Los modelos de metástasis en los huesos

El objetivo general de este procedimiento es inyectar células tumorales de una manera que induzca el crecimiento de células tumorales en el hueso y la posterior destrucción ósea. Esto se logra primero volviendo a doblar las células tumorales en PBS frío y colocándolas en hielo. A continuación, se inyecta un número adecuado de células en el ventrículo cardíaco izquierdo o en la tibia de un ratón anestesiado.

A continuación, el crecimiento del tumor óseo y los parámetros óseos se monitorizan longitudinalmente mediante múltiples técnicas de imagen. Por último, se lleva a cabo la cuantificación de los parámetros tumorales y óseos. En definitiva, una combinación de fluorescencia o luminiscencia in vivo y ex vivo radiografía 2D 3D.

La microtomografía computarizada y la histología se utilizan para mostrar el crecimiento tumoral y los cambios en el microambiente óseo a nivel celular y estructural del crecimiento. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la metástasis del cáncer, como qué factores en el hueso permiten la colonización metastásica del cáncer de mama y próstata. La demostración de la preparación celular estará a cargo de Alisa Merkel, asistente de investigación en mi laboratorio, Maintain cells for least than one week.

Que albergan el clon M-D-A-M-B 2 3 1 marcado con GFP en DMEM que contiene 10%FBS y 0,1 miligramos por mililitro. Penicilina estreptomicina a 37 grados centígrados en cinco a 8%Dióxido de carbono masajee las células al 80 a 90% de confluencia y reemplácelo a una dilución de 1 a 10. Para preparar las células para la inoculación, la tripsina las vigila al 80 a 90%confluencia con 0,15%tripsina EDTA utilizando 10 mililitros.

DMEM helado con 10%FBS transfiere inmediatamente las células a un tubo cónico de 50 mililitros y centrifusiona durante cinco minutos. Vuelva a suspender el pellet en un tubo cónico de 50 mililitros en 25 mililitros. PBS helado sin calcio y magnesio y contar las células, repeler las células y resuspender un PBS helado a una concentración de 10 a las seis células por mililitro para la inoculación intracardíaca y 250.000 células por mililitro para la inyección intratibial.

Para estos experimentos se utilizan ratones hembra inmunodeprimidos de cuatro a seis semanas de edad que han sido alimentados con una dieta Tela 29 20 x de cinco a 10 días antes de la inyección. Después de anestesiar al ratón en una cámara con 2,5% de flúor, mueva el ratón bajo una capucha ventilada hasta un cono de nariz y coloque el ratón boca arriba. Use una solución de yodo de povidona al 10% para lavar el pecho, seguida de etanol al 70%.

Marque el pecho del ratón para la inyección a medio camino entre la muesca esternal y la parte superior de la apófisis xifoides y ligeramente a la izquierda del esternón. A continuación, utilizando una jeringa de insulina de media pulgada de calibre 28 de 300 microlitros. Dibuja una pequeña bola de aire para crear espacio entre el émbolo y el menisco y extrae 100 microlitros de células mientras sostienes la piel de la tortuga del ratón con una mano.

Mantenga la aguja en posición vertical e insértela con éxito en el ventrículo cardíaco izquierdo debe dar lugar a un pulso distintivo de sangre de color rojo brillante en la jeringa. A esta profundidad, presione con cuidado el émbolo de la jeringa sin mover significativamente la aguja para evitar perforar el corazón o derramar células en la cavidad torácica. Para reducir el goteo de células en la cavidad torácica, tire ligeramente hacia arriba del émbolo para crear una pequeña cantidad de presión negativa.

Luego, tire de la aguja directamente hacia afuera del pecho mientras se asegura de evitar inclinar la aguja durante la extracción, lo que puede desgarrar el revestimiento del corazón y causar sangrado. Aplique una presión suave sobre el sitio de la inyección para reducir el sangrado durante aproximadamente un minuto. Mientras retira el cono de la nariz, mueva el mouse a una almohadilla térmica hasta que esté completamente consciente.

