Name: De alto rendimiento para los moduladores de molécula pequeña de tráfico de perfeccionamiento activo Canales rectificador de potasio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Aprende a desarrollar un ensayo de fluorescencia cuantitativo para medir la actividad de canales de potasio rectificadores de entrada (Kir) mediante cribado de alto rendimiento. Este método permite identificar compuestos moduladores con aplicaciones terapéuticas en neurociencia.

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<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+a+stable+form+of+tertiapin%3A+a+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 38 (43), 14286(1999).</li>
<li>Roy, A., McDonald, P. R., Sittampalam, S., Chaguturu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+access+high+throughput+drug+discovery+in+the+public+domain%3A+a+Mount+Everest+in+the+making%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Open access high throughput drug discovery in the public domain: a Mount Everest in the making.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (7), 764(2010).</li>
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<li>Lewis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+reveals+a+small-molecule+inhibitor+of+the+renal+outer+medullary+potassium+channel+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening reveals a small-molecule inhibitor of the renal outer medullary potassium channel and.</a> 76 (5), 1094(2009).</li>
<li>Bhave, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+selective+small-molecule+inhibitor+of+Kir1.1%2C+the+renal+outer+medullary+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Development of a selective small-molecule inhibitor of Kir1.1, the renal outer medullary potassium channel.</a> Mol. Pharmacol. 79 (1), 42(2011).</li>
<li>Raphemot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+structure-activity+relationships+of+an+inhibitor+of+inward+rectifier+potassium+%28Kir%29+channels+with+preference+for+Kir2.3%2C+Kir3.x%2C+and+Kir7.1%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1.</a> Front Pharmacol. 2, 75(2012).</li>
<li>Niswender, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+of+Gi%2Fo-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+the+group+III+metabotropic+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of the group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharmacol. 73 (4), 1213(2008).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Tratamiento de datos: Una vez recogidos los datos, un paso común en el análisis consiste en la normalización de la respuesta de fluorescencia de cada pocillo, F, a su valor inicial al comienzo del experimento, F 0. Esto se conoce comúnmente como la &quot;relación estática&quot; y simbolizado &quot;F / F 0&quot;. En los casos en que F 0 está dominado por el colorante indicador de la relación de operación estática sustancialmente para corregir muchos factores ta...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.
The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |
to:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.

Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> El número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> pcDNA5/TO </td><td> Invitrogen </td><td> V1033-20 </td><td> Inducible por tetraciclina vector de expresión </td></tr><tr><td> T-Rex-células HEK293 </td><td> Invitrogen </td><td> R71007 </td><td> La tetraciclina-inducible línea celular </td></tr><tr><td> LTX Lipofectamine / Plus reactivo </td><td> Invitrogen </td><td> 15338100 </td><td> Reactivo de transfección </td></tr><tr><td> FBS </td><td> ATLANTA Biológicos </td><td> S11550 </td><td> Medios de cultivo celular </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td> Medios de cultivo celular </td></tr><tr><td> Higromicina B </td><td> Invitrogen </td><td> 10687-010 </td><td> Medios de cultivo celular </td></tr><tr><td> Blasticidin S </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> R210-01 </td><td> Medios de cultivo celular </td></tr><tr><td> Penicilina / Estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> Medios de cultivo celular </td></tr><tr><td> HBSS-divalente libre </td><td> Mediatech </td><td> 21022CV </td><td> Lavado de células </td></tr><tr><td> Tripsina 0,25% </td><td> Mediatech </td><td> 25053CI </td><td> Disociación celular </td></tr><tr><td> Tetraciclina-HCl </td><td> Sigma </td><td> T9823 </td><td> Inducción reactivo </td></tr><tr><td> FBS dializado </td><td> ATLANTA Biológicos </td><td> S12650 </td><td> Medios de comunicación Revestimiento </td></tr><tr><td> FluoZin-2 </td><td> Invitrogen </td><td> F24189 </td><td> Colorante fluorescente </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P-3000MP </td><td> Dye carga </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14175 </td><td> Tampón de ensayo </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td> Tampón de ensayo </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td> Tl + estímulo tampón </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td> Tl + estímulo tampón </td></tr><tr><td> CaSO 4 • 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3771 </td><td> Tl + estímulo tampón </td></tr><tr><td> D-glucosa </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> Tl + estímulo tampón </td></tr><tr><td> Sulfato de talio </td><td> Aldrich </td><td> 204625 </td><td> Tl + estímulo tampón </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> Tl + estímulo tampón </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D4540 </td><td> Solvente </td></tr><tr><td> Ocho canales pipeta electrónica </td><td> Biohit </td><td> E300 </td><td> Célula de recubrimiento en el 384 -y placas </td></tr><tr><td> BD PureCoat amina recubiertos con placas de 384 pocillos </td><td> BD Biosciences </td><td> 356719 </td><td> Ensayo de microplacas </td></tr><tr><td> Echo calificado 384-así microplacas de polipropileno (384pp) </td><td> Labcyte </td><td> P-05525 </td><td> Microplacas compuesto fuente </td></tr><tr><td> 384-y microplacas de polipropileno </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 781280 </td><td></td></tr><tr><td> Multidrop Combi dispensador de reactivo </td><td> Thermo Scientific </td><td> 5840300 </td><td></td></tr><tr><td> ELx405 Lavador de microplacas </td><td> BioTek </td><td> ELx405HT </td><td> Lavado automático de células </td></tr><tr><td> Echo manipulador de líquidos </td><td> Labcyte </td><td> Labcyte Echo 550 </td><td></td></tr><tr><td> Bravo automatizado plataforma de manejo de líquidos </td><td> Agilent Technologies </td><td> Modelo estándar </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu FDSS 6000 </td><td> Hamamatsu </td><td></td><td> Kinetic imaging lector de placas </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Lista de Materiales y Reactivos.

