Carriage Experimental neumocócica Humanos
15 de febrero de 2013
Transporte Experimental neumocócica humanos ofrece un modelo natural de carro y un modelo potencial para su uso en el desarrollo de vacunas. Esta técnica es valiosa aún complejo y conlleva un riesgo clínico mediante la introducción de un agente patógeno en un ser humano. Hemos desarrollado un protocolo detallado.
El objetivo de este procedimiento es establecer un porte experimental de neumococo humano. Esto se logra diluyendo y cuantificando primero las bacterias en el inóculo. En el segundo paso, el voluntario es inoculado por vía intranasal con Streptococcus pneumoniae.
A continuación, el voluntario se lava la nariz los días dos, siete y 14 después de la inoculación. Por último, se utiliza la microbiología clásica para determinar si el voluntario es portador del ocus inoculado. En última instancia, se puede obtener un transporte neumocócica humano experimental utilizando este método seguro y reproducible.
La principal ventaja de esta técnica sobre los modelos de portadores murinos existentes es que esta técnica ofrece un modelo de transporte en el huésped natural del neumococo, el ser humano. Además, este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del neumococo, como ¿cuáles son los correlatos inmunológicos de la protección? ¿Cuál es el efecto inmunizante de la portación y cuál es el efecto de la presión del huésped sobre el patógeno en el nicho nasofaríngeo?
Las aplicaciones de esta técnica incluyen su uso como método para seleccionar nuevas vacunas antineumocócicas. Planeamos utilizar la prevención de la portación como un sustituto de la inmunidad inducida por la vacuna. La Hermana Angie Wright y el enfermero a cargo David Shaw demostrarán la técnica clínica.
30 minutos antes de la cita programada para la inoculación voluntaria a través de un tubo de inóculo tomado del congelador a menos 80 grados centígrados. A continuación, centrifugar el inóculo en una microcentrífuga durante tres minutos a 17.000 veces. G, mientras el tubo gira, caliente algunas placas de agar sangre en una incubadora a 37 grados centígrados.
A continuación, retire el caldo del inóculo de la centrífuga y lave el pellet en un mililitro de solución salina. Repita el paso de centrifugación y lavado. Realice un conjunto de dilución para la concentración de inóculo deseada y luego cuantifique la cantidad de bacterias en el inóculo mediante un método similar a miles y misra.
Las colonias crecidas se harán visibles al día siguiente. Lleve el inóculo al voluntario, quien debe estar sentado cómodamente en una posición semi reclinada. A continuación, utilizando un perpe P 200 y puntas de filtro estériles.
Extraiga 100 microlitros del inóculo en la punta del perpe e inserte la punta justo dentro de la cavidad nasal. Expulse lentamente el inóculo sobre la mucosa nasal con movimientos circulares. No coloque la punta de la pipeta demasiado atrás, o el inóculo se deslizará por la garganta.
Repita la inoculación de las otras naris para evitar que las bacterias ingresen al torrente sanguíneo. Tenga cuidado de no alterar la mucosa con la pipeta. A continuación, haga que el voluntario permanezca en posición semirreclinada durante 10 minutos para permitir que las bacterias se dispersen por la mucosa.
Después de administrar el inóculo a los voluntarios, repita la cuantificación bacteriana en el laboratorio. A continuación, etiquete el tubo con la fecha y la dosis de inóculo, y almacene el inóculo a menos 80 grados centígrados. Antes de comenzar el lavado nasal, haga que el voluntario se siente cómodamente con la cabeza inclinada hacia atrás 30 grados con respecto a la vertical.
Luego, pídale al voluntario que respire profundamente mientras empuja la lengua hacia arriba y hacia atrás contra el paladar. Pida al voluntario que haga una señal cuando se alcance esta posición. Ahora lave la cavidad nasal cuatro veces con 20 mililitros de solución salina, descargando cinco mililitros de solución salina a la vez en el espacio nasal anterior.
