Name: Un modelo ortotópico de cáncer de vejiga de Estudios de liberación de genes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-01T22:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Aprenda a implantar células MB49 en vejigas de ratón mediante cateterismo para crear un modelo ortotópico de cáncer de vejiga. Este método permite evaluar terapias génicas con adenovirus y ensayos de luciferasa.

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Este trabajo fue apoyado por el NIH R21 CA143505 a Christina Voelkel-Johnson.

Todos los procedimientos con animales han sido revisados ​​y aprobados por el Comité de Cuidado de Animales institucional y Uso de la Universidad Médica de Carolina del Sur. El protocolo fue aprobado por USDA categoría D para el dolor. 1. El implante de células <ol><li> Dos días antes de realizar el procedimiento, la placa 1 x 10 6 MB49 células en matraces T-25. El uso de alta glucosa DMEM suplementado con 10% de FBS (antibióticos y, si se desea). Un matraz es suficiente para cada grupo de hasta cinco ratones que se anestesió y se implanta en paralelo. </li><li> En el día del procedimiento, preparar tripsina para la instilación por dilución de 0,25% de tripsina de grado de cultivo de tejido estéril a 0,125% con medio de base DMEM estéril (dilución 1:2). 1,2 ml es suficiente para 10 ratones. Colocar en un baño de agua a 37 ° C que se equilibre. </li><li> Precalentar una almohadilla caliente y colocarlo bajo las nosecones del sistema de anestesia que se utilizará para entregar isoflurane. Coloque una almohadilla absorbente limpio sobre el cojín eléctrico. </li><li> Coloque los ratones en la cámara de inducción de anestesia y el sistema de inducir la anestesia con 3% de isoflurano. Cuando los ratones han perdido el conocimiento, que es verificada por la pérdida del reflejo de los pies-pinch, transferirlos a los nosecones. Asegúrese de que cada animal está en una posición de decúbito supino y correctamente colocado en la plataforma de calentamiento para mantener la temperatura corporal. </li><li> Reducir la concentración de isoflurano al 2% para mantener la anestesia. </li><li> Aplique una pomada oftálmica de ambos ojos para evitar que se sequen. </li><li> Paso opcional: Eliminar el vello abdominal. El pelo en la parte inferior del abdomen se debe retirar si se llevará a cabo en vivo bioluminiscente de imágenes. <ol><li> Aplicar una capa generosa de crema depilatoria, como Veet, la más baja 1 en la plaza de la piel en el abdomen, con cuidado de no ponerse en contacto con los genitales externos. Espere 3 min. </li><li> Retire el cabello frotando el área con una esponja seca, y luego usar una esponja húmeda para limpiar la piel. Repetir una vez, si es necesario. </li></ol></li><li> Cateterizar la vejiga <ol><li> Engrasar un catéter nuevo, estéril 24 G pediátrica venosa con un gel lubricante no irritante como KY. Retire y deseche la aguja. Si la fuga de líquido alrededor del catéter es un problema común, es decir. ocurre con más frecuencia que en uno de los diez ratones, catéteres de calibre más grandes (20 g) se pueden utilizar. Esto puede ser una consideración importante en ratones de más edad de 8 semanas. </li><li> Sosteniendo el cubo del catéter, use el pulgar y el dedo índice de la otra mano para extender las patas traseras del ratón y exponer el meato uretral. Introduzca suavemente el catéter en la uretra en un ángulo de 45 °, cambiando el ángulo de uno paralelo con el banco para insertar en su totalidad. </li><li> Después de la inserción completa, levantar el catéter suavemente, manteniéndola paralela al banco, y confirmar visualmente que se coloca en la uretra y no la vagina, que está debajo de ella. Si se coloca correctamente, el catéter será capaz de estar eninsertado totalmente desde la vagina es más corta que la uretra. </li><li> Reducir la concentración de isoflurano al 1%. </li></ol></li><li> Fije una punta a una pipeta P200 y eliminar la orina desde la vejiga mediante la aplicación de succión al extremo externo del catéter. Elimine cualquier resto de la orina desde el cubo del catéter. Deseche la orina y dejar el catéter en su lugar. </li><li> Cuidadoso pipeteado 80 l de solución de tripsina al 0,125% en el cubo del catéter, evitando burbujas de aire. Acople una jeringa llena de aire 1 ml a la conexión del catéter y presione lentamente el émbolo 0,1-0,2 ml para entregar la tripsina en la vejiga. </li><li> Deje la jeringa y el conjunto de catéter en el lugar durante 15 minutos. Repetir los pasos 1.8 a 1.11 para cualquiera de los ratones anestesiados restantes (hasta 4). Continúe con el siguiente