Un modelo ortotópico de cáncer de vejiga de Estudios de liberación de genes

El objetivo general de este procedimiento es producir tumores de manera consistente y rápida en la vejiga de ratones, que luego se pueden usar para probar terapias contra el cáncer de vejiga. Esto se logra instilando primero células cancerosas en vejigas de ratón mediante cateterismo. Ocho días después, se repite el cateterismo para instilar un adenovirus que expresa un gen reportero de luciferasa.

Luego, 24 horas después, se mide la expresión génica viral mediante un ensayo de luciferasa. Se obtienen resultados que muestran las condiciones en las que se puede lograr una expresión génica óptima. La demostración visual de esta técnica es fundamental porque los pasos de cateterismo e instalación son difíciles de aprender y debido a la posibilidad de daño a la vejiga y/o la pérdida de material instilado.

Dos días antes de realizar la implantación de células en matraces T 25, una vez 10 a las seis células MB 49 y DMEM de alta glucosa suplementado con 10% de FBS el día del procedimiento. Prepare tripsina para la instalación mediante el uso de medio base DMEM para diluir tripsina estéril de grado de cultivo de tejidos al 0,25%. Coloque la solución en un baño de agua a 37 grados centígrados para equilibrar, precalentar una almohadilla térmica y colocarla debajo de los conos de la nariz del sistema de anestesia que se utilizará para administrar isde flúor.

Coloque una almohadilla absorbente limpia sobre la almohadilla térmica después de anestesiar a los ratones con un 3% de flúor. Realice un pellizco en el dedo del pie para verificar el nivel de sedación. Colóquelos en posición supina sobre la almohadilla térmica y coloque un cono de nariz con un 2% de flúor.

Utilice un gel lubricante no irritante para lubricar un nuevo catéter venoso pediátrico estéril 20 4G. A continuación, retire y deseche la aguja que sujeta el centro del catéter. Use el pulgar y el dedo índice de la mano opuesta para separar las patas traseras del ratón y exponer el muus uretral.

Inserte suavemente el catéter en la uretra en un ángulo de 45 grados, cambiando el ángulo a uno paralelo al banco para insertarlo completamente después de la inserción completa. Levante el catéter suavemente manteniéndolo paralelo al banco y confirme visualmente que se coloca en la uretra y no en la vagina, que está debajo de ella. Repita con el resto de los ratones anestesiados.

A continuación, reduzca la concentración de flúor al 1%Conecte una punta a una pipeta P 200 y extraiga la orina de la vejiga aplicando succión en el extremo externo del catéter. Retire cualquier resto de orina del centro del catéter, luego deseche la orina y deje el catéter en su lugar. Pipetee con cuidado 80 microlitros de los viajes calientes y la solución en el centro del catéter. Evitar las burbujas de aire.

Conecte una jeringa llena de aire de un CC al cubo del catéter y presione lentamente el émbolo de 0,1 a 0,2 cc para administrar la tripsina en la vejiga. Deje los conjuntos de jeringa y catéter en su lugar durante 15 minutos.

Preparar las células para la implantación. Retire el medio de las celdas MB 49 previamente plateadas y agregue 500 microlitros de tripsina al 0,25% al matraz. Cuando las células se desprenden a cinco mililitros de DMEM completo para resuspender las células, retire una alícuota de 50 microlitros para contar y centrifugar el resto a 1000 RPM durante cinco minutos mientras las células están girando.

Utilice un hemocitómetro para contar las células y calcular las células por mililitro, así como el volumen de medio necesario para llevar la pastilla de células a cuatro por 10 a las seis células por litro. Vierta el sobrenadante de las celdas de la centrífuga y resus. Suspenda el pellet en el medio base DMEM.

Mantenga las celdas a temperatura ambiente. Después de los viajes de 15 minutos en el tratamiento, separe la jeringa del aeródromo del catéter dejando el catéter en su lugar. Utilice una pipeta P 200 para eliminar los restos de sina de la vejiga por succión y deseche inmediatamente la pipetea 50 microlitros de suspensión de células MB 49 en el cubo del catéter.

A continuación, conecte la jeringa llena de aire CC al centro del catéter y administre las células a la vejiga presionando lentamente el émbolo. 0,1 a 0,2 cc. Dejando el conjunto de la jeringa del catéter en su lugar.

Deje que las células permanezcan en la vejiga durante 50 minutos. A continuación, retire suavemente el conjunto de la jeringa del catéter de la uretra. Reduzca la cantidad de flúor al 0% y permita que los ratones se recuperen de la anestesia en la almohadilla térmica.

Cuando un ratón haya recuperado su reflejo de escritura, devuélvalo a su jaula. Atención, este protocolo utiliza adenovirus, que es un agente infeccioso y debe manejarse bajo estrictas pautas de BSL dos. Todos los procedimientos realizados con agentes infecciosos fueron aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad de la Universidad Médica de Carolina del Sur.

Ocho días después de implantar células MB 49 en ratones, se comprobó la hematuria colocando a los animales individuales sobre un trozo de papel absorbente blanco y presionando suavemente el abdomen para secar gotas de orina sobre el papel. La orina de color rosa a rojo indica hematuria y es un signo de que los tumores se han establecido. descongele el stock de adenovirus en hielo y use PBS estéril a temperatura ambiente para diluirlo a 10, a nueve pfu por 50 microlitros después de anestesiar y cateterizar a los ratones y extraer la orina como se describió anteriormente en este video, pipetear inmediatamente 50 microlitros de suspensión de virus en el centro del catéter, A continuación, coloque una jeringa llena de aire y presione el émbolo para llevar el virus a la vejiga. Dejar el lugar de ensamblaje de la jeringa del catéter, permita que el virus permanezca en la vejiga durante 40 minutos.

A continuación, retire suavemente el conjunto de la jeringa del catéter de la uretra y deséchelo en una solución de lejía al 10% para inactivar cualquier virus restante. Permita que el ratón se recupere de la anestesia antes de devolverlo a su jaula, marque las jaulas para indicar que los ratones han sido instilados con el virus del adenovirus se arrojarán en la cama de la jaula durante varios días, y todas las jaulas en la cama deben manipularse y desinfectarse adecuadamente. La hematuria se observa en casi todos los ratones dentro de los ocho días posteriores a la implantación de 200.000 células MB 49, como se muestra aquí.

El peso de la vejiga se duplica con creces, pasando de 34,7 más o menos 3,3 miligramos en ratones con tumores a 87,5 más o menos 19,2 miligramos en ratones a los que se les han implantado células MB 49. En cuanto a la administración de genes, la toma de imágenes de ratones 24 horas después de la instalación viral produce una señal más fuerte que después de 48 horas. La administración de adenovirus es muy variable entre los animales, lo que debe tenerse en cuenta a la hora de planificar el tamaño del grupo con fines estadísticos.

Si no se dispone de un sistema de imágenes para animales pequeños, un enfoque alternativo para medir la expresión del transgén luciferasa es extraer y homogeneizar la vejiga para su análisis in vitro, como se demuestra aquí. La comparación entre el análisis in vivo con el sistema de animales pequeños IVUS 200 y el análisis in vitro con el kit de brillo constante indica una excelente correlación entre los conjuntos de datos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo cateterizar una vejiga de ratón e instilar células tumorales o agentes terapéuticos.