Name: De alto rendimiento para los moduladores de molécula pequeña de tráfico de perfeccionamiento activo Canales rectificador de potasio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Aprende a desarrollar un ensayo de fluorescencia cuantitativo para medir la actividad de canales de potasio rectificadores de entrada (Kir) mediante cribado de alto rendimiento. Este método permite identificar compuestos moduladores con aplicaciones terapéuticas en neurociencia.

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Este trabajo fue apoyado por la financiación de los Institutos Nacionales de Salud subvenciones 1R21NS073097-01 y 1R01DK082884 (JSD) y la Fundación para los Institutos Nacionales de subvención PIER11VCTR.

<ol><li>Ehrlich, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifier+potassium+currents+as+a+target+for+atrial+fibrillation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cardiovasc.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129(2008).</li>
<li>Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+K%2B+channels%3A+recent+advances+and+future+possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Small-molecule modulators of inward rectifier K+ channels: recent advances and future possibilities.</a> Future Med. Chem. 2 (5), 757(2010).</li>
<li>Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tarantula+toxins+interacting+with+voltage+sensors+in+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Tarantula toxins interacting with voltage sensors in potassium channels.</a> Toxicon. 49 (2), 213(2007).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 37 (38), 13291(1998).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+a+stable+form+of+tertiapin%3A+a+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 38 (43), 14286(1999).</li>
<li>Roy, A., McDonald, P. R., Sittampalam, S., Chaguturu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+access+high+throughput+drug+discovery+in+the+public+domain%3A+a+Mount+Everest+in+the+making%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Open access high throughput drug discovery in the public domain: a Mount Everest in the making.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (7), 764(2010).</li>
<li>Weaver, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thallium-sensitive%2C+fluorescence-based+assay+for+detecting+and+characterizing+potassium+channel+modulators+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A thallium-sensitive, fluorescence-based assay for detecting and characterizing potassium channel modulators in mammalian cells.</a> J. Biomol. Screen. 9 (8), 671(2004).</li>
<li>Lewis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+reveals+a+small-molecule+inhibitor+of+the+renal+outer+medullary+potassium+channel+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening reveals a small-molecule inhibitor of the renal outer medullary potassium channel and.</a> 76 (5), 1094(2009).</li>
<li>Bhave, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+selective+small-molecule+inhibitor+of+Kir1.1%2C+the+renal+outer+medullary+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Development of a selective small-molecule inhibitor of Kir1.1, the renal outer medullary potassium channel.</a> Mol. Pharmacol. 79 (1), 42(2011).</li>
<li>Raphemot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+structure-activity+relationships+of+an+inhibitor+of+inward+rectifier+potassium+%28Kir%29+channels+with+preference+for+Kir2.3%2C+Kir3.x%2C+and+Kir7.1%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1.</a> Front Pharmacol. 2, 75(2012).</li>
<li>Niswender, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+of+Gi%2Fo-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+the+group+III+metabotropic+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of the group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharmacol. 73 (4), 1213(2008).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Tratamiento de datos: Una vez recogidos los datos, un paso común en el análisis consiste en la normalización de la respuesta de fluorescencia de cada pocillo, F, a su valor inicial al comienzo del experimento, F 0. Esto se conoce comúnmente como la &quot;relación estática&quot; y simbolizado &quot;F / F 0&quot;. En los casos en que F 0 está dominado por el colorante indicador de la relación de operación estática sustancialmente para corregir muchos factores ta...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.
The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |
to:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.

Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> El número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> pcDNA5/TO </td><td> Invitrogen </td><td> V1033-20 </td><td> Inducible por tetraciclina vector de expresión </td></tr><tr><td> T-Rex-células HEK293 </td><td> Invitrogen </td><td> R71007 </td><td> La tetraciclina-inducible línea celular </td></tr><tr><td> LTX Lipofectamine / Plus reactivo </td><td> Invitrogen </td><td> 15338100 </td><td> Reactivo de transfección </td></tr><tr><td> FBS </td><td> ATLANTA Biológicos </td><td> S11550 </td><td> Medios de cultivo celular </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td> Medios de cultivo celular </td></tr><tr><td> Higromicina B </td><td> Invitrogen </td><td> 10687-010 </td><td> Medios de cultivo celular </td></tr><tr><td> Blasticidin S </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> R210-01 </td><td> Medios de cultivo celular </td></tr><tr><td> Penicilina / Estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> Medios de cultivo celular </td></tr><tr><td> HBSS-divalente libre </td><td> Mediatech </td><td> 21022CV </td><td> Lavado de células </td></tr><tr><td> Tripsina 0,25% </td><td> Mediatech </td><td> 25053CI </td><td> Disociación celular </td></tr><tr><td> Tetraciclina-HCl </td><td> Sigma </td><td> T9823 </td><td> Inducción reactivo </td></tr><tr><td> FBS dializado </td><td> ATLANTA Biológicos </td><td> S12650 </td><td> Medios de comunicación Revestimiento </td></tr><tr><td> FluoZin-2 </td><td> Invitrogen </td><td> F24189 </td><td> Colorante fluorescente </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P-3000MP </td><td> Dye carga </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14175 </td><td> Tampón de ensayo </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td> Tampón de ensayo </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td> Tl + estímulo tampón </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td> Tl + estímulo tampón </td></tr><tr><td> CaSO 4 • 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3771 </td><td> Tl + estímulo tampón </td></tr><tr><td> D-glucosa </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> Tl + estímulo tampón </td></tr><tr><td> Sulfato de talio </td><td> Aldrich </td><td> 204625 </td><td> Tl + estímulo tampón </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> Tl + estímulo tampón </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D4540 </td><td> Solvente </td></tr><tr><td> Ocho canales pipeta electrónica </td><td> Biohit </td><td> E300 </td><td> Célula de recubrimiento en el 384 -y placas </td></tr><tr><td> BD PureCoat amina recubiertos con placas de 384 pocillos </td><td> BD Biosciences </td><td> 356719 </td><td> Ensayo de microplacas </td></tr><tr><td> Echo calificado 384-así microplacas de polipropileno (384pp) </td><td> Labcyte </td><td> P-05525 </td><td> Microplacas compuesto fuente </td></tr><tr><td> 384-y microplacas de polipropileno </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 781280 </td><td></td></tr><tr><td> Multidrop Combi dispensador de reactivo </td><td> Thermo Scientific </td><td> 5840300 </td><td></td></tr><tr><td> ELx405 Lavador de microplacas </td><td> BioTek </td><td> ELx405HT </td><td> Lavado automático de células </td></tr><tr><td> Echo manipulador de líquidos </td><td> Labcyte </td><td> Labcyte Echo 550 </td><td></td></tr><tr><td> Bravo automatizado plataforma de manejo de líquidos </td><td> Agilent Technologies </td><td> Modelo estándar </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu FDSS 6000 </td><td> Hamamatsu </td><td></td><td> Kinetic imaging lector de placas </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Lista de Materiales y Reactivos.

de alto rendimiento para los moduladores de molécula pequeña de tráfico de perfeccionamiento activo canales rectificador de potasio