paso, durante el período de espera. SUGERENCIA: Al principio puede ser útil tener a alguien más prepare las células (paso 1,12). </li><li> Preparar las células MB49 para la implantación. Las células se sembraron a 1 x 10 6 por T-25 matraz de 48 horas antes de la implantación (paso 1.1). <ol><li> Retire el medio y añadir 500 l de 0,25% de tripsina al matraz. Cuando las células se desprenden añadir 5 ml de DMEM completo de volver a suspender las células. Quitar una alícuota de 50 l para contar, y centrifugar el resto a 1.000 rpm durante 5 min. Durante la etapa de centrifugación seguir pasos 1.12.2 y 1.12.3. </li><li> Contar las células utilizando un hemocitómetro. Cálculo de las células / ml. Luego calcula el volumen necesario para que el sedimento celular a 4 x 10 6 células / ml (2 x 10 5 células por 50 l). </li><li> Retirar el sobrenadante de células centrifugadas y resuspender el precipitado en medio base DMEM con el volumen necesario para suspender las células a 4 x 10 6 células / ml (según lo calculado en el paso 1.12.2). Mantener las células a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Cuando se alcanza el punto de tiempo de 15 min de tratamiento con tripsina de vejigas, desconectar la jeringa llena de aire del catéter dejando el catéter en su lugar. Tripsina gastado será normal,mente fluya hacia atrás a través del catéter. Eliminar cualquier tripsina restante de la vejiga por succión con la pipeta P200 como en el paso 1.9 arriba y descartar. </li><li> Inmediatamente pipetear 50 l de suspensión de células MB49 en el cubo del catéter. Acople la jeringa llena de aire 1 ml al cubo del catéter y entregar las células a la vejiga apretando lentamente el émbolo 0,1-0,2 ml. Repita este paso hasta cuatro veces más para implantar los cinco ratones. Deseche cualquier célula no utilizados. </li><li> Dejando el conjunto de catéter-jeringa en su lugar, permita que las células de habitar en la vejiga durante 50 min. </li><li> Retirar con cuidado el conjunto de catéter-jeringa de la uretra. Gire a la concentración de isoflurano a cero y mover cada ratón una o dos pulgadas de distancia de la ojiva de recuperar sobre el cojín eléctrico. </li><li> Cuando un ratón ha recuperado su reflejo de enderezamiento, devolverlo a su jaula. </li></ol> 2. Entrega intravesical de Adenovirus (8 días después de la implantación de células) </p&gt; PRECAUCIÓN: Esta parte del protocolo utiliza adenovirus, que es un agente infeccioso y debe ser manejado bajo las directrices estrictas BSL2 (http://oma.od.nih.gov/manualchapters/intramural/3035/). Todos los procedimientos realizados con agentes infecciosos fueron aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad de la Universidad Médica de Carolina del Sur. <ol><li> Ocho días después de la implantación de los ratones con células MB49, compruebe si hay hematuria. Recoge animales individuales sobre un pedazo de papel blanco absorbente y presionar suavemente sobre el abdomen para borrar gotas de orina sobre el papel. La orina es de color rosa a rojo indica hematuria y es una señal de que los tumores se han establecido. Tumor tasa de absorción es al menos 80% y con una excelente técnica puede ser tan alta como 100%. </li><li> Descongelar stock adenoviral que en hielo y se diluye hasta 10 9 PFU/50 l (2 x 10 10 UFP / ml) en PBS estéril temperatura ambiente. </li><li> Anestesie los ratones como se describe en los pasos 1.3 a 1.6 anteriormente. </li><li> Cateterizar los ratones como se describe en los pasos 1,8 y eliminar la orina como en el paso 1.9 </li><li> Después se elimina la orina, pipetear inmediatamente 50 l de suspensión de virus en el cubo del catéter. Acople la jeringa llena de aire 1 ml al cubo del catéter y entregar el virus de la vejiga apretando lentamente el émbolo 0,1-0,2 ml. </li><li> Dejando el conjunto de catéter-jeringa en su lugar, permita que el virus, para que habiten en la vejiga durante 40 min. </li><li> Retirar con cuidado el conjunto de catéter-jeringa de la uretra, y deseche en una solución de lejía al 10% para inactivar cualquier virus restante. </li><li> Gire a la concentración de isoflurano a cero y mover cada ratón una o dos pulgadas de distancia de la ojiva de recuperar sobre el cojín eléctrico. </li><li> Cuando un ratón ha recuperado su reflejo de enderezamiento, devolverlo a su jaula. </li><li> Marcar jaulas para indicar que los ratones que han sido inculcados con adenovirus. Virus será derramada en la ropa de cama de la jaula durante varios días y todas las jaulas y ropa de cama debe sermanejado y desinfectado apropiadamente. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