de alto rendimiento para los moduladores de molécula pequeña de tráfico de perfeccionamiento activo canales rectificador de potasio

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Miembros específicos de la familia rectificador de potasio hacia el interior del canal (Kir) se postulan dianas de fármacos para una variedad de trastornos, incluyendo la hipertensión, fibrilación auricular, y 1,2 dolor. En su mayor parte, sin embargo, el progreso hacia la comprensión de su potencial terapéutico o funciones fisiológicas incluso básicos ha sido retrasado por la falta de buenos herramientas farmacológicas. En efecto, la farmacología molecular de la familia rectificador interno se ha quedado muy por detrás del de la superfamilia de S4 de potasio dependientes de voltaje (Kv) canales, para lo cual se han realizado una serie de afinidad nanomolar y péptidos moduladores selectivos de la toxina altamente descubiertos 3. El veneno de abeja tertiapin toxina y sus derivados son potentes inhibidores de Kir1.1 y Kir3 canales de 4,5, pero los péptidos son de uso limitado terapéuticamente así como experimentalmente, debido a sus propiedades antigénicas y una escasa biodisponibilidad, estabilidad metabólica y la penetrancia tejido. El desarrollo de potentesy selectivos de molécula pequeña sondas con mejores propiedades farmacológicas será una clave para un completo entendimiento de la fisiología y el potencial terapéutico de los canales Kir. El Bibliotecas Molecular Sondas Centro de Producción de red (MLPCN), apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) Fondo Común ha creado oportunidades para los científicos académicos para iniciar campañas de detección de la sonda para dianas moleculares y vías de señalización que necesitan una mejor farmacología 6. El MLPCN ofrece a los investigadores acceso a los centros de cribado a escala industrial y química médica y la informática apoyar el desarrollo de pequeñas moléculas sondas para elucidar la función de los genes y las redes de genes. El paso crítico en la obtención de la entrada a la MLPCN es el desarrollo de un ensayo robusto diana específica o vía-que es susceptible de cribado de alto rendimiento (HTS). Aquí se describe cómo desarrollar una fluorescencia basada en talio (Tl +) flujo ASSAy de Kir función del canal para la investigación de compuestos de alto rendimiento 7,8,9,10. El ensayo se basa en la permeabilidad de la K + poro del canal para el K + Tl + congénere. A comercialmente disponibles fluorescente Tl + colorante reportero se utiliza para detectar flujo transmembrana de Tl + a través del poro. Hay por lo menos tres colorantes comercialmente disponibles que son adecuados para TL + ensayos de flujo: BTC, FluoZin-2, y Fluxor 7,8. Este protocolo describe el desarrollo del ensayo utilizando FluoZin-2. Aunque originalmente desarrollado y comercializado como un indicador de zinc, FluoZin-2 exhibe un aumento robusto y dependiente de la dosis en la emisión de fluorescencia tras la unión Tl +. Comenzamos a trabajar con FluoZin-2 antes estaba disponible Fluxor 7,8 y han seguido haciéndolo 9,10. Sin embargo, los pasos en el desarrollo del ensayo son esencialmente idénticas para los tres tintes, y los usuarios deben determinar qué colorante es más apropiado para su específico nEEDS. También se discuten los puntos de referencia del ensayo de rendimiento que se deben alcanzar para ser considerado para la entrada en el MLPCN. Desde Tl + penetra fácilmente la mayoría de los canales de K +, el ensayo debe ser adaptable a la mayoría de los objetivos de los canales de K +.