Haga que el voluntario se incline inmediatamente hacia adelante y exhale rápidamente por la nariz en un recipiente de papel de aluminio para expulsar el líquido después de cada lavado de solución salina de cinco mililitros. Después de lavar la cavidad nasal con los cuatro 20 mililitros, junte todas las muestras recolectadas en un tubo de centrífuga. Ahora centrifugar las muestras de lavado nasal voluntario durante 10 minutos a 3, 345 veces G. Retire el supinato y guárdelo como alícuotas de un mililitro en tubos de einor marcados a menos 80 grados Celsius.
Agregue 100 microlitros de medio STGG al pellet y mezcle bien, y luego determine el volumen total en el tubo. A continuación, una gota de 20 microlitros del pellet resuspendido sobre una placa de agar sangre que contiene gentamicina y raya toda la placa. Si el lavado nasal es posterior a la inoculación, use 10 microlitros del STGG que contiene el pellet resuspendido.
Para la cuantificación bacteriana por el método de Miles y Misra, agregue otros 800 microlitros de STGG al tubo de lavado nasal y mezcle bien. A continuación, coloque 25 microlitros de la solución de células bacterianas STGG en otra placa de agar sangre y 25 microlitros en una placa de agar chocolate, rayando la totalidad de ambas placas. A continuación, congele las bacterias restantes en dos viales criogénicos a menos 80 grados centígrados.
Incubar las placas a 37 grados centígrados durante la noche en 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, examine las placas en busca de neumococo y otros posibles patógenos respiratorios. Las placas de agar sangre, inoculadas con lavados nasales, pueden ser difíciles de leer.
Esta imagen muestra un ejemplo de una placa que es fácil de leer con los neumococos claramente visibles. Esta placa, sin embargo, contiene mucha flora cocolonizadora, lo que dificulta determinar si los neumococos están presentes en todas las citas. Se pidió a los voluntarios que describieran cualquier síntoma del tracto respiratorio superior, si estaba presente, y se destacó la comparación entre portadores y no portadores.
De las 145 personas recientemente inoculadas con neumococo, 28 se quejaron de síntomas, como se resume en esta tabla. Ocho de estos voluntarios eran portadores, 20 no lo eran. Todas las quejas fueron revisadas por el Comité de Seguridad externo y después de investigaciones completas.
No se atribuyeron síntomas a la enfermedad neumocócica. Los síntomas más comunes fueron dolor de garganta, congestión nasal y enfermedad similar a la gripe. Al intentar este procedimiento, es importante tener un plan de seguridad muy completo, que cubra cada paso del método, especialmente para la seguridad de los voluntarios.
Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo establecer un porte neumocócica humano experimental y detectar el porte usando un lavado nasal.
Resumen
Este artículo presenta un protocolo detallado para establecer la colonización experimental por neumococo humano, un modelo útil para el desarrollo de vacunas. El método consiste en la inoculación intranasal de Streptococcus pneumoniae y el posterior monitoreo mediante lavados nasales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Microbiología
- Inmunología
- Desarrollo de vacunas
Antecedentes
- La colonización experimental por neumococo en humanos sirve como un modelo natural para estudiar las infecciones neumocócicas.
- Esta técnica conlleva riesgos clínicos al introducir un patógeno en seres humanos.
- Ofrece ventajas frente a los modelos en ratones al permitir el estudio del patógeno en su huésped natural.
- Se pueden abordar preguntas clave en la investigación neumocócica utilizando este modelo.
Objetivo del estudio
- Establecer un método seguro y reproducible para inducir la portación neumocócica en humanos.
- Investigar los correlatos inmunológicos de protección y los efectos de la portación sobre el huésped.
- Facilitar la selección descendente de vacunas neumocócicas novedosas.
Métodos Utilizados
- Preparación del inóculo bacteriano mediante dilución y cuantificación.
- Inoculación intranasal de voluntarios con Streptococcus pneumoniae.
- Lavados nasales realizados a intervalos especificados para monitorear la colonización.
- Análisis microbiológico para confirmar la presencia de las bacterias inoculadas.
Resultados principales
- Establecimiento exitoso de la portación neumocócica en voluntarios.
- El monitoreo reveló síntomas respiratorios superiores comunes entre algunos voluntarios.
- No se atribuyó ningún síntoma a la enfermedad neumocócica tras una investigación exhaustiva.