La principal metodología descrita en este protocolo es la cateterización de la vejiga del ratón, que tiene amplias aplicaciones para la instilación de células o de cualquier agente destinado a la administración local en el epitelio de la vejiga. El protocolo específico descrito anteriormente ha sido optimizado para los estudios a corto plazo (~ 10 días). Implantar el número exacto de las células es fundamental, ya que un número mayor de células dará lugar a un crecimiento rápido del tumor más y, posiblemente, la pérdida...

El cáncer de vejiga es el segundo cáncer más común del tracto urogenital, con cerca de 75.000 nuevos casos y 15.000 muertes esperadas en el 2012 1. Las altas tasas de recurrencia requieren seguimiento de por vida, lo que hace que el cáncer de vejiga uno de los cánceres más costosas de tratar. El cáncer de vejiga que ha invadido la capa muscular puede producir metástasis en el hígado, pulmón o hueso a través del sistema linfático. La terapia multimodal de tumores avanzados resultados en sólo 20-40% de supervivencia a los 5 años. Por lo tanto, las estrategias de tratamiento eficaces destinadas a reducir la recurrencia y progresión del cáncer superficial de vejiga, así como mejorar los resultados terapéuticos en los pacientes con enfermedad avanzada se necesitan con urgencia. Desarrollo de nuevas terapias requiere modelos preclínicos para evaluar la eficacia después de la evaluación inicial in vitro. El microambiente tumoral puede influir significativamente en el desarrollo del cáncer y la capacidad de respuesta, lo que pone de relieve la necesidad de preclínicamodelos de AL en el que surgen los tumores o se pueden establecer en el órgano de origen. Un enfoque es el desarrollo de modelos transgénicos en los que surgen los tumores de forma espontánea o puede ser inducida en una manera específica de órgano. Una excelente protocolo de un modelo de cáncer de vejiga transgénico ha sido recientemente publicado 2. El inconveniente de los modelos transgénicos es que los tumores tienden a desarrollarse lentamente y con menos uniformidad de lo deseado. Además, el costo de mantenimiento de una colonia de cría tiene que ser considerado. Una alternativa a modelos transgénicos es la implantación ortotópica de las células tumorales, que tiene la ventaja de marcos corto de tiempo para el establecimiento de tumores en ratones disponibles comercialmente. Mientras que algunas líneas celulares de cáncer de vejiga humanos se pueden cultivar de forma ortotópica (hemos utilizado con éxito UM-UC-3), puede ser deseable para establecer tumores en ratones inmunocompetentes. Dos líneas celulares de cáncer vesical murino, que crecen ortotópicamente son MBT-2 y MB49 3. Desde MBT-2 células están contaminados con la replicaciónretrovirus tipo C 4, hemos elegido las células MB49 para nuestros estudios. Es importante señalar que las células MB49 fueron aisladas de un ratón macho y implantaciones ortotópico son por razones anatómicas realizados en ratones hembra. Esto tiene la ventaja de una fácil identificación de las células implantadas por marcadores del cromosoma Y, pero la falta de coincidencia de género puede ser un inconveniente para estudios inmunológicos. El epitelio de la vejiga está revestida por una capa de glucosaminoglucano (GAG), que funciona como una barrera para la infección por microorganismos. Esta barrera también puede interferir con la implantación de las células tumorales y varios métodos se han desarrollado para superar esta dificultad (Tabla 1). Electrocauterio se ha utilizado ampliamente como un medio físico para interrumpir la capa GAG 5-13 y un electrocauterio demostrando protocolo ha sido recientemente publicado en Jove 14. Sin embargo, no debe estar disponible una unidad de electrocauterio, medios químicos para destruir el GAG capa tal como nitrato de plata o de poli-L-lisina también se puede utilizar 15-24. Los tumores se establecieron de manera efectiva por una breve exposición de la vejiga a un pequeño volumen de nitrato de plata (5-10 l, 0,15 a 1,0 M, ~ 10 seg) o de contacto más largo con poli-L-lisina (100 l de 0,1 mg / ml durante 20 min) (Tabla 1). Aquí se describe un método que usa tripsina para facilitar la implantación de las células MB49. En un intento de mejorar los enfoques terapéuticos para el cáncer de vejiga, la terapia génica ha llamado la atención significativa. Desde un punto de vista clínico, el cáncer de vejiga es un objetivo ideal para la terapia génica debido a la fácil accesibilidad del órgano y la capacidad de administrar localmente la carga útil. Los vectores virales que se han explorado para la terapia génica del cáncer de vejiga incluyen un virus oncolítico del herpes simple 25, 26 de retrovirus, virus de la viruela del canario 27, virus de la vacuna, de AAV, y adenovirus 28. En la segunda parte de nuestro protocolo, se describe un método para la entrega viral que es prácticamente idéntica a la instilación de las células tumorales. De interés en nuestro laboratorio es el desarrollo de nuevos enfoques para la entrega de genes, que evaluamos a través de la bioluminiscencia usando un vector adenoviral que expresa un transgen de la luciferasa. Sin embargo, la metodología de la cateterización de la vejiga puede ser utilizado para la entrega de diversos agentes y por lo tanto tiene una amplia aplicabilidad.