Inmediatamente antes del procedimiento intratibial, inyecte al ratón bup printex. Después de anestesiar al ratón y colocarlo en un cono nasal. Limpie ambas piernas con yodo de povidona al 10%, seguido de etanol con cuatro dedos y pulgar.

Agarre suavemente el maléolo lateral, el maléolo medial y la mitad inferior de la tibia. A continuación, dobla la pierna para que la rodilla sea visible y accesible. Con etanol al 70%, humedezca la piel para aumentar la visibilidad del ligamento rotuliano subyacente, que debe ser visible como una línea blanca gruesa distintiva mientras agarra firmemente el tobillo.

Inserte una aguja de media pulgada de calibre 28 debajo de la rótula a través de la mitad del ligamento rotuliano y en el área intercondílea anterior en la parte superior de la tibia. Use una presión firme y constante con una ligera acción de perforación para guiar cuidadosamente la aguja a través de la placa de crecimiento. Al penetrar la placa de crecimiento tibial, la aguja encontrará una resistencia notablemente menor.

Use un movimiento lateral suave de la aguja para asegurarse de que esté en la tibia y a través de la placa de crecimiento. El movimiento será limitado si la aguja está en el lugar adecuado dentro de la tibia. Presione lentamente el émbolo para inyectar 10 microlitros de solución celular.

Poca o ninguna resistencia debería sentirse en este punto. A continuación, extraiga lentamente la aguja. Retire el ratón de la anestesia y manténgalo sobre una almohadilla térmica hasta que se recupere.

Monitoree el mouse dos o tres veces por semana. Una variedad de técnicas de imagen como luciferasa, fluorescencia GFP y rayos X se llevan a cabo en ratones anestesiados. La fluorescencia indica áreas de tumor.

Se utiliza una gammagrafía de estron para localizar las lesiones. Las lesiones se correlacionan con las imágenes de fluorescencia. Se pueden encontrar más detalles sobre las técnicas de imagen en la parte escrita de este protocolo.

21 a 35 días después de la inyección. Sacrifique los ratones utilizando un método aprobado por iacuc y almacene los huesos en formalina al 4%, realice análisis ex vivo utilizando micro CT e histo morpho con tinción de hematina y DSN en los huesos aislados. Los detalles se pueden encontrar en el protocolo escrito después de la inoculación intracardíaca o intratibial de las células tumorales.

Los ratones se controlan semanalmente mediante radiografía y fluorescencia o luminiscencia. Normalmente, las lesiones se hacen evidentes mediante radiografías entre la semana dos y tres. Si bien pueden ser visibles por fluorescencia y luminiscencia ya en la segunda semana, dependiendo del modelo como se muestra aquí, las lesiones son visibles como agujeros oscuros en el hueso y pueden volverse más pronunciadas con el tiempo. Las lesiones se cuantificaron mediante análisis de metamorfosis de radiografías y fluorescencia.

Se cuantificaron utilizando el software de adquisición y análisis de imágenes maestro. En esta figura, la pérdida ósea se cuantifica con análisis de micro TC. Los datos estructurales y minerales óseos de las mediciones de microtomografía computarizada se representan como imágenes en 3D de hueso sano y un hueso portador de tumor donde las áreas de destrucción ósea se muestran como un área vacía.

A continuación, se realizó una geometría de la morfología histogénica en las muestras para determinar la carga tumoral y el volumen óseo en relación con el volumen tisular. Al intentar estos procedimientos, es importante tener paciencia y colocar cuidadosamente cada ratón, monitorear a los ratones de cerca. Si comienzan a morir, es probable que se deba a la aglomeración de células y debe preparar nuevas células de inmediato.

Lo peor que puedes hacer es apresurar los trámites o frustrarte. Recuerda, con más práctica y tiempo, mejorarás y serás más rápido después de su desarrollo. Estas técnicas allanaron el camino para que los investigadores del cáncer estudiaran la metástasis ósea in vivo.