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Miembros específicos de la familia rectificador de potasio hacia el interior del canal (Kir) se postulan dianas de fármacos para una variedad de trastornos, incluyendo la hipertensión, fibrilación auricular, y 1,2 dolor. En su mayor parte, sin embargo, el progreso hacia la comprensión de su potencial terapéutico o funciones fisiológicas incluso básicos ha sido retrasado por la falta de buenos herramientas farmacológicas. En efecto, la farmacología molecular de la familia rectificador interno se ha quedado muy por detrás del de la superfamilia de S4 de potasio dependientes de voltaje (Kv) canales, para lo cual se han realizado una serie de afinidad nanomolar y péptidos moduladores selectivos de la toxina altamente descubiertos 3. El veneno de abeja tertiapin toxina y sus derivados son potentes inhibidores de Kir1.1 y Kir3 canales de 4,5, pero los péptidos son de uso limitado terapéuticamente así como experimentalmente, debido a sus propiedades antigénicas y una escasa biodisponibilidad, estabilidad metabólica y la penetrancia tejido. El desarrollo de potentesy selectivos de molécula pequeña sondas con mejores propiedades farmacológicas será una clave para un completo entendimiento de la fisiología y el potencial terapéutico de los canales Kir. El Bibliotecas Molecular Sondas Centro de Producción de red (MLPCN), apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) Fondo Común ha creado oportunidades para los científicos académicos para iniciar campañas de detección de la sonda para dianas moleculares y vías de señalización que necesitan una mejor farmacología 6. El MLPCN ofrece a los investigadores acceso a los centros de cribado a escala industrial y química médica y la informática apoyar el desarrollo de pequeñas moléculas sondas para elucidar la función de los genes y las redes de genes. El paso crítico en la obtención de la entrada a la MLPCN es el desarrollo de un ensayo robusto diana específica o vía-que es susceptible de cribado de alto rendimiento (HTS). Aquí se describe cómo desarrollar una fluorescencia basada en talio (Tl +) flujo ASSAy de Kir función del canal para la investigación de compuestos de alto rendimiento 7,8,9,10. El ensayo se basa en la permeabilidad de la K + poro del canal para el K + Tl + congénere. A comercialmente disponibles fluorescente Tl + colorante reportero se utiliza para detectar flujo transmembrana de Tl + a través del poro. Hay por lo menos tres colorantes comercialmente disponibles que son adecuados para TL + ensayos de flujo: BTC, FluoZin-2, y Fluxor 7,8. Este protocolo describe el desarrollo del ensayo utilizando FluoZin-2. Aunque originalmente desarrollado y comercializado como un indicador de zinc, FluoZin-2 exhibe un aumento robusto y dependiente de la dosis en la emisión de fluorescencia tras la unión Tl +. Comenzamos a trabajar con FluoZin-2 antes estaba disponible Fluxor 7,8 y han seguido haciéndolo 9,10. Sin embargo, los pasos en el desarrollo del ensayo son esencialmente idénticas para los tres tintes, y los usuarios deben determinar qué colorante es más apropiado para su específico nEEDS. También se discuten los puntos de referencia del ensayo de rendimiento que se deben alcanzar para ser considerado para la entrada en el MLPCN. Desde Tl + penetra fácilmente la mayoría de los canales de K +, el ensayo debe ser adaptable a la mayoría de los objetivos de los canales de K +.

El uso de un sistema de expresión inducible por tetraciclina proporciona un conveniente control interno para distinguir Tl + flujo a través de las vías endógenas y el canal Kir de interés. Figura 1 muestra algunos ejemplos de los mapas de galvanoplastia celulares utilizadas en diferentes tipos de experimentos. Las posiciones de los pocillos que contienen células no inducidas o tetraciclina inducida-se indican con diferentes colores. Figura 2A muestra el mapa de placa de fuent...

Los métodos para desarrollar y validar un ensayo cuantitativo de fluorescencia para medir la actividad de potasio rectificador de entrada (Kir) canales para la investigación de compuestos de alto rendimiento se presenta.

De alto rendimiento para los moduladores de molécula pequeña de tráfico de perfeccionamiento activo Canales rectificador de potasio

Se postula que miembros específicos de la familia de los canales de potasio rectificadores internos (Kir) son dianas farmacológicas para una variedad de trastornos, incluyendo la hipertensión, ...

El objetivo general de este procedimiento es descubrir compuestos novedosos que modulen la actividad de los canales de potasio rectificadores entrantes. Esto se logra primero sembrando células HK 2 9 3 inducibles por tetraciclina, que expresan un canal KIR de interés, en una placa de 384 pocillos. El segundo paso consiste en cargar las células con un colorante fluorescente indicador de talio denominado flu in two.A continuación, se eliminan mediante lavado el colorante no incorporado de las células y se reemplaza con tampón de ensayo que contiene un control vehicular o compuestos de prueba. El paso final consiste en la adición de un tampón estimulante a los pocillos para iniciar el flujo de talio. Finalmente, se utiliza un lector de placas de fluorescencia para identificar los compuestos que modifican el movimiento de iones de talio a través del canal KIR.Poor.La principal ventaja de este método frente a técnicas existentes como la electrofisiología manual con parche en modo ciego es que permite al investigador realizar cientos de experimentos simultáneamente y miles de experimentos diariamente. Este método permite al investigador cribar bibliotecas de miles de moléculas pequeñas p

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un tiempo real procedimiento de detección para identificar los medicamentos que interactúan con la proteína G-gated K hacia el interior del...

