Sustrato Generación para endonucleasas de CRISPR / Cas Sistemas

El objetivo general de los siguientes experimentos es generar sustratos de ARN para el estudio de la endonucleasa Cas, que desempeñan funciones cruciales en los sistemas inmunitarios CRISPR-Cas presentes en bacterias y Archaea para obtener sustratos de ARN para la endonucleasa Cas. La amplificación por PCR de una región específica de CRISPR puede emplearse para obtener una plantilla de ADN larga destinada a la producción de ARN in vitro. Si se prefiere.

Pueden utilizarse dos oligonucleótidos para generar plantillas más cortas para la producción de ARN sustrato. Alternativamente, pueden ensayarse secuencias repetidas sintetizadas personalizadas y cortas en ensayos de endonucleasa CAS. En última instancia, la producción de transcritos de ARN y el posterior corte por la endonucleasa CAS seis pueden visualizarse mediante auto radiografía.

El objetivo principal de las técnicas del presentador es permitir a los investigadores estudiar el procesamiento del ARN CRISPR con sustratos de ARN de longitud variable. Por lo tanto, se utilizan diferentes métodos para generar ARN pequeños, por ejemplo, elementos repetidos individuales o ARN más grandes, como los transcritos de ARN crispr que abarcan varios espaciadores. Aunque estos métodos proporcionan información específica sobre la maduración del ARN CRISPR, estrategias similares de preparación de plantillas pueden adaptarse para otros sistemas de procesamiento de ARN. El procedimiento será demostrado por Muted Surface, estudiante de posgrado, y Repl, posdoctorado, ambos del laboratorio especializado en sistemas inmunitarios CRISPR bacterianos y de Archaea.

Una secuencia de ADN viral denominada protoespaciador puede insertarse entre dos elementos repetidos en un grupo CRISPR en crecimiento mediante un proceso llamado adaptación. A continuación, todo el grupo CRISPR se transcribe y luego se procesa en pequeños ARN CRISPR por una endonucleasa Cas, por ejemplo, Cas6. Los pequeños ARN CRISPR se incorporan entonces al complejo proteico Cas y median en la defensa del huésped contra un ataque viral repetido, utilizando la complementariedad de bases entre el ARN CRISPR y el protoespaciador como señal para la degradación del ADN viral y generar sustratos de pre-ARN CRISPR largos.

Comience por diseñar cebadores de PCR, dirigiéndose a las regiones espaciadoras de un grupo CRISPR mediante la adición de la secuencia promotora de la ARN polimerasa T siete al cebador directo. Luego, agregue sitios de restricción a ambos cebadores para clonar el producto de PCR en un vector. Tenga en cuenta que la ARN polimerasa T siete requiere un residuo de guanina I para la iniciación adecuada de la transcripción tras amplificar la secuencia de ARN pre-CRISPR de interés a partir del ADN genómico mediante PCR.

Separar los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa y extraer de la gelatina la banda deseada, luego digerir el producto de PCR con enzimas de restricción para crear extremos cohesivos. A continuación, tras purificar el producto de PCR utilizando un kit de purificación de PCR, para eliminar cualquier subproducto de la escisión, añadir tampón de ADN ligasa T4, ADN ligasa T4 y una relación molar de tres a uno del producto de PCR escindido respecto al vector puck relacionado con DFOs4 con extremos cohesivos correspondientes. Incubar ahora la reacción de ligación a 16 grados Celsius durante la noche, y luego transformar la mezcla en células competentes de E. coli, cepa DH5α, mediante protocolos estándar utilizando selección azul-blanca para identificar la ligación exitosa.

Finalmente, aísle los plásmidos de las colonias blancas utilizando un kit de preparación de plásmidos e identifique los clones positivos mediante secuenciación del plásmido para generar sustratos de ARN pre-CRISPR de tamaño intermedio. Comience diseñando oligonucleótidos directo e inverso con la secuencia deseada de espaciadores de repeticiones CRISPR, similar a las secuencias mostradas aquí. Tenga en cuenta que los oligonucleótidos contienen la secuencia de un promotor de la ARN polimerasa T7, así como sitios de restricción terminales tras finalizar los oligonucleótidos, para asegurar la formación de extremos cohesivos.

Después de colocar en posición de rodillas, incubar las muestras con la polinucleótido cinasa T4 y el tampón de polinucleótido cinasa T4 durante una hora a 37 grados Celsius para fosforilar en el extremo cinco prima un análogo de cada uno de los oligonucleótidos. A continuación, incubar los oligonucleótidos fosforilados directo e inverso con el tampón de ligasa T4 de ADN durante cinco minutos a 95 grados Celsius en un bloque térmico. Una vez que las muestras se hayan hibridado, apagar la fuente de calor y dejar que la mezcla se enfríe durante aproximadamente dos a tres horas hasta que alcance la temperatura ambiente.

