De alto rendimiento para los moduladores de molécula pequeña de tráfico de perfeccionamiento activo Canales rectificador de potasio

El objetivo general de este procedimiento es descubrir nuevos compuestos que modulen la actividad de los canales de potasio rectificadores internos. Esto se logra mediante la primera siembra de células HK 2 9 3 inducibles por tetraciclina, que expresan un canal KIR de interés en una placa de 384 pocillos. El segundo paso es cargar las células con un tinte indicador de talio fluorescente llamado gripe en dos.

A continuación, el colorante no incorporado se lava de las células y se reemplaza con un tampón de ensayo que contiene un control de vehículo o compuestos de prueba. El paso final es la adición de un tampón de estímulo a los pocillos para iniciar el flujo de talio. En última instancia, se utiliza un lector de placas de fluorescencia para identificar los compuestos que cambian el movimiento de los iones de talio a través del canal KIR. Pobre.

La principal ventaja de este método sobre las técnicas existentes, como la electrofisiología manual de la pinza de parche, es que permite al investigador realizar cientos de experimentos simultáneamente y miles de experimentos diarios. Este método permite al investigador examinar bibliotecas de miles de moléculas pequeñas para descubrir moduladores de los canales de potasio rectificadores hacia adentro: Un día antes del experimento de flujo de talio, disociar las células y cuantificar la densidad de la suspensión celular como se describe en el manuscrito adjunto. A continuación, utilice el medio BH que contiene 20.000 células monoclonales con una placa FBS dializada al 10% transfectadas de forma estable con un gen de canal KIR de interés en cada pocillo de una placa de 384 pocillos recubierta de Amin con recubrimiento puro BD utilizando una combinación de gotas múltiples térmicas o una pipeta multicanal al día siguiente, inspeccione la placa bajo un microscopio para asegurarse de que las células estén adheridas y distribuidas uniformemente por el fondo de los pocillos.

A continuación, utilice una lavadora de microplacas ELX 4 0 5 para sustituir el medio de cultivo celular por el ensayo HBSS. Tampón a 20 microlitros por pocillo. Después de eso, prepare las gripes en una solución de carga D a las 2:00 a.m. centrifugando brevemente el tubo para disolver 50 microgramos de gripes en dos polvos en 100 microlitros de DMSO anhidro.

Ahora agregue 50 microlitros de una solución de 20% de peso por volumen onic F1 27 DMSO al tinte. Mézclalos pipeteando suavemente. A continuación, añada 150 microlitros de gripes en 2:00 AM onic F1 27 a 35 mililitros de ensayo HBSS, tampón y mezcle suavemente.

A continuación, agregue 20 microlitros de tampón de carga de colorante a cada pocillo que ya contenga 20 microlitros de ensayo HBSS. Búfer. Incube las células a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora mientras las células se cargan de tinte. Prepare una placa de estímulo de talio disolviendo recién 0,5 gramos de bicarbonato de sodio en 50 mililitros de cinco tampones de estímulo de talio.

Luego agregue 50 microlitros de la solución a cada pocillo de una placa de polipropileno de 384 pocillos después de que las células se hayan cargado con gripes a las 2:00 a.m. Lave la placa con una lavadora de microplacas ELX 4 0 5. A continuación, agregue 20 microlitros o 40 microlitros de ensayo HBSS. Vuelva a colocar en cada pocillo y la placa ya está lista para los experimentos.

Cargue el talio y las placas celulares en un sistema de detección de fármacos funcional Hema Matsu o en un lector de placas de imágenes cinéticas equivalente con capacidades integradas de dispensación de líquidos y utilice los filtros adecuados para tintes a base de fluoresceína, como el gripe oh four. Después de eso, configure un protocolo de adición única para agregar 10 microlitros de cinco series de talio X a los pocillos correspondientes de la placa celular que contiene 40 microlitros de tampón de ensayo HBSS. A continuación, registre la fluorescencia de referencia a una frecuencia de muestreo de un hercio durante al menos 10 segundos.

