Los modelos de metástasis en los huesos

El objetivo general de este procedimiento es inyectar células tumorales de manera que induzca el crecimiento de células tumorales en el hueso y la consiguiente destrucción ósea. Esto se logra primero resuspendiendo las células tumorales en PBS frío y colocándolas sobre hielo. A continuación, se inyecta un número adecuado de células en el ventrículo cardíaco izquierdo o en la tibia de un ratón anestesiado.

Luego, el crecimiento del tumor óseo y los parámetros óseos se monitorean longitudinalmente mediante múltiples técnicas de imagen. Finalmente, se realiza la cuantificación en el punto final de los parámetros del tumor y del hueso. En última instancia, se combina fluorescencia o luminiscencia in vivo y ex vivo con radiografía 2D y 3D.

La micro-TC y la histología se utilizan para mostrar el crecimiento tumoral y los cambios en el microentorno óseo a nivel celular y estructural del crecimiento. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la metástasis del cáncer, como qué factores en el hueso permiten la colonización metastásica del cáncer de mama y de próstata. La preparación celular será demostrada por Alisa Merkel, una asistente de investigación en mi laboratorio. Mantenga las células durante menos de una semana.

Que albergan el clon M-D-A-M-B 2 3 1 marcado con GFP en DMEM que contiene 10 % FBS y 0,1 miligramo por mililitro de penicilina-estreptomicina, a 37 grados Celsius en una atmósfera de 5 a 8 % de dióxido de carbono. Pase las células al 80 a 90 % de confluencia y sustitúyalas por una dilución de 1 a 10. Para preparar las células para la inoculación, retire las células con tripsina al 80 a 90 % de confluencia usando tripsina-EDTA al 0,15 % con 10 mililitros.

Transferir inmediatamente las células a un tubo cónico de 50 mililitros con DMEM frío con hielo que contenga 10 % de suero bovino fetal y centrifugar durante cinco minutos. Re-suspender el precipitado en un tubo cónico de 50 mililitros con 25 mililitros de PBS frío con hielo sin calcio ni magnesio y contar las células; desechar el sobrenadante y re-suspender las células en PBS frío con hielo a una concentración de 10⁶ células por mililitro para inoculación intracardiaca y 250.000 células por mililitro para inyección intratibial.

Ratones hembra inmunodeprimidos de cuatro a seis semanas de edad que han sido alimentados con una dieta Tela 29 20 x durante cinco a 10 días antes de la inyección se utilizan para estos experimentos. Después de anestesiar al ratón en una cámara con 2,5 % de isoflurano, traslade al ratón bajo una campana ventilada hacia un cono nasal y colóquelo en posición supina. Use una solución de yodo-povidona al 10 % para lavar el tórax, seguido de etanol al 70 %.

Marque el pecho del ratón para la inyección en el punto medio entre la escotadura esternal y la parte superior del apéndice xifoides y ligeramente a la izquierda del esternón. A continuación, utilizando una jeringa de insulina de media pulgada, calibre 28, de 300 microlitros, aspire una pequeña burbuja de aire para crear espacio entre el émbolo y el menisco y aspire 100 microlitros de células mientras sostiene la piel del ratón tensa con una mano.

Mantenga la aguja en posición vertical e insértila; la inserción exitosa en el ventrículo cardíaco izquierdo debe producir un pulso de sangre de color rojo brillante y distintivo en la jeringa. A esta profundidad, presione cuidadosamente el émbolo de la jeringa sin mover significativamente la aguja, para evitar perforar el corazón o derramar células en la cavidad torácica. Para reducir el goteo de células hacia la cavidad torácica, tire ligeramente del émbolo hacia arriba para crear una pequeña cantidad de presión negativa.

Luego saque directamente la aguja del pecho asegurándose de evitar inclinarla durante la extracción, ya que esto puede desgarrar el revestimiento del corazón y provocar sangrado. Aplique presión suave sobre el sitio de inyección para reducir el sangrado durante aproximadamente un minuto. Al retirar el cono nasal, traslade al ratón a una almohadilla calefactora hasta que recupere completamente la conciencia.