- Se enfatizaron los protocolos de seguridad durante todo el procedimiento.
Conclusiones
- El método proporciona un modelo confiable para estudiar la portación neumocócica en humanos.
- Puede ayudar a responder preguntas fundamentales sobre la inmunidad neumocócica.
- Las aplicaciones futuras incluyen la evaluación de vacunas novedosas basadas en la prevención de la portación.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El establecimiento de la colonización neumocócica humana experimental proporciona un modelo de hospedador natural para evaluar candidatos vacunales mediante la medición de la prevención de la colonización como un indicador sustituto de inmunidad protectora. Este enfoque permite reducir tempranamente los riesgos asociados a nuevas vacunas antineumocócicas al vincular las respuestas inmunológicas con el bloqueo de la colonización en humanos, orientando decisiones de avance o interrupción antes de ensayos de eficacia costosos. El modelo permite obtener información mecanicista sobre las interacciones entre el hospedador y el patógeno en el nicho nasofaríngeo, mejorando la confianza predictiva en los resultados traslacionales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis terapéuticas al evaluar si la inmunidad inducida por la vacuna previene la colonización neumocócica en humanos.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de dianas antigénicas mediante la medición directa de la reducción de la portación tras la inmunización.
- Valor predictivo: Facilita la selección de candidatos en el portafolio al identificar aquellos que demuestran actividad biológica en el nicho humano correspondiente.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara muestras estandarizadas y reproducibles de origen humano para ensayos inmunológicos y microbiológicos posteriores.
- Valor operativo: Establece la detección cuantitativa de portación mediante lavado nasal y métodos basados en cultivo, lo que permite lecturas consistentes entre estudios.
- Preparación de la plataforma: Facilita la estandarización y escalabilidad de ensayos para evaluar múltiples candidatos vacunales bajo condiciones controladas.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad traslacional: Conecta hallazgos preclínicos con relevancia humana mediante la evaluación de los efectos de la vacuna en el huésped natural de S. pneumoniae.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Clarifica los correlatos inmunológicos de protección y el impacto de la presión del huésped sobre la dinámica del patógeno en la nasofaringe.
- Avance ajustado al riesgo: Informa las decisiones sobre la progresión de la vacuna basándose en la eficacia para prevenir la colonización y en la vigilancia de seguridad.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El modelo EHPC se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos activos y el apoyo preclínico, ofreciendo un punto de control relevante para humanos antes de los ensayos de campo a gran escala.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la inmunidad inducida por vacunas y su efecto en la colonización neumocócica en la nasofaringe humana.
- Depuración: Proporciona muestras biológicas listas para ensayos, con protocolos estandarizados de inoculación y lavado para una detección reproducible de la portación.
- Análisis: Permite obtener resultados microbiológicos cuantitativos (UFC/mL) a partir de lavados nasales para comparar grupos vacunados y controles.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos inmunológicos con modelos preclínicos al validar los mecanismos de inhibición de la portación en humanos.
- Reutilización Empresarial: Sirve como una plataforma reutilizable para la evaluación iterativa de candidatos vacunales en diferentes serotipos y formulaciones.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva en la eficacia de la vacuna al demostrar la prevención del estado de portador en el huésped humano natural.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante la preparación estandarizada del inóculo, el monitoreo de voluntarios y el muestreo con lavado nasal.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al reducir la incertidumbre biológica en la evaluación temprana de vacunas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos basada en datos humanos de prevención del estado de portador.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la gestión de voluntarios clínicos, técnicas microbiológicas y protocolos de bioseguridad.
- Depende de una infraestructura de laboratorio controlada para la cuantificación bacteriana, cultivo anaeróbico y almacenamiento de muestras a −80°C.
- Necesita estandarización entre equipos clínicos, microbiológicos e inmunológicos para un manejo de muestras consistente.
- Requiere consideraciones de adaptación al evaluar diferentes serotipos de neumococo o respuestas inmunitarias inducidas por vacunas.
- Incluye limitaciones prácticas como la complejidad del reclutamiento de voluntarios, la carga asociada al monitoreo de síntomas y los umbrales de sensibilidad en la detección de portación.
