Name: piggyBac Transposón modificación del sistema de células T humanas primarias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Aprende a modificar genéticamente células T humanas primarias usando el sistema de transposón piggyBac no viral. Este método permite una expresión estable del transgen para aplicaciones terapéuticas e investigación inmunológica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SS es apoyado en parte por el Mediterráneo HHMI en Grad formación de subvención a través del Programa TBMM. MHW es apoyado en parte por un premio de desarrollo de carrera en el Departamento de Asuntos de Veteranos y el generoso apoyo del Dr. y la Sra. Harold M. Selzman. Este trabajo fue apoyado en parte por el NIH subvención SPORE linfoma P50CA126752 y NIH R01 DK093660.

Día 0 1. Aislamiento de PBMC de la sangre humana <ol><li> Recoger 20 ml de sangre humana fresca mediante punción venosa en tubos vacutainer con heparina Na-. </li><li> Mezcla de sangre y avanzada RPMI 1.640 en 1:1 (v / v). </li><li> Añadir 20 ml de medio de Lymphoprep a un tubo de centrífuga de 50 ml (25 ° C). Lentamente capa de 25-30 ml de sangre-RPMI 1.640 mezcla en la parte superior de la Lymphoprep. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 40 min sin frenos. </li><li> Recoge los dos capas distintas y difusa utilizando una pipeta desechable en 10 ml de PBS 1x (25 º C) y llevar el volumen hasta 50 ml con PBS 1x. </li><li> Centrifugar a 450 xg durante 10 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante completamente y añadir 20 ml de RPMI avanzada 1.640. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante. Añadir 10 ml de medios completos de células T suplementado con 5 ng / ml de rhIL-15 precalentado a 37 ° C. </li><li> Contar el número de células y la placa 24 en una capa de cultivo de tejidosed placa a 2 x 10 6 células / pocillo en medio de células T completos suplementado con 5 ng / ml rhIL-15 Añadir agua estéril a los pozos circundantes. Incubar durante una noche en un incubador humidificado a 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> Día 1 2. Las placas de revestimiento con anti-CD28 y anti-CD3 Anticuerpo para la estimulación de las células T <ol><li> Diluir los anticuerpos anti-CD28 y anti-CD3 en agua estéril a una concentración de 1 mg / ml cada uno. </li><li> Añadir 500 l solución de cada anticuerpo a 5 pozos marcados de un cultivo de tejido no recubierto de 24 pocillos de la placa. </li><li> Añadir agua estéril para descansar de los pozos. Envuelva la placa de plástico de embalar y colocar en un refrigerador a 4 º C. </li></ol> 3. Nucleofection de células T estimuladas <ol><li> Precaliente los medios de células T a 37 ° C y el suplemento con 5 ng / ml de rhIL-15. Preparar la solución de nucleofector completa mediante la adición de 500 l de Nucleofector Suplemento 1 a 2,25 ml de la solución de Nucleofector. </li><li> Laliquot 5 g de cada uno de transposón (Zeo-PT-CMV-EGFP) y transposasa (pCMV-piggyBac) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml Nota:. puede ser necesario para optimizar la transposasa y la cantidad transposón de ADN para la administración de genes y óptima para minimizar toxicidad celular. Los plásmidos se pueden obtener de los autores por solicitud. </li><li> PBMCs Cosecha del 24 placa de cultivo de tejidos en un tubo de 50 ml. Contar el número de células. Guardar 2 x 10 6 células para su uso como control durante la citometría de flujo. </li><li> Añadir 7-10 x 10 6 células a un tubo de 15 ml y se centrifuga a 400 xg, 5 min, aspirar el sobrenadante y el dedo de golpe de la pastilla. </li><li> Añadir 100 l de solución de células T nucleofection completa a células aflojado pellet. </li><li> Añadir la mezcla de la solución de células para el tubo que contiene los plásmidos. </li><li> Añadir la mezcla de solución de células plásmido a la parte inferior de la cubeta nucleofection. Tenga cuidado de no introducir burbujas. </li><li> Nucleofect las células por medio de programo de U-014 (células T estimuladas, humanos <a href="http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/" target="_blank">http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/</a> ). </li><li> Añadir inmediatamente 500 l de los medios precalentados con rhIL-15 a la cubeta. Transferir las células a un pocillo de una placa de pocillos 24 con 1,5 ml de medio precalentado con rhIL15. </li><li> Incubar durante una noche en un incubador humidificado a 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> Día 2 4. La estimulación no específica de células T <ol><li> Cosecha de células y determinar el número de células. Ponga a un lado 0,5 x 10 6 células para citometría de flujo para determinar la frecuencia de las buenas prácticas agrarias de células positivas. Usa los PBMCs no transfectadas como controles. </li><li> Aspirar la solución de anticuerpo CD3/28 de la placa de cultivo de tejido recubierto no y enjuagar cada pocillo con medio de células T. </li><li> Resuspender las células en nucleofected 0,5 x 10 6 células por ml en medios completos de CTLsuplementado con 5 ng / ml de rhIL-15. Añadir 2,0 ml de cada una de las células nucleofected en 4 pocillos de la placa de cultivo de tejidos no. Añadir 0,5 x 10 6 células nucleofected no a la 5 ª también. </li><li> Incubar durante 3 días en un incubador humidificado a 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> Día 5 <ol><li> Recoger las células T estimuladas de la placa de tejido no recubierto de la cultura. </li><li> Contar y replate las células en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillo recubierto a 0,7 x 10 6 células / ml en medio de células T con 5 ng / ml de IL-15. </li></ol> Día 7 7. Análisis de la Expresión Génica <ol><li> Cosecha células y tinción con anti-CD8 humana de anticuerpos (también podría usar anti-CD3 y anti-CD4) y ​​analizar con citometría de flujo para la expresión de GFP%. </li></ol> Día 8 (Opcional) 8. La expansión de las células T <ol><li> El día 8 después de la transfección, las células T pueden ser resembradas en T-Medios de comunicación celulares con IL-15 a una densidad de 0,7 x 10 6 células por pocillo para una mayor expansión 16. </li></ol>

<ol><li>Cary, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+mutagenesis+of+baculoviruses%3A+analysis+of+Trichoplusia+ni+transposon+IFP2+insertions+within+the+FP-locus+of+nuclear+polyhedrosis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses.</a> Virology. 172 (1), 156(1989).</li>
<li>Fraser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+for+movement+of+Lepidopteran+transposon+IFP2+in+insect+cells+using+a+baculovirus+genome+as+a+target+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA.</a> Virology. 211 (2), 397(1995).</li>
<li>Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transposition+of+the+piggyBac+%28PB%29+transposon+in+mammalian+cells+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice.</a> Cell. 122 (3), 473(2005).</li>
<li>Saridey, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiggyBac+transposon-based+inducible+gene+expression+in+vivo+after+somatic+cell+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer.</a> Mol. Ther. 17 (12), 2115(2009).</li>
<li>Nakanishi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposon-mediated+long-term+gene+expression+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice.</a> Mol. Ther. 18 (4), 707(2010).</li>
<li>Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiggyBac+Transposon-mediated+Gene+Transfer+in+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells.</a> Mol. Ther. 15 (1), 139(2007).</li>
<li>Nakazawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+PiggyBac+transposon+system+for+the+sustained+genetic+modification+of+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes.</a> J. Immunother. 32 (8), 826(2009).</li>
<li>Raja Manuri, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposon%2Ftransposase+system+to+generate+CD19-specific+T+cells+for+treatment+of+B-lineage+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 21 (4), 427(2010).</li>
<li>Doherty, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+piggyBac+gene+transfer+in+human+cells+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo.</a> Hum. Gene Ther. , In Press (2011).</li>
<li>Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531(2011).</li>
<li>Bonini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of T cells.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 17, Suppl 1. S15-S20 (2011).</li>
<li>Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon+and+transposase+system+for+human+application%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">A transposon and transposase system for human application.</a> Mol. Ther. 18 (4), 1531(2010).</li>
<li>Galvan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+PiggyBac+transposon+integrations+in+primary+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells.</a> J. Immunother. 32 (8), 837(2009).</li>
<li>Nakazawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiggyBac-Mediated+Cancer+Immunotherapy+Using+EBV-Specific+Cytotoxic+T-Cells+Expressing+HER2-Specific+Chimeric+Antigen+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor.</a> Mol. Ther. 19 (12), 2133(2011).</li>
<li>Huye, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+mTor+Inhibitors+With+Rapamycin-resistant+T+Cells%3A+A+Two-pronged+Approach+to+Tumor+Elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination.</a> Mol. Ther. 19 (12), 2239(2011).</li>
<li>Vera, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+production+of+antigen-specific+T+cells+for+preclinical+and+clinical+applications+using+gas-permeable+rapid+expansion+cultureware+%28G-Rex%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex).</a> J. Immunother. 33 (3), 305(2010).</li>
<li>Kahlig, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+transposon-mediated+stable+gene+transfer+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343(2010).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método descrito en la presente memoria permite la modificación transgén estable de linfocitos T primarios humanos. Anteriormente hemos probado el uso del sistema de transposón piggyBac para modificar las células T para expresar un gen reportero (por más de 4 semanas), un gen suicida no inmunogénico, un receptor de antígeno quimérico para la inmunoterapia adoptiva (durante más de 100 días), y para diseñar la resistencia a los medicamentos inmunosupresores 7,13-15. No viral modificación de las célul...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Lympholyte </td><td> Cedarlane </td><td> CL5015 </td><td></td></tr><tr><td> Advanced RPMI 1640 </td><td> Life Technologies </td><td> 12633020 </td><td></td></tr><tr><td> Hyclone suero fetal bovino </td><td> Fisher Scientific </td><td> SH3008803 </td><td></td></tr><tr><td> GlutaMAX-I Suplemento </td><td> Life Technologies </td><td> 35050-061 </td><td></td></tr><tr><td> IL-15 humana proteína recombinante </td><td> eBioscience </td><td> 14-8159 </td><td></td></tr><tr><td> Kit EndoFree Plasmid Maxi </td><td> Qiagen </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001S </td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Human T Cell Nucleofector Kit </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CD8-APC </td><td> Southern Biotech </td><td> 9536-11 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD3 humano </td><td> eBioscience </td><td> 16-0037-81 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD28 humano </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555725 </td><td></td></tr><tr><td> Plate 24 Cultivo de Tejidos bien tratados </td><td> BD Falcon </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 24 Cultivo de Tejidos Pues no tratados Plate </td><td> BD Falcon </td><td> 351147 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Completa de células T medios composición 1x avanzada RPMI 1640 5% inactivado por calor suero fetal bovino 2 mM GlutamaxIM-I </td></tr></tbody></table>

piggybac transposón modificación del sistema de células t humanas primarias

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

El sistema de transposón piggyBac es naturalmente activo, originalmente derivado del 1,2 falso medidor polilla. Este sistema no viral es el plásmido basada, más comúnmente utilizando dos plásmidos con uno que expresa la enzima transposasa piggyBac y un transposón plásmido que alberga el gen (s) de interés entre los elementos de repetición invertida que se requieren para la actividad de transferencia génica. PiggyBac media la transferencia de genes a través un &quot;cortar y pegar&quot; mecanismo por el que la transposasa integra el segmento de transposón en el genoma de la célula diana (s) de interés. PiggyBac ha demostrado actividad eficiente de suministro de genes en una amplia variedad de 1,2 insectos, mamíferos 3-5, y humano cells6 incluyendo células T humanas primarias 7,8. Recientemente, una transposasa hiperactiva piggyBac fue generado mejorar la eficiencia de transferencia génica 9,10. Los linfocitos T humanos son de intere clínicast para la inmunoterapia adoptiva del cáncer 11. Es de destacar que el primer ensayo clínico que incluyó la modificación transposón de células T humanas mediante el sistema transposón Sleeping beauty ha aprobado 12. Anteriormente hemos evaluado la utilidad de piggyBac como una metodología no viral para la modificación genética de las células T humanas. Hemos encontrado piggyBac ser eficaz en la modificación genética de las células T humanas con un gen informador y un gen inducible no inmunogénica suicida 7. Análisis de los sitios de integración genómica reveló una falta de preferencia para la integración en o cerca de conocidos proto-oncogenes 13. Se utilizó piggyBac para modificar genes linfocitos T citotóxicos para llevar a un receptor de antígeno quimérico dirigido contra el antígeno tumor HER2, y encontraron que las células modificadas con gen-T mediada asesinato selectivo de HER2-positivas las células tumorales in vitro e in vivo en un modelo de ratón ortotópico 14. También hemos utilizado piggyBacpara generar las células T humanas resistentes a la rapamicina, que debe ser útil en terapias para el cáncer donde la rapamicina se utilizaron 15. En este documento, se describe un método para utilizar piggyBac para modificar genéticamente células T humanas primarias. Esto incluye el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de sangre humana seguido de cultivo, modificación del gen, y la activación de las células T. Para el propósito de este informe, las células T fueron modificados con un gen reportero (eGFP) para el análisis y la cuantificación de la expresión génica mediante citometría de flujo. PiggyBac se puede utilizar para modificar las células T humanas con una variedad de genes de interés. Aunque hemos utilizado piggyBac dirigir a las células T a antígenos tumorales 14, también hemos utilizado piggyBac para añadir un interruptor de seguridad inducible con el fin de eliminar las células de genes modificados si es necesario 7. La gran capacidad de carga de piggyBac también ha permitido la transferencia de genes deuna gran resistencia rapamicina moléculas mTOR (15 kb) 15. Por lo tanto, se presenta una metodología no viral para estable de genes modificación de células T humanas primarias para una amplia variedad de propósitos.

