar los efectos biológicos de la patología de la proteína disc uno in vitro en células, e in vivo mediante inoculación intracerebral u otra administración en modelos animales.Estamos seguros de que estas técnicas también podrían transferirse eventualmente a otros agregados proteicos con ligeras modificaciones del protocolo adaptado a cada proteína particular. Al realizar este procedimiento, asegúrese de dedicar tiempo al análisis minucioso de las imágenes de microscopía confocal.

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