El uso de un sistema de expresión inducible por tetraciclina proporciona un conveniente control interno para distinguir Tl + flujo a través de las vías endógenas y el canal Kir de interés. Figura 1 muestra algunos ejemplos de los mapas de galvanoplastia celulares utilizadas en diferentes tipos de experimentos. Las posiciones de los pocillos que contienen células no inducidas o tetraciclina inducida-se indican con diferentes colores. Figura 2A muestra el mapa de placa de fuent...

Los métodos para desarrollar y validar un ensayo cuantitativo de fluorescencia para medir la actividad de potasio rectificador de entrada (Kir) canales para la investigación de compuestos de alto rendimiento se presenta.

De alto rendimiento para los moduladores de molécula pequeña de tráfico de perfeccionamiento activo Canales rectificador de potasio

Se postula que miembros específicos de la familia de los canales de potasio rectificadores internos (Kir) son dianas farmacológicas para una variedad de trastornos, incluyendo la hipertensión, ...

El objetivo general de este procedimiento es descubrir compuestos novedosos que modulen la actividad de los canales de potasio rectificadores entrantes. Esto se logra primero sembrando células HK 2 9 3 inducibles por tetraciclina, que expresan un canal KIR de interés, en una placa de 384 pocillos. El segundo paso consiste en cargar las células con un colorante fluorescente indicador de talio denominado flu in two.A continuación, se eliminan mediante lavado el colorante no incorporado de las células y se reemplaza con tampón de ensayo que contiene un control vehicular o compuestos de prueba. El paso final consiste en la adición de un tampón estimulante a los pocillos para iniciar el flujo de talio. Finalmente, se utiliza un lector de placas de fluorescencia para identificar los compuestos que modifican el movimiento de iones de talio a través del canal KIR.Poor.La principal ventaja de este método frente a técnicas existentes como la electrofisiología manual con parche en modo ciego es que permite al investigador realizar cientos de experimentos simultáneamente y miles de experimentos diariamente. Este método permite al investigador cribar bibliotecas de miles de moléculas pequeñas para descubrir moduladores de los canales de potasio rectificadores entrantes. Un día antes del experimento de flujo de talio, disociar las células y cuantificar la densidad de la suspensión celular según se describe en el manuscrito adjunto. A continuación, usar el medio BH que contiene 10 % de FBS dializado para sembrar 20 000 células monoclonales, transfectadas establemente con un gen de canal KIR de interés, en cada pocillo de una placa de 384 pocillos recubierta con Amin de BD Pure Coat, utilizando un Multidrop Combi térmico o una pipeta multicanal. Al día siguiente, inspeccionar la placa bajo un microscopio para asegurarse de que las células están adheridas y distribuidas uniformemente en el fondo de los pocillos.Luego, use un lavador de microplacas ELX 405 para reemplazar el medio de cultivo celular con tampón HBSS de ensayo a 20 microlitros por pocillo. Después, prepare el flus en la solución de carga AM D 2:00 mediante una breve centrifugación del tubo para disolver 50 microgramos de flus en dos polvo en 100 microlitros de DMSO anhidro.Ahora agregue 50 microlitros de una solución al 20% peso por volumen de onic F1 27 en DMSO al colorante. Mézclelos pipeteando suavemente. Luego agregue 150 microlitros de flus en 2:00 AM onic F1 27 a 35 mililitros de tampón de ensayo HBSS y mezcle suavemente.A continuación, agregue 20 microlitros de tampón de carga del colorante a cada pocillo que ya contiene 20 microlitros de tampón de ensayo HBSS. Incube las células a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora mientras las células incorporan el colorante. Prepare una placa de estímulo con talio disolviendo recientemente 0,5 gramos de bicarbonato de sodio en 50 mililitros de tampón de estímulo con talio al cinco x.Luego, agregue 50 microlitros de la solución a cada pocillo de una placa de polipropileno de 384 pocillos después de que las células hayan sido cargadas con flus a las 2:00 a.m. Lave la placa con un lavador de microplacas ELX 405. A continuación, agregue 20 microlitros o 40 microlitros de tampón de ensayo HBSS a cada pocillo y la placa ya está lista para los experimentos.Cargue las placas de talio y de células en un sistema de cribado funcional de fármacos Hema Matsu o en un lector de placas con capacidad de imagen cinética equivalente con dispensación integrada de líquidos, y utilice los filtros adecuados para colorantes derivados de fluoresceína, como flu oh cuatro. A continuación, configure un protocolo de adición única para agregar 10 microlitros de cinco X serie de Talio a los pozos correspondientes de la placa de células que contienen 40 microlitros de tampón de ensayo HBSS. Luego registre la fluorescencia de línea base a una frecuencia de muestreo de un hercio durante al menos 10 segundos.La fluorescencia de pocillo a pocillo debe ser uniforme y estable en toda la