Ahora, ligue los oligonucleótidos sintetizados con una mezcla de hibridación, el vector P digerido y desfosforilado T cuatro tampón de ADN ligasa y una TP a 16 grados Celsius durante la noche. Luego, transforme los plásmidos ligados en células competentes de e coli, cepa DH cinco alfa, mediante protocolos estándar utilizando selección azul-blanca para identificar la ligación exitosa. Finalmente, aísle los plásmidos e identifique los clones positivos mediante digestión y secuenciación subsecuente del plásmido.

Se pueden diseñar secuencias de sustrato de ARN con repeticiones simples cortas similares a las mostradas aquí. Asegúrese de incluir un ribonucleótido desoxi. Si se desea determinar el sitio de escisión del ARN, entonces se puede utilizar una instalación de síntesis personalizada para llevar a cabo la producción del oligonucleótido de ARN.

Después de aislar los plásmidos con el sustrato personalizado de elección, utilice un kit de purificación de plásmidos tipo maxi prep para linearizar los plásmidos con la enzima de restricción que corta aguas abajo de los fragmentos clonados. Luego, tras asegurar una digestión completa, purifique el plásmido linearizado mediante extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol. Recupere los ácidos nucleicos por resuspensión, suspendiendo el precipitado en agua estéril tratada con DEPC.

Ahora incube los plásmidos digestivos en una mezcla recién preparada de transcripción por desplazamiento con ARN polimerasa T siete in vitro que contenga ATP, CTP, GTP y UTP durante tres horas a 37 grados Celsius. Finalmente, analice los transcritos de ARN obtenidos en un gel desnaturalizante de poliacrilamida al 12% con ocho moles de urea. También es posible purificar los transcritos mediante cromatografía de intercambio aniónico en columna Mono Q, y luego recuperarlos mediante precipitación alcohólica de las fracciones de ARN y resuspensión de los pellets en agua estéril tratada con DEPC para analizar los sustratos de diseño mediante ensayos de endonucleasa. Comience visualizando las bandas del sustrato mediante auto radiografía y purificando los productos de la reacción mediante extracción en gel a partir de una urea desnaturalizante de ocho moles.

Geles de poliacrilamida al 12 %, luego produzca y purifique las proteínas Cas recombinantes deseadas mediante precipitación por calor y cromatografía con níquel NTA, como se muestra para esta proteína Cas6 de Clostridium thermocellum. A continuación, combine la proteína Cas con una mezcla de reacción de endonucleasa recién preparada durante 30 minutos a 37 grados Celsius para permitir que ocurra la reacción del ensayo de endonucleasa. Finalmente, cargue cinco microlitros de la mezcla de reacción en una urea al 8 M.

Geles de poliacrilamida al 12 % y visualización de los productos de escisión tras electroforesis mediante autorradiografía. Aquí se muestra un gel de poliacrilamida teñido con azul de hinina de un oligonucleótido de ARN diseñado a medida y dos transcritos de ARN in vitro. Obsérvese que la eficiencia de la producción de ARN varía entre los constructos de longitud corta, larga e intermedia.

La investigación de la actividad de la endonucleasa de ARN requiere controles positivos y negativos, así como proteínas Cas recombinantes altamente purificadas. En esta figura, un gel de electroforesis SDS-PAGE de una preparación de muestra de Cas6 de Clostridium thermocellum.

Después de la precipitación por calor y la cromatografía de níquel-NTA realizada junto con un marcador estándar de proteínas, se muestra el resultado. Una muestra de control negativo adecuada debe contener un lisado celular sin expresión de CAS seis, pero siguiendo el procedimiento idéntico de purificación de CAS seis, se determinó que la preparación de CAS seis posee el grado requerido de pureza. Aquí, la escisión de un sustrato de secuencia repetida marcado en el extremo cinco primo por la proteína CAS seis de Clostridium thermocellum puede visualizarse mediante auto radiografía.

Cada carril contiene sustrato marcado radiactivamente, ARN tras la incubación con la proteína ca seis, según indican los signos positivos, o con un tampón como control negativo, según indican los signos negativos, sustratos largos o sustratos cortos con o sin la adición del desoxirribonucleótido. En la posición menos nueve, se utilizaron para facilitar la reacción de endonucleasa. Observe la ausencia de escisión de los sustratos cortos cuando se incluyó el desoxirribonucleótido en la molécula de ARN tras seguir este procedimiento.

Las nucleasas CAS seis también pueden utilizarse como una herramienta para generar ARN crisp maduros. Estos ARN pueden incorporarse en complejos en cascada para obtener información sobre su participación en la interferencia de ataques virales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar y producir sustratos CRISPR para Cas y nucleasas.

Estos diferentes sustratos son útiles para abordar preguntas relacionadas con la maduración y el uso de CRISPR Es.