<table><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td>Compañía</td><td>Número de catálogo</td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Ratones hembra de 6-8 semanas de edad </td><td>Jackson Laboratories</td><td>Nombre de la cepa: C57BL/6J Número de inventario: 000664</td><td> </td></tr><tr><td> Trypsin* </td><td>MediaTech</td><td>MT25-053-CI</td><td> Obtenido a través de Fisher </td></tr><tr><td> DMEM* </td><td>MediaTech</td><td>MT10-017-CV</td><td> Obtenido a través de Fisher </td></tr><tr><td> FBS </td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td> Heat-inactivated </td></tr><tr><td> T25 frascos* </td><td>Corning Costar</td><td>Corning No.:3056 Fisher: 07-200-63</td><td> Obtenido a través de Fisher </td></tr><tr><td> MB49 cells </td><td>N/A</td><td>N/A</td><td> Obtenido del Dr. Boehle (ver referencia11) </td></tr><tr><td> Puralube Vet Omadment* </td><td>Pharmaderm</td><td>Henry Schein Company No.:036090-6050059 Fisher: NC9676869</td><td> Obtenida a través de Fisher </td></tr><tr><td> Crema depilatoria: Veet </td><td>farmacia local</td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Lubricante: K-Y Jelly </td><td>farmacia local</td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Catheters* </td><td>Exel International</td><td>Exel International No.:26751; Fisher: 14-841-21</td><td> Obtenido a través de Fisher </td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td>Terrell</td><td>NDC 66794-011-25</td><td> Obtenido a través de la farmacia del hospital </td></tr><tr><td> 1 ml de boquilla deslizante jeringas TB </td><td>Becton Dickinson</td><td>BD309659 Fisher:14-823-434</td><td> </td></tr><tr><td> D-Luciferin </td><td>Gold Biotechnologies</td><td>L-123-1</td><td> </td></tr><tr><td> Ad-CMV-Luc </td><td>VectorBiolabs</td><td>1000; Solicite amplificación a gran escala y purificación de CsCl para uso in vivo</td><td> Agente infeccioso que requiere contención de BSL2 </td></tr><tr><td> Steady-Glo&nbsp; Sistema de ensayo de luciferasa </td><td>Promega</td><td>E2510 (10 ml), E2520 (100 ml) o E2550 (10 x 100 ml)</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">*disponible a través de múltiples proveedores</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td> sistema de anestesia </td><td>E-Z Systems, Euthanex Corporation</td><td>Sistema de anestesia: EZ7000 5 puertos de ratón dispositivo de reinhalación: EZ109</td><td> Obtenido a través de Fisher </td></tr><tr><td> Xenogen IVIS 200 </td><td>Caliper Life Sciences</td><td>http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm</td><td> </td></tr><tr><td> FLUOstar Optima </td><td>BMG Labtech</td><td>http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2</td><td> </td></tr></tbody></table>