placa una vez que se hayan establecido condiciones óptimas de siembra celular, lavado y carga. Mientras tanto, utilice el pipetador integrado de 384 canales para añadir simultáneamente el tampón de estímulo de talio a cada pocillo y continúe la grabación durante al menos dos minutos, de modo que se registren la velocidad y el pico del aumento inducido por talio en la fluorescencia para su análisis posterior. En la siguiente serie de experimentos, evalúe la uniformidad y la reproducibilidad del ensayo sembrando un inhibidor control en cada otro pocillo de cada columna y fila de una placa de 384 pocillos, y añada DMSO a los otros pocillos como control de vehículo.Utilice un pipetador multicanal. Prepare una placa de DMSO con compuestos pipeteando un inhibidor del canal KIR objetivo a la concentración determinada previamente, con 80 microlitros por pocillo y vehículo de DMSO al 0,1 %, en una placa de polipropileno de 384 pocillos. Esto se realiza añadiendo un inhibidor conocido comenzando en el pocillo A1, luego alternando al pocillo B2 y así sucesivamente hasta el pocillo B24.Repita este procedimiento con DMSO comenzando en el pozo B1 y así sucesivamente hasta el pozo A24. Ahora cargue la placa de células, la placa de compuestos y la placa de estimulación con talio en el lector de placas. A continuación, configure un protocolo de dos adiciones para agregar 20 microlitros de la serie de compuestos a concentración dos X a los pozos correspondientes de la placa de células que contienen 20 microlitros de tampón de ensayo HBSS.Añada los compuestos a la placa de células e incúbelos durante hasta 20 minutos a temperatura ambiente. Registre el flujo basal en dos fluorescencias durante al menos 10 segundos. Luego, añada 10 microlitros de tampón de talio al cinco x a cada pocillo de la placa de células.Repita el experimento durante tres días consecutivos para establecer la reproducibilidad de los resultados. Utilice el flujo de talio en células tratadas con DMSO y con fármaco para calcular un valor de Z prima. Una medida estadística de la variabilidad entre pocillos entre las dos poblaciones de pocillos, calcule Z prima utilizando esta fórmula basada en las medias y desviaciones estándar de P y N, donde P es el valor de flujo no inhibido y N es el valor de flujo completamente inhibido.Un ensayo con valores de ZPrime mayores o iguales a 0.5 en tres días diferentes se considera adecuado para la selección de alto rendimiento. Estas figuras son algunos ejemplos de los mapas de siembra celular utilizados en diferentes tipos de experimentos. Las posiciones de los pocillos que contienen células no inducidas o inducidas con tetraciclina se indican con diferentes colores.Esta figura muestra el mapa de la placa fuente utilizado para determinar la concentración óptima de talio para el desarrollo del ensayo y la selección de compuestos. El gradiente de color representa la serie de diluciones en tres veces, que varía desde 100% hasta 0,002% de talio, y aquí se presenta un mapa representativo de intensidad de fluorescencia con colores fríos a cálidos, que indican valores bajos a altos de flujo de talio. El mapa de siembra celular mostrado aquí, ajustado a una función logística de cuatro parámetros para la CRC de talio, se utiliza para determinar un valor EEC 80 de 15% de talio.Esta figura muestra el mapa de la placa de origen utilizado para determinar la tolerancia al DMSO en un ensayo. Las columnas uno y 24 contienen solo tampón de ensayo, mientras que el gradiente de color indica la serie de diluciones por duplicación que varía desde 10% hasta 0,01% de DMSO, y aquí se presenta un mapa representativo de intensidad de fluorescencia con valores bajos de flujo de talio indicados en azul más oscuro. Los valores promedio de flujo de talio registrados en las pocillos que contienen las concentraciones indicadas de DMSO se resumen aquí.Ahora este gráfico muestra el mapa de la placa de origen utilizado para establecer curvas de respuesta frente a la concentr游戏副本El ensayo de flujo de talio también puede utilizarse para realizar una variedad de ensayos farmacológicos rutinarios. El ensayo de flujo de talio se ha adaptado previamente para su uso con canales de potasio voltaje-dependientes y ligando-dependientes, canales catiónicos no selectivos e incluso transportadores de potasio. No olvide que trabajar con talio puede ser extremadamente peligroso y que siempre deben tomarse precauciones, como el uso de guantes y la eliminación adecuada de desechos, durante la realización de este procedimiento.

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Investigación

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Biología

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De alto rendimiento para los moduladores de molécula pequeña de tráfico de perfeccionamiento activo Canales rectificador de potasio (Video) | JoVE Journal

De alto rendimiento para los moduladores de molécula pequeña de tráfico de perfeccionamiento activo Canales rectificador de potasio

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