Inmediatamente antes del procedimiento intra tibial, inyecte al ratón bup printex. Después de anestesiar al ratón y colocarlo en un cono nasal, limpie ambas patas con yodo povidona al 10 %, seguido de etanol, utilizando cuatro dedos y el pulgar.

Sujete suavemente el maléolo lateral, el maléolo medial y la mitad inferior de la tibia. Luego, doble la pierna para que la rodilla quede visible y accesible. Utilizando etanol al 70%, humedezca la piel para aumentar la visibilidad del ligamento rotuliano subyacente, que debe observarse como una línea blanca gruesa y bien definida mientras sujeta firmemente el tobillo.

Introduzca una aguja de calibre 28 y media pulgada debajo de la rótula, a través del centro del ligamento patelar y hacia el área intercondílea anterior en la parte superior de la tibia. Aplique presión firme y constante con un ligero movimiento de perforación para guiar cuidadosamente la aguja a través de la placa de crecimiento. Al atravesar la placa de crecimiento tibial, la aguja encontrará una resistencia notablemente menor.

Utilice un movimiento lateral suave de la aguja para asegurarse de que esté dentro de la tibia y atravesando la placa de crecimiento. El movimiento será limitado si la aguja se encuentra en la posición correcta dentro de la tibia. Presione lentamente el émbolo para inyectar 10 microlitros de la solución celular.

No se debe sentir poca o ninguna resistencia en este momento. Luego, extraiga lentamente la aguja. Retire al ratón de la anestesia y manténgalo sobre una almohadilla calefactora hasta que se recupere.

Monitoree al ratón dos o tres veces por semana. Se realizan diversas técnicas de imagen, como luciferasa, fluorescencia GFP y rayos X, en ratones anestesiados. La fluorescencia indica áreas de tumor.

Se utiliza una exploración con estron para localizar lesiones. Las lesiones se correlacionan con las imágenes de fluorescencia. Se pueden encontrar más detalles sobre las técnicas de imagen en la parte escrita de este protocolo.

De 21 a 35 días después de la inyección. Sacrificar los ratones utilizando un método aprobado por el IACUC y almacenar los huesos en formalina al 4 %. Realizar el análisis ex vivo mediante micro-TC e histomorfometría con tinción de hematina y DSN en los huesos aislados. Los detalles se pueden encontrar en el protocolo escrito tras la inoculación intracardiaca o intratibial de células tumorales.

Los ratones se monitorean semanalmente mediante radiografía y fluorescencia o luminiscencia. Las lesiones normalmente se vuelven evidentes por rayos X entre la segunda y la tercera semana. Aunque pueden ser visibles por fluorescencia y luminiscencia tan pronto como en la segunda semana, dependiendo del modelo como se muestra aquí, las lesiones son visibles como orificios oscuros en el hueso y pueden volverse más pronunciadas con el tiempo. Las lesiones se cuantificaron mediante análisis de metámorfosis de radiografías y fluorescencia.

Se cuantificaron utilizando el software de adquisición y análisis de imágenes maestro. En esta figura, la pérdida ósea se cuantifica mediante análisis de micro-TC. Los datos estructurales y minerales del hueso provenientes de las mediciones de micro-TC se representan como imágenes tridimensionales de hueso sano y hueso con tumor, donde las áreas de destrucción ósea se muestran como regiones vacías.

Posteriormente, se realizó la histo-morfo-geometría en las muestras para determinar la carga tumoral y el volumen óseo respecto al volumen de tejido. Al intentar estos procedimientos, es importante tener paciencia y colocar cuidadosamente cada ratón, vigilando de cerca a los animales. Si comienzan a morir, es probable que se deba a la agregación celular y se deben preparar nuevas células inmediatamente.

Lo peor que puede hacer es apresurar los procedimientos o frustrarse. Recuerde, con más práctica y tiempo, mejorará y será más rápido tras su desarrollo. Estas técnicas allanaron el camino para que los investigadores del cáncer estudiaran la metástasis ósea in vivo.