un modelo ortotópico de cáncer de vejiga de estudios de liberación de genes

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

El cáncer de vejiga es el segundo cáncer más común del tracto urogenital y nuevos enfoques terapéuticos que pueden reducir son necesarios recurrencia y progresión. El microambiente tumoral puede influir significativamente en el desarrollo del tumor y la respuesta al tratamiento. Por lo tanto, a menudo es deseable hacer crecer las células tumorales en el órgano del que se derivan. Este protocolo describe un modelo ortotópico de cáncer de vejiga, en el que las células de carcinoma de vejiga murino MB49 se instila en la vejiga a través de la cateterización. Implantación de células tumorales con éxito en este modelo requiere la interrupción de la capa protectora de glucosaminoglucano, que se puede lograr por medios físicos o químicos. En nuestro protocolo de la vejiga se trata con tripsina antes de la instilación de células. La cateterización de la vejiga también puede ser utilizado para entregar la terapéutica de una vez establecidos los tumores. Este protocolo describe la entrega de una construcción adenoviral que expresa un gen indicador de luciferasa. Si bien our protocolo ha sido optimizado para los estudios a corto plazo y se centra en la entrega de genes, la metodología de ratón cateterismo vesical tiene amplias aplicaciones.

La hematuria se observa en casi todos los ratones dentro de 8 días después de la implantación de las células MB49 200000. Como se muestra en la Figura 1, el peso de la vejiga es más del doble de 34,7 ± 3,3 mg (rango de 31-37 mg, n = 4) no tumoral en ratones portadores de 87,5 ± 19,2 mg (rango de 77 a 120 mg, n = 10) en ratones que han sido implantados con las células MB49. En términos de la entrega de genes, encontramos que las imágenes ratones 24 horas después de la instilación viral produce una señal ...

Implantación de células de cáncer en el órgano de origen puede servir como un modelo preclínico útil para evaluar nuevas terapias. Células de carcinoma de vejiga MB49 se pueden cultivar dentro de la vejiga después de la instilación intravesical. Este protocolo demuestra la cateterización de la vejiga de ratón para el propósito de la implantación del tumor y la entrega adenoviral.

