Name: Modelo murino Spinotrapezius para evaluar el impacto de la ligadura arteriolar en la función microvascular y Remodelación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 43 s
Description: Aprende a evaluar la remodelación microvascular y la vasodilatación funcional mediante ligadura arteriolar en el músculo espinotrapezoide murino. Este modelo permite estudiar la isquemia esquelética con microscopía intravital y confocal.

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Reconocemos Kevin Macleod para el uso creativo de su música con licencia commons en el video asociado, incluyendo (en orden de aparición) su &quot;sala del aeropuerto,&quot; pistas &quot;Fondo de pantalla&quot; y &quot;Melodrama tarde&quot;. También queremos agradecer a Ndubisi Okeke y Torstrick Federico por su ayuda en el video la cirugía.

1. RSS Spinotrapezius Ligadura Arteria Cirugía <ol><li> Se anestesia el ratón por inyección intraperitoneal. En una jeringa de 0,5 ml, formular: 0,06 ml de 100 mg / ml de ketamina 0,03 ml de 20,0 mg / ml de xilazina 0,01 ml de 0,4 mg / ml de atropina 0,30 ml de solución salina 0,9%. Dosis: 0,01 * ml por gramo de peso corporal, ip </li></ol> * Variable en dosis cepa de ratón y de valores, los ajustes necesarios para la recuperación del ratón está dentro de una hora de inducción. <ol start="2"><li> Aplique ungüento oftálmico estándar para evitar la desecación corneal. </li><li> Eliminar el pelo de la parte posterior usando las podadoras recorte, seguido de breve aplicación de la crema depilatoria. </li><li> Desinfectar el campo quirúrgico con clorhexidina o povidona yodada. Alternate povidona-yodo con etanol tres veces, terminando con povidona-yodo. </li><li> Transferir el ratón hacia la superficie de trabajo previamente preparado quirúrgica, con el cojín de calefacción y campo estérilen su lugar. </li><li> Crear una incisión lineal (3-5 mm) a través de la piel dorsal de aproximadamente 5 mm caudal a la prominencia ósea de la escápula con unas tijeras y pinzas iris patrón estándar (por ejemplo, FST, 11271-30) por tenting el tejido y corte paralelo a la columna vertebral. El sitio de la incisión de destino pueden ser identificadas por visualización transdérmica de la almohadilla de grasa dorsal si lo permite la pigmentación de la piel; cortado en el borde caudal de la almohadilla de grasa. Expandir la incisión, según sea necesario, y se extienden a través de capas de la piel secundarias utilizando tijeras resorte. <ol><li> Nota anatómica - El músculo spinotrapezius encuentra dorsalmente y se extiende desde T4 a L3 a lo largo de cada lado de la columna vertebral. El borde anterior se extiende lateralmente hasta aproximadamente el omóplato. El músculo se estrecha en la dirección caudal de modo que el borde más posterior se encuentra medial al borde anterior, y puede poner al ras con la columna vertebral. Dos almohadillas de grasa son también importante tener en cuenta, por el que se directamente dorsal y ventral de los spinotrapeziusmúsculo hacia la mitad del cráneo. </li><li> La inflamación debida a la incisión se ha demostrado no tener ningún efecto sobre la respuesta de la remodelación vascular, como la ligadura de cirugía simulada no mostraron ningún cambio en la remodelación de la vasculatura spinotrapezius. Dos factores espaciales contribuyen a este resultado. En primer lugar de la incisión se elimina por 5 mm en la dirección craneal de la región de interés en la que típicamente la respuesta vascular en el músculo examinado. Además, el sitio de la incisión en la piel dorsal se separa del sitio de ligadura de los vasos por una almohadilla ventral grasa que se encuentra en la parte superior de la tercera craneal del músculo spinotrapezius. </li></ol></li><li> Lavar la herida con solución de Ringer caliente para evitar la desecación del músculo. Aplicación de los vasodilatadores tales como la papaverina ayudará en la visualización de la arteria diana para la ligación. </li><li> Bajo un microscopio de disección, utilice pinzas para mitigar diseccionar y separar (pero no eliminar) el dorsal blanca almohadilla de grasa de la musc subyacenteular tejido con el fin de visualizar la vasculatura a medida que entra y sale de la spinotrapezius en su borde lateral. </li><li> Localizar la arteria objetivo, que junto con uno o dos pares de venas, pasa a través de la almohadilla de grasa que es ventral al spinotrapezius en su camino en el borde lateral del músculo. Esta arteria alimenta una parte sustancial de la mitad caudal del músculo, que se puede confirmar mediante la reflexión y reemplazando el músculo para observar el trayecto de la arteria dentro del músculo. La ubicación de destino para la ligadura es el segmento de la arteria que sale de la almohadilla de grasa ventral y entrar en el músculo, y es bastante accesible en esta región. El par arteria-vena puede necesitar ser suavemente separadas de la almohadilla de grasa ventral en esta región. Tenga en cuenta que la spinotrapezius es alimentado por múltiples pares de vena arteria, incluyendo los vasos que atraviesan tanto las almohadillas de grasa dorsal y ventral. Tenga cuidado de no alterar estos vasos. <ol><li> Indicadores múltiples pueden ser utilizados para distinguir la arteriade la vena. Uno de los mejores métodos es suavemente obstruir el flujo de sangre con la microsonda y moverse aguas arriba lejos del músculo; flujo no se reanudará en la arteria hasta que la obstrucción se libera. El color también se puede utilizar, como paredes de las venas contienen una vaina blanquecina de tejido conectivo que carecen de las arterias. Además, se puede considerar el diámetro antes de la aplicación de vasodilatador como venas son típicamente más grandes en tamaño. </li></ol></li><li> La arteria se