Un ensayo de cribado para la identificación de moduladores fluorescente de canales GIRK

Técnicas de biosensor óptico pueden detectar cambios en la masa cerca de la membrana plasmática en las células vivas y permitir una para seguir las respuestas celulares tanto en células individuales y poblaciones de células. Este protocolo describe la detección de la modulación de los canales de potasio por G-receptores acoplados a proteína en células intactas utilizando este enfoque.

El uso de biosensores ópticos sin etiqueta para Detectar la modulación de los canales de potasio por la proteína G-receptores acoplados

Aquí describimos un ensayo de genes reporteros basado en células como una herramienta valiosa para examinar bibliotecas químicas en busca de compuestos que modulan los mecanismos de control postranscripcional ejercidos a través de 3' UTR.

Selección de alto rendimiento para moduladores químicos de genes post-transcripcionalmente regulados

La interacción entre los canales HCN y su subunidad auxiliar ha sido identificado como un objetivo terapéutico en el trastorno depresivo mayor. Aquí, un método basado en la polarización de fluorescencia para identificar inhibidores de molécula pequeña de esta interacción proteína-proteína, se presenta.

Método para la identificación de inhibidores de moléculas pequeñas de la interacción proteína-proteína entre HCN1 y TRIP8b

El estudio de los canales iónicos a través de un sistema de expresión de forma heteróloga se ha convertido en una técnica básica en la investigación biomédica. En este manuscrito, se presenta un método eficiente de tiempo para conseguir la expresión del canal iónico fuertemente controlada mediante la realización de la transfección transitoria bajo el control de un promotor inducible.

Expresión Ion Channel controlable a través de la transfección transitoria inducible

Aquí, presentamos un protocolo cuantitativo y escalable para llevar a cabo pantallas de moléculas pequeñas dirigidas para los reguladores de quinasa de la transición pluripotente primitiva.

Un método simple para identificar quinasas que regulan la pluripotencia de las células madre embrionarias mediante la detección de inhibidores de alto rendimiento

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Una adaptación de semi-alto rendimiento del ensayo ATPase acoplado a NADH para la detección de inhibidores de moléculas pequeñas

Este protocolo describe un método para el estudio de proteínas de membrana electrogénicas midiendo los cambios en el potencial de membrana. Este ensayo proporciona una plataforma para la lectura funcional de múltiples canales iónicos expresados endógenamente en líneas celulares epiteliales.

Un ensayo basado en fluorescencia del potencial de membrana para el estudio funcional de alto rendimiento de dos canales iónicos endógenos en dos líneas celulares epiteliales

El presente protocolo destaca la aplicación de la técnica Western blotting para estudiar las funciones y actividades del cotransportador neuronal K-Cl KCC2. El protocolo describe la investigación de la fosforilación de KCC2 en los sitios reguladores de quinasa Thr906/1007 a través de Western blotting. Además, los métodos adicionales para confirmar la actividad de KCC2 se destacan brevemente en este texto.

Estudio de las funciones y actividades del cotransportador neuronal K-Cl KCC2 mediante Western Blotting

Este protocolo describe un método de cribado de alto rendimiento basado en citometría de flujo para identificar fármacos de moléculas pequeñas que inhiben la activación de la integrina β2 en neutrófilos humanos.

Una técnica de alto rendimiento basada en citometría de flujo para el cribado de fármacos inhibidores de integrinas

La focalización farmacológica de los canales iónicos es un enfoque prometedor para el tratamiento de tumores sólidos. Se proporcionan protocolos detallados para caracterizar la función de los canales iónicos en las células cancerosas y analizar los efectos de los moduladores de los canales iónicos en la viabilidad del cáncer.

Detección de canales iónicos en células cancerosas

Aprende a desarrollar un ensayo de fluorescencia cuantitativo para medir la actividad de canales de potasio rectificadores de entrada (Kir) mediante cribado de alto rendimiento. Este método permite identificar compuestos moduladores con aplicaciones terapéuticas en neurociencia.

De alto rendimiento para los moduladores de molécula pequeña de tráfico de perfeccionamiento activo Canales rectificador de potasio (Video) | JoVE Journal

De alto rendimiento para los moduladores de molécula pequeña de tráfico de perfeccionamiento activo Canales rectificador de potasio

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