Un modelo ortotópico de cáncer de vejiga de Estudios de liberación de genes

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

El objetivo general de este procedimiento es producir de manera constante y rápida tumores en las vejigas de ratones, que luego pueden utilizarse para probar terapias contra el cáncer de vejiga. Esto se logra primero mediante la instilación de células cancerosas en las vejigas de ratones mediante cateterización. Ocho días después, se repite la cateterización para instilar un adenovirus que expresa un gen reportero de luciferasa.Luego, 24 horas después, se mide la expresión génica viral mediante un ensayo de luciferasa. Se obtienen resultados que muestran las condiciones bajo las cuales se puede lograr una expresión génica óptima. La demostración visual de esta técnica es fundamental porque los pasos de cateterización e instalación son difíciles de aprender y porque existe el riesgo de dañar la vejiga o provocar fugas del material instilado.Dos días antes de realizar la implantación celular en matraces T25, sembrar un millón de células MB49 en DMEM de alta glucosa suplementado con 10 % de suero bovino fetal (FBS) el día del procedimiento. Preparar la tripsina para la disociación celular diluyendo tripsina estéril al 0,25 % de grado para cultivo celular en medio base DMEM. Colocar la solución en un baño de agua a 37 grados Celsius para equilibrarla; precalentar una placa calefactora y colocarla debajo de los conos nasales del sistema de anestesia que se utilizará para administrar isoflurano.Coloque una almohadilla absorbente limpia sobre la almohadilla calefactora después de anestesiar a los ratones con 3% isoflurano. Realice una compresión del dedo del pie para verificar el nivel de sedación. Colóquelos en posición supina sobre la almohadilla calefactora y fije una concha nasal con 2% isoflurano.Utilice un gel lubricante no irritante para lubricar un nuevo catéter venoso pediátrico estéril de 20 4G. Luego retire y deseche la aguja sosteniendo la base del catéter. Utilice el pulgar y el dedo índice de la otra mano para separar las patas traseras del ratón y exponer el orificio uretral.Inserte suavemente el catéter en la uretra con un ángulo de 45 grados, cambiando luego el ángulo para que quede paralelo a la mesa y permitir su inserción completa después de haberlo introducido por completo. Levante el catéter suavemente manteniéndolo paralelo a la mesa y verifique visualmente que esté colocado en la uretra y no en la vagina, que se encuentra debajo de esta. Repita el procedimiento con los ratones anestesiados restantes.Luego reduzca la concentración de isoflurano en flúor a 1 %. Coloque una punta en un pipeta P200 y extraiga la orina de la vejiga aplicando succión al extremo externo del catéter. Retire cualquier orina restante del conector del catéter, luego deseche la orina y deje el catéter en su lugar. Pipete cuidadosamente 80 microlitros de la solución de trips precalentada en el conector del catéter, evitando burbujas de aire.Coloque una jeringa de un CC llena de aire en el conector del catéter y presione lentamente el émbolo. Utilice de 0,1 a 0,2 ccs para introducir la tripsina en la vejiga. Deje la jeringa y los ensamblajes del catéter en su lugar durante 15 minutos.Para preparar las células para la implantación, retire el medio de las células MB 49 previamente sembradas y agregue 500 microlitros de tripsina al 0,25 % al frasco. Cuando las células se desprendan, añada cinco mililitros de DMEM completo para resuspender las células, retire un alícuota de 50 microlitros para contarlas y centrifugue el resto a 1000 RPM durante cinco minutos mientras las células giran.Utilice un citómetro de hemlisis para contar las células y calcular el número de células por mililitro, así como el volumen de medio necesario para llevar el botón celular a cuatro veces 10 a la seis células por litro. Retire el sobrenadante de las células centrifugadas y resuspenda. Suspenda el botón en medio base DMEM.Mantenga las células a temperatura ambiente. Después del tratamiento con tripsina de 15 minutos, retire la jeringa del catéter dejando el catéter en su lugar. Utilice una pipeta P200 para eliminar por succión cualquier tripsina restante de la vejiga y deseche inmediatamente. Pipete 50 microlitros de la suspensión de células MB49 en la conexión del catéter.Luego, conecte la jeringa de aire de 1 cc al conector del catéter y administre las células a la vejiga presionando lentamente el émbolo. 0,1 a 0,2 cc. Deje el conjunto de catéter y jeringa en su lugar.Deje que las células permanezcan en la vejiga durante 50 minutos. Luego, retire suavemente el conjunto de catéter y jeringa de la uretra. Reduzca el isoflurano al 0 % y permita que los ratones se recuperen de la anestesia sobre la placa calefactora.Cuando un ratón haya recuperado su reflejo de escritura, devuélvalo a su jaula. Precaución: este protocolo utiliza adenovirus, que es un agente infeccioso y debe manipularse bajo estrictas directrices de nivel de seguridad biológica dos (BSL-2). Todos los procedimientos realizados con agentes infecciosos fueron aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad de la Universidad Médica de Carolina del Sur.Ocho días después de implantar células MB 49 en ratones, se verificó la presencia de hematuria colocando a cada animal individualmente sobre una hoja blanca de papel absorbente y presionando suavemente el abdomen para depositar gotas de orina sobre el papel. Una orina que varía del rosa al rojo indica hematuria y es un signo de que los tumores se han establecido; descongele el stock de adenovirus sobre hielo y utilice PBS estéril a temperatura ambiente para diluirlo a 10⁹ pfu por 50 microlitros. Después de anestesiar y cateterizar a los ratones y eliminar la orina según se describió anteriormente en este video, pipetee inmediatamente 50 microlitros de la suspensión viral en la entrada del catéter, luego conecte una jeringa llena de aire y presione el émbolo para administrar el virus a la vejiga. Deje el conjunto de catéter y jeringa en su lugar para permitir que el virus permanezca en la vejiga durante 40 minutos.Luego retire con cuidado el conjunto de catéter y jeringa de la uretra y deseche en una solución de lejía al 10 % para inactivar cualquier virus remanente. Permita que el ratón se recupere de la anestesia antes de devolverlo a su jaula; marque las jaulas para indicar que los ratones han recibido una instilación de adenovirus, ya que el virus será eliminado en el material de cama de la jaula durante varios días y todas las jaulas con material de cama deben manipularse y desinfectarse adecuadamente. Se observa hematuria en casi todos los ratones dentro de los ocho días posteriores al implante de 200 000 células MB 49, como se muestra aquí.El peso de la vejiga se más que duplica, pasando de 34,7 ± 3,3 miligramos en ratones sin tumor a 87,5 ± 19,2 miligramos en ratones implantados con células MB 49. En cuanto a la entrega génica, la obtención de imágenes en ratones 24 horas después de la instalación viral produce una señal más intensa que tras 48 horas. La administración por adenovirus es altamente variable entre los animales, lo cual debe tenerse en cuenta al planificar el tamaño del grupo con fines estadísticos.Si no se dispone de un sistema de imagenología para pequeños animales, un enfoque alternativo para medir la expresión del transgén luciferasa consiste en extraer y homogenizar la vejiga para un análisis in vitro, tal como se demuestra aquí. La comparación entre el análisis in vivo utilizando el sistema para pequeños animales IVIS 200 y el análisis in vitro empleando el kit de luminiscencia estable indica una excelente correlación entre los conjuntos de datos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cateterizar la vejiga de un ratón e instilar células tumorales o agentes terapéuticos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Los tumores de vejiga se establecen en las hembras de una forma mínimamente invasiva a través de cateterismo, la cauterización local, y posterior adhesión de las células cancerosas a los sitios de quema.

