Carriage Experimental neumocócica Humanos

El objetivo de este procedimiento es establecer un porte experimental de neumococo humano. Esto se logra diluyendo y cuantificando primero las bacterias en el inóculo. En el segundo paso, el voluntario es inoculado por vía intranasal con Streptococcus pneumoniae.

A continuación, el voluntario se lava la nariz los días dos, siete y 14 después de la inoculación. Por último, se utiliza la microbiología clásica para determinar si el voluntario es portador del ocus inoculado. En última instancia, se puede obtener un transporte neumocócica humano experimental utilizando este método seguro y reproducible.

La principal ventaja de esta técnica sobre los modelos de portadores murinos existentes es que esta técnica ofrece un modelo de transporte en el huésped natural del neumococo, el ser humano. Además, este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del neumococo, como ¿cuáles son los correlatos inmunológicos de la protección? ¿Cuál es el efecto inmunizante de la portación y cuál es el efecto de la presión del huésped sobre el patógeno en el nicho nasofaríngeo?

Las aplicaciones de esta técnica incluyen su uso como método para seleccionar nuevas vacunas antineumocócicas. Planeamos utilizar la prevención de la portación como un sustituto de la inmunidad inducida por la vacuna. La Hermana Angie Wright y el enfermero a cargo David Shaw demostrarán la técnica clínica.

30 minutos antes de la cita programada para la inoculación voluntaria a través de un tubo de inóculo tomado del congelador a menos 80 grados centígrados. A continuación, centrifugar el inóculo en una microcentrífuga durante tres minutos a 17.000 veces. G, mientras el tubo gira, caliente algunas placas de agar sangre en una incubadora a 37 grados centígrados.

A continuación, retire el caldo del inóculo de la centrífuga y lave el pellet en un mililitro de solución salina. Repita el paso de centrifugación y lavado. Realice un conjunto de dilución para la concentración de inóculo deseada y luego cuantifique la cantidad de bacterias en el inóculo mediante un método similar a miles y misra.

Las colonias crecidas se harán visibles al día siguiente. Lleve el inóculo al voluntario, quien debe estar sentado cómodamente en una posición semi reclinada. A continuación, utilizando un perpe P 200 y puntas de filtro estériles.

Extraiga 100 microlitros del inóculo en la punta del perpe e inserte la punta justo dentro de la cavidad nasal. Expulse lentamente el inóculo sobre la mucosa nasal con movimientos circulares. No coloque la punta de la pipeta demasiado atrás, o el inóculo se deslizará por la garganta.

Repita la inoculación de las otras naris para evitar que las bacterias ingresen al torrente sanguíneo. Tenga cuidado de no alterar la mucosa con la pipeta. A continuación, haga que el voluntario permanezca en posición semirreclinada durante 10 minutos para permitir que las bacterias se dispersen por la mucosa.

Después de administrar el inóculo a los voluntarios, repita la cuantificación bacteriana en el laboratorio. A continuación, etiquete el tubo con la fecha y la dosis de inóculo, y almacene el inóculo a menos 80 grados centígrados. Antes de comenzar el lavado nasal, haga que el voluntario se siente cómodamente con la cabeza inclinada hacia atrás 30 grados con respecto a la vertical.

Luego, pídale al voluntario que respire profundamente mientras empuja la lengua hacia arriba y hacia atrás contra el paladar. Pida al voluntario que haga una señal cuando se alcance esta posición. Ahora lave la cavidad nasal cuatro veces con 20 mililitros de solución salina, descargando cinco mililitros de solución salina a la vez en el espacio nasal anterior.

Haga que el voluntario se incline inmediatamente hacia adelante y exhale rápidamente por la nariz en un recipiente de papel de aluminio para expulsar el líquido después de cada lavado de solución salina de cinco mililitros. Después de lavar la cavidad nasal con los cuatro 20 mililitros, junte todas las muestras recolectadas en un tubo de centrífuga. Ahora centrifugar las muestras de lavado nasal voluntario durante 10 minutos a 3, 345 veces G. Retire el supinato y guárdelo como alícuotas de un mililitro en tubos de einor marcados a menos 80 grados Celsius.

Agregue 100 microlitros de medio STGG al pellet y mezcle bien, y luego determine el volumen total en el tubo. A continuación, una gota de 20 microlitros del pellet resuspendido sobre una placa de agar sangre que contiene gentamicina y raya toda la placa. Si el lavado nasal es posterior a la inoculación, use 10 microlitros del STGG que contiene el pellet resuspendido.

Para la cuantificación bacteriana por el método de Miles y Misra, agregue otros 800 microlitros de STGG al tubo de lavado nasal y mezcle bien. A continuación, coloque 25 microlitros de la solución de células bacterianas STGG en otra placa de agar sangre y 25 microlitros en una placa de agar chocolate, rayando la totalidad de ambas placas. A continuación, congele las bacterias restantes en dos viales criogénicos a menos 80 grados centígrados.

Incubar las placas a 37 grados centígrados durante la noche en 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, examine las placas en busca de neumococo y otros posibles patógenos respiratorios. Las placas de agar sangre, inoculadas con lavados nasales, pueden ser difíciles de leer.

Esta imagen muestra un ejemplo de una placa que es fácil de leer con los neumococos claramente visibles. Esta placa, sin embargo, contiene mucha flora cocolonizadora, lo que dificulta determinar si los neumococos están presentes en todas las citas. Se pidió a los voluntarios que describieran cualquier síntoma del tracto respiratorio superior, si estaba presente, y se destacó la comparación entre portadores y no portadores.

De las 145 personas recientemente inoculadas con neumococo, 28 se quejaron de síntomas, como se resume en esta tabla. Ocho de estos voluntarios eran portadores, 20 no lo eran. Todas las quejas fueron revisadas por el Comité de Seguridad externo y después de investigaciones completas.

No se atribuyeron síntomas a la enfermedad neumocócica. Los síntomas más comunes fueron dolor de garganta, congestión nasal y enfermedad similar a la gripe. Al intentar este procedimiento, es importante tener un plan de seguridad muy completo, que cubra cada paso del método, especialmente para la seguridad de los voluntarios.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo establecer un porte neumocócica humano experimental y detectar el porte usando un lavado nasal.