encuentra típicamente en las proximidades de su vena emparejado, el uso de una disección roma con una microsonda y # 5 fórceps para aislar un segmento de aproximadamente 5 mm, haciendo pasar la microsonda detrás de la arteria, y con la punta para hacer un hueco más amplio en el natural hendidura entre la arteria y la vena. Este es el espacio a través del cual se realizará la sutura enhebrada. </li><li> Uso de 10-0 sutura de un solo hilo y aguja lugar titular de una ligadura alrededor de la arteria de alimentación (~ 70 m de diámetro) hacia el extremo proximal del segmento de disección usando un nudo de cirujano. Place una ligadura adicional hacia el extremo distal del segmento de arteria disecada, con una separación suficiente entre las ligaduras para permitir la sección de la arteria. <ol><li> La pequeña escala asociada a la arteria de alimentación spinotrapezius conduce a una mayor dificultad quirúrgica, en comparación con la ligadura de un vaso más grande tal como la arteria femoral. Cirujanos sin experiencia en particular que tienen altas tasas de avulsión, hemorragia accidental, y otras complicaciones quirúrgicas. De especial preocupación es la dificultad de identificar y cortando la arteria incoloro después de flujo ha sido impedida justo antes de cortar. Por estas razones, colocando ligaduras 2 se recomienda para quienes no están acostumbrados al procedimiento, ya que el cirujano tiene una guía visual en la localización donde para seccionar la arteria, así como una confirmación del corte con la separación fácilmente observable de los 2 ligaduras. Sin embargo, un cirujano más experimentado puede encontrar una ligadura sola suficiente, siempre y cuando sean capaces de claridadidentificar y cortar las arterias corriente abajo de la ligadura. Mientras que esta técnica reduce el riesgo de mellar involuntariamente un vaso cercano con la ligadura de sutura fuerte, no está exento de inconvenientes, incluyendo la dificultad mayor en la confirmación de la arteria se cortó transversalmente. </li></ol></li><li> Verificar la ligadura mediante la observación de la disminución de flujo de sangre (obstruida columna RBC) aguas abajo del sitio de la ligadura (es decir, hacia el músculo). </li><li> Utilizando unas tijeras de disección seccionar la arteria ligado, entre las dos ligaduras. Si sólo uno de ligadura se colocó (11a), se cortó con cuidado extremo en la dirección de aguas abajo. </li><li> Cargado con fármaco llanura de película (1 mm) se puede colocar aguas abajo (caudalmente) como parte del procedimiento experimental. </li><li> Cambiar la posición de la fascia y el tejido adiposo desplazada a su orientación original. </li><li> Cierre la incisión de la piel con 8-0 suturas no reabsorbibles. A continuación, coloque el ratón en una jaula de recuperación climatizada preparada bajo observación y administrar un apapropiados analgésico tal como bupivacaína, 0.02-0.05 ml 0,25% infiltración local. </li></ol> 2. Microscopía intravital Spinotrapezius, in situ <ol><li> Se anestesia el ratón en una cámara de inducción con isoflurano 3-4% vaporizado en 100% de oxígeno a una velocidad de flujo de 3-4 L · min -1. <ol><li> El uso de anestesia inhalante es preferible para las mediciones funcionales porque hay una menor depresión cardiovascular que con anestésicos inyectables. Si la anestesia inhalante en no disponibles, de acción prolongada anestésicos inyectables, tales como sodio pentobarbital se prefieren para evitar repetir las inyecciones una vez que el animal ha sido colocado. </li></ol></li><li> Una vez anestesiadas, continuamente entregar isoflurano a través de una mascarilla de anestesia (cono de nariz aka) en concentraciones de mantenimiento (generalmente ~ 2%) y la tasa de flujo de 0,5-1 L -1 · min. <ol><li> Ratones predominantemente ventilar a través de sus fosas nasales, por lo que es necsario para cubrir su nariz con el diafragma máscara de anestesia. </li></ol></li><li> Si es necesario, quitar el pelo de la parte posterior usando las podadoras recorte y la crema depilatoria. </li><li> Transportar el animal a la almohadilla de calor. <ol><li> Es importante mantener los ratones en un estado euthermic para evitar la vasoconstricción inducida por frío; esto se puede lograr a través de las lámparas, de circulación de agua almohadillas de calor, apto para microondas calienta almohadillas, etc </li></ol></li><li> Insertar la sonda de temperatura rectal y establecer termo-controlador a 35 ° C. </li><li> Hacer una incisión en la piel en el extremo caudal de los spinotrapezius utilizando tijeras iris y pinzas estándar del patrón. </li><li> Extienda la incisión cranealmente a la almohadilla de grasa, la creación de una incisión de herradura, y cubrir el colgajo de piel con una envoltura de plástico para evitar la desecación. </li><li> Blunt disecar el tejido conectivo subcutáneo con pinzas y tijeras de primavera para maximizar la visibilidad. </li><li> Coloque los electrodos estimulantes como toge cercather como sea posible, para minimizar el tamaño de la corriente de campo, y la posición en el extremo caudal del músculo expuesto justo lateral a la columna vertebral. </li><li> Lleve a cabo una estimulación de prueba para confirmar la colocación de electrodos utilizando un sistema de adquisición de datos electrodo, aislador de estímulo del electrodo, y el controlador de ordenador, con ondas cuadradas de 200 microsegundos de duración, 2 mA amplitud, entregada a 1 Hz. </li><li> Coloque una envoltura de plástico sobre el músculo expuesto para evitar la desecación. </li><li> Empezar a cronometrar un periodo de 30 minutos durante el cual diámetros de los vasos se equilibre. </li><li> Coloque el microscopio intravital sobre el músculo spinotrapezius para ver la arquitectura vascular. <