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El establecimiento de un modelo de tumor de vejiga ortotópica para evaluar los efectos antitumorales de SARNA intravesical entrega y el control del crecimiento tumoral mediante ecografía y bioluminiscente.

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La técnica establecida para inocular ortotópico xenoinjertos de cáncer de vejiga invasivos primarios requiere laparotomía y la movilización de la vejiga. Este procedimiento inflige una morbilidad significativa en los ratones, es técnicamente difícil y consume mucho tiempo. Lo tanto, desarrolló una alta precisión, abordaje percutáneo utilizando la guía del ultrasonido.

Mínimamente Invasiva Establecimiento de murino ortotópico xenoinjertos vejiga

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Un Modelo de tumor y el tumor murino ortotópico de vejiga Sistema de Detección

Se describe un método novedoso para la entrega de plásmido de DNA en las células uroteliales del ratón vejiga en vivo a través de la cateterización de la uretra y electroporación. Ofrece una manera rápida y conveniente para la generación de modelos de ratón autóctonas de enfermedades de la vejiga.

Novedoso método de plásmido ADN entrega al urotelio de la vejiga de ratón por electroporación

Este protocolo describe la generación de modelos de xenoinjerto ortotópico derivados del paciente inculcando intravesicamente células carcinoma de células uroteliales de alto grado o inyectando intrarectalmente células cancerosas colorrectales en combinación diabética/grave no obesa ratones de inmunodeficiencia (NOD/SCID) para el crecimiento tumoral primario y metástasis espontáneas bajo la influencia de células estromales de ganglios linfáticos, lo que imita la progresión de las enfermedades...

Modelos de xenoinjerto ortotópico derivados del paciente para el carcinoma de células uroteliales humanas y el crecimiento tumoral del cáncer colorrectal y la metástasis espontánea

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Cultivo, manipulación y trasplante ortotópico de organoides tumorales de la vejiga de ratón

Este protocolo describe el proceso de generación y caracterización de organoides uroteliales de ratón que albergan deleciones en genes de interés. Los métodos incluyen la recolección de células uroteliales de ratón, la transducción ex vivo con adenovirus que impulsa la expresión de Cre con un promotor de CMV y la caracterización in vitro e in vivo.

Ex Vivo Modelo organoide de deleciones genéticas mediadas por adenovirus-Cre en células uroteliales de ratón

Aprenda a implantar células MB49 en vejigas de ratón mediante cateterismo para crear un modelo ortotópico de cáncer de vejiga. Este método permite evaluar terapias génicas con adenovirus y ensayos de luciferasa.

Un modelo ortotópico de cáncer de vejiga de Estudios de liberación de genes

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