La fluorescencia de pocillo a pocillo debe ser uniforme y estable en toda la placa una vez que se establezcan las condiciones óptimas de recubrimiento celular, lavado y carga d. Mientras tanto, utilice el pipeteador integrado de 384 canales para agregar el tampón de estímulo de talio a cada pocillo simultáneamente y continúe el registro durante al menos dos minutos para que la tasa y el pico del aumento de fluorescencia inducido por el talio se capturen para el análisis fuera de línea. En la siguiente serie de experimentos, evalúe la uniformidad y la reproducibilidad del ensayo mediante la siembra de un inhibidor de control en cada dos pocillos de cada columna y fila de una placa de 384 pocillos y agregue DMSO a los otros pocillos como un vehículo de control.

Utilice un pipeteador multicanal. Fabrica una placa de DMSO compuesta pipeteando un inhibidor del canal KIR objetivo a la concentración determinada previamente a 80 microlitros por pocillo y un vehículo de DMSO al 0,1% en una placa de polipropileno de 384 pocillos. Esto se hace mediante la adición de un inhibidor conocido que comienza en el pocillo A uno y se alterna con el pocillo B dos, y así sucesivamente hasta el pocillo B 24.

Repita este procedimiento con DMSO comenzando en el pocillo, B uno y así sucesivamente hasta el pocillo A 24. Ahora cargue la celda con las placas de estímulo compuesto y de talio en el lector de placas. A continuación, configure un protocolo de dos adiciones para añadir 20 microlitros de las dos series de compuestos de concentración X a los pocillos correspondientes de la placa celular que contiene 20 microlitros de tampón de ensayo HBSS.

Agregue los compuestos a la placa de celdas e incube hasta 20 minutos a temperatura ambiente. Registre las gripes de referencia en dos fluorescencias durante al menos 10 segundos. A continuación, añada 10 microlitros de tampón de cinco x talio a cada pocillo de la placa celular.

Repita el experimento en tres días siguientes para establecer la reproducibilidad de los resultados. Utilice el flujo de talio en DMSO y células tratadas con fármacos para calcular un valor de Z prime. Una medida estadística de la variabilidad entre pocillos entre las dos poblaciones de pocillos calcula Z prime utilizando esta fórmula basada en las medias y desviaciones estándar de P y N, donde P es el valor de flujo no inhibido y N es el valor de flujo totalmente inhibido.

Un ensayo con valores de ZPrime mayores o iguales a 0,5 en tres días distintos se considera adecuado para el cribado de alto rendimiento. Estas figuras son algunos ejemplos de los mapas de placas celulares utilizados en diferentes tipos de experimentos. Las posiciones de los pocillos que contienen células no inducidas o inducidas por tetraciclina se indican en diferentes colores.

Esta figura muestra el mapa de placas de origen utilizado para determinar la concentración óptima de talio para el desarrollo del ensayo y el cribado de compuestos. El gradiente de color representa la serie de dilución triple que va desde el 100% hasta el 0,002% de talio, y aquí hay un mapa representativo de intensidad de fluorescencia con colores fríos a calientes, que indican valores de flujo de talio bajos a altos. El mapa de recubrimiento celular que se muestra aquí con un ajuste de la función logística de cuatro parámetros al CRC de talio se utiliza para determinar un valor EEC 80 de talio al 15%.

Esta figura muestra el mapa de la placa de origen utilizado para determinar la tolerancia DMSO de un ensayo. Las columnas uno y 24 contienen solo tampón de ensayo, mientras que el gradiente de color indica la serie de dilución doble que va desde el 10% hasta el 0,01% DMSO y aquí hay un mapa representativo de intensidad de fluorescencia con valores bajos de flujo de talio indicados con azul más oscuro. A continuación se resumen los valores medios de flujo de talio registrados en los pocillos que contienen las concentraciones indicadas de DMSO.

Ahora, esta figura muestra el mapa de placas de origen utilizado para establecer las curvas de respuesta de concentración para los inhibidores conocidos de un canal KIR. Cada compuesto se indica con un color diferente y, por lo general, se recubre como una serie de dilución triple. Aquí se muestra un mapa representativo de la intensidad de fluorescencia, y esta figura muestra la inhibición dependiente de la dosis del inhibidor del flujo de talio después de su desarrollo y optimización.

El ensayo de flujo de talio también se puede utilizar para realizar una variedad de ensayos farmacológicos de rutina. El ensayo de flujo de talio se ha adaptado previamente para su uso con canales de potasio ligados y de voltaje, canales catiónicos no selectivos e incluso transportadores de potasio. No olvide que trabajar con tellium puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes y la eliminación adecuada de desechos mientras se realiza este procedimiento.