Un esquema que demuestra los pasos en la modificación genética de los linfocitos T humanos con un gen reportero (eGFP) se muestra en la figura 1. Estos plásmidos están disponibles a petición de los autores. Un schemtic demostrando los pasos en modificados genéticamente linfocitos T humanos con un gen reportero (eGFP) es showin en la Figura 2. Es necesario activar las células T con el fin de conseguir que se dividen, se expanden, y se propagan en cultivo. Humanas modificadas células T se...

Se describe un método para modificar genéticamente las células T humanas primarias con un transgén mediante el no viral<em&gt; PiggyBac</em&gt; Transposón sistema. Células T modificado para usar el<em&gt; PiggyBac</em&gt; Transposón expresión sistema de exhibición transgén estable.

piggyBac Transposón modificación del sistema de células T humanas primarias

El sistema de transposones piggyBac es naturalmente activo y se derivó originalmente de la polilla cabbage looper1,2. Este sistema no viral se basa en plásmidos, la mayoría...

El objetivo general de este procedimiento es modificar genéticamente de forma estable linfocitos T humanos primarios mediante un sistema de transposón no viral. Primero, recolecte sangre humana y luego aísle las células mononucleares de la sangre periférica; a continuación, realice la nucleofección de las PBMC con el sistema de transposón piggyBac y un transgén de interés, como EGFP. A continuación, estimule los linfocitos T para que proliferen en cultivo.Luego analice los linfocitos T para evaluar la expresión del transgén. En última instancia, se utiliza el análisis por citometría de flujo para demostrar la expresión estable del transgén en linfocitos T modificados con el sistema de transposón piggyback. A diferencia de la transfección con plásmidos en linfocitos T humanos, los transposones tienen la ventaja de integrar de manera estable los transgenes para una expresión a largo plazo.El truco consiste en seguir un protocolo muy específico al manipular las BMC-P durante el aislamiento y tras la nucleofección. Primero implementamos este método para generar líneas celulares estables humanas cultivadas que expresan diferentes genes. Este enfoque ayuda a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como cómo se pueden modificar las células T para mejorar su funcionamiento. Demostrarán el procedimiento Sunon y Saha, un estudiante de posgrado de mi laboratorio, mediante venipunción.Recolecte 20 mililitros de sangre humana fresca en tubos vacutainer con heparina sódica. Mezcle la sangre con medio RPMI 1640 avanzado en una proporción uno a uno. Luego agregue 20 mililitros de medio lympho prep a un tubo de centrífuga de 50 mililitros.Coloque lentamente 25 a 30 mililitros de la sangre diluida encima del linfoprep y centrifugue a 400 × g durante 40 minutos sin frenado. Transfiera tanto la capa definida como la capa difusa a 10 mililitros de PBS a temperatura ambiente. Ajuste el volumen final a 50 mililitros con PBS.Luego, recoger las células mediante centrifugación a 450 veces G durante 10 minutos, aspirar completamente el sobrenadante y lavar las células una vez con 20 mililitros de RPMI avanzado tras la centrifugación Resus. Suspender el botón celular en 10 mililitros de medio completo para linfocitos T, suplementado con cinco nanogramos por mililitro de IL-15 humana recombinante. Enumerar ahora las células en una placa de cultivo de tejidos con 24 pocillos recubiertos, sembrando dos veces 10 a la sexta células por pocillo.Luego, agregue agua estéril a los pocillos circundantes. Incube las BMC-P durante la noche en un incubador humedecido a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Diluya los anticuerpos anti-CD28 y anti-CD3 en agua estéril hasta una concentración de un microgramo por mililitro.Añada 500 microlitros de cada solución de anticuerpo a cinco pozos marcados de una placa de cultivo celular de 24 pozos sin recubrir. Luego, añada agua estéril al resto de los pozos. Envuelva la placa y colóquela a cuatro grados Celsius.Precaliente el medio para linfocitos T a 37 grados Celsius y suplemente con cinco nanogramos por mililitro de IL-15 humana recombinante. También prepare una solución fresca de nucleoefector completo. Ahora, alícuote cinco microgramos de cada uno de los transposones y transposasa en un tubo fuge de 1,5 mililitros.Puede ser RY optimizar la transposición de A y la cantidad de ADN transposónico para una entrega génica óptima. Y para minimizar la toxicidad celular, recolecte los PBMCs de la placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos en un tubo de 50 mililitros. Después de contar las células, guarde dos veces 10 a la sexta PBMCs para usarlas como control durante la citometría de flujo.A continuación, agregue entre siete y diez millones de células a un tubo de 15 mililitros y centrifugue a 400 × g durante cinco minutos. Aspire el sobrenadante y golpee suavemente con el dedo el botón celular. Agregue 100 microlitros de solución completa para nucleofección de linfocitos T al botón celular desagregado.Ahora agregue la mezcla de células en solución a los plásmidos. A continuación, agregue la mezcla de células y plásmidos a la parte inferior del vial de nucleoafectación. Tenga cuidado de no introducir burbujas, ya que pueden afectar las células. Nucleoafecte las células utilizando el programa U guion 0 1 4.Para linfocitos T humanos no estimulados, transfiera las células a un pocillo que contenga 1,5 mililitros de medio precalentado más R-H-I-I-L 15, e incube las células nucleares no estimuladas afectadas en un incubador de cultivo celular durante la noche. Después de recolectar las células, determine el número de células y reserve 0,5 veces 10 a la sexta parte de los PBMC no transfectados como controles para la determinación mediante citometría de flujo de la frecuencia de células positivas para GFP. Luego aspire la solución de anticuerpo CD 3 28 del placa no revestida para cultivo celular y enjuague cada pocillo con medio para linfocitos T, y resuspenda.Las células nucleofectadas a 0,5 veces 10 a la sexta células por mililitro. En medio CTL completo, suplementado con cinco nanogramos por mililitro de RH IL-15, añada 2,0 mililitros. Cada una de las células nucleofectadas en cuatro pocillos de la placa no destinada al cultivo de tejidos.Añada 0,5 veces 10 a la sexta. Las células afectadas no nucleares a la quinta. Incube la placa durante tres días en un incubador humedecido a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono.El día cinco, recolecte los linfocitos T estimulados de la placa de cultivo celular sin recubrir. Luego, en una placa de cultivo celular de 24 pocillos recubierta, suspenda las células a 0,7 × 10⁶ células por mililitro en medio para linfocitos T que contenga cinco nanogramos por mililitro de IL-15. Después de recolectar las células, realice tinción inmunológica para CD8, CD3 o CD4 para determinar el porcentaje de expresión de GFP, y analice las preparaciones celulares mediante citometría de flujo si se requiere la expansión de los linfocitos T.Luego, en el día ocho, siembre las células transfectadas a una densidad de 0,7 × 10⁶ células por pocillo en medio para linfocitos T que contiene IL-15 para la modificación génica mediada por piggyback de linfocitos T humanos. Las células humanas primarias se transfectan con dos plásmidos. El plásmido del transposón dirige la expresión constitutiva de la proteína piggyback bajo un promotor CMV.El transposón en el plásmido contiene el gen reportero GFP y los repeticiones invertidas piggyback necesarias para la transferencia génica. La expresión estable del transgén GFP en linfocitos T modificados con el sistema transposónico piggyback puede estudiarse mediante análisis por citometría de flujo. Aquí, las células fueron marcadas con un anticuerpo conjugado con PC anti-CD8 y analizadas por fluorescencia de EGFP y A PC al día uno.La expresión de EGFP se detecta en el 76,4 % de las células positivas para CD8. La disminución en la expresión de EGFP entre el día uno y el día siete se debe probablemente al hecho de que no todas las células transfectadas experimentan una integración estable del ADN del transposón. En este momento, debería tener una buena comprensión de cómo aislar PBMC y realizar una transducción génica estable.Modifíquelos con el sistema de transposición piggyback. No olvide utilizar una técnica estéril al realizar la flebotomía. Trabaje rápidamente para preservar la viabilidad celular.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como un ensayo de citotoxicidad de linfocitos T, con el fin de determinar la especificidad del antígeno de los linfocitos T. Experimentos futuros explorarán el uso de transposones para la inmunoterapia basada en linfocitos T contra el cáncer y en ratones.

piggybac-transposon-system-modification-of-primary-human-t-cells

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Se presenta un protocolo para producir antígenos específicos de células T de ratón usando la transducción...

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

Este video muestra el procedimiento para generar neuronas motoras mediante la transfección de iPSCs humanas con el sistema de transposones PiggyBac mediante la expresión ectópica de factores de transcripción específicos del linaje.

Edición génica mediada por transposones PiggyBac en iPSC humanas: un procedimiento para integrar genes de interés en iPSC humanas utilizando el sistema de transposones PiggyBac

Las células T que expresan un receptor CD19 específico de antígeno quimérico (CAR) se infunden como tratamiento de investigación de células B malignas en nuestros primero en humanos ensayos de terapia génica. Se describe la modificación genética de las células T utilizando...

Aplicación clínica de<em&gt; La Bella Durmiente</em&gt; Artificial y células presentadoras de antígenos para modificar genéticamente las células T de la sangre del cordón umbilical y periférica

En este estudio, generamos células madre pluripotentes inducidas a partir de células de líquido amniótico de ratón, utilizando un sistema de transposones no viral.

La producción de células madre pluripotentes a partir de células de ratón amniótico líquido mediante un sistema de transposón

Este protocolo describe un método para lograr la integración estable del gen de interés en el genoma humano por el sistema transcripcionalmente regulado de La bella durmiente . Preparación de la integración de vectores lentivirales defectuosos, la transducción en vitro de las células humanas y el análisis molecular de células transduced se divulgan.

Un método de transposición eficiente In Vitro por un sistema de belleza durmiente transcripcionalmente regulada en un Vector lentivirales defectuosa integración

Delineamos un protocolo de 9 días para la transducción y expansión de células mononucleares de sangre periférica de rhesus macaque que produce células con excelente coexpresión de los genes de interés en número suficiente para estudios de infusión de eficacia celular.

Transducción y expansión de células T primarias en nueve días con mantenimiento del fenotipo de memoria central

Aquí, describimos un método detallado para la edición de genes sin fisuras en células madre pluripotentes humanas utilizando un plásmido donante basado en piggyBac y el mutante de nickasa Cas9. Se introdujeron dos mutaciones puntuales en el exón 8 del locus alfa del factor nuclear 4 de hepatocitos (HNF4α) en células madre embrionarias humanas (hESCs).

Introducción de mutaciones puntuales en células madre pluripotentes humanas mediante la edición perfecta del genoma

Hemos desarrollado un protocolo para transfectar células epiteliales pigmentarias humanas primarias por electroporación con el gen que codifica el factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) utilizando el sistema de transposones de la Bella Durmiente (SB). La transfección exitosa se demostró mediante reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (qPCR), inmunotransferencia y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

Modificación genética basada en electroporación de células epiteliales pigmentarias humanas primarias utilizando el sistema de transposones de la Bella Durmiente

Aquí, se presenta un protocolo para aislar y transfectar el iris primario y las células epiteliales pigmentarias de la retina de varios mamíferos (ratones, ratas, conejos, cerdos y bovinos). El método es ideal para estudiar los enfoques de terapia génica ocular en varias instalaciones para análisis ex vivo y estudios in vivo transferibles a humanos.

Aislamiento, cultivo e ingeniería genética de células epiteliales de pigmento primario de mamíferos para terapia génica no viral

La transformación exitosa de la línea germinal en el gusano cogollero, Spodoptera frugiperda,se logró utilizando ARNm de la transposasa hiperactiva piggyBac.

PiggyActivoBac Transformación de la línea germinal mediada por transposasa en el gusano cogollero, Spodoptera frugiperda

Se proporciona un protocolo detallado para el uso de la tecnología CRISPR/Cas9 para lograr un knock-in dirigido altamente eficiente de grandes construcciones multicistrónicas en células T humanas primarias a través de la vía de reparación del ADN de unión de extremos mediada por homología (HMEJ). Las células T diseñadas con este protocolo adaptable a las buenas prácticas de fabricación actuales mantienen una excelente expansión celular, citotoxicidad y producción de citocinas.

Ingeniería no viral de células T humanas primarias mediante la integración dirigida de grandes plantillas de ADN mediada por homología

Aprende a modificar genéticamente células T humanas primarias usando el sistema de transposón piggyBac no viral. Este método permite una expresión estable del transgen para aplicaciones terapéuticas e investigación inmunológica.

piggyBac Transposón modificación del sistema de células T humanas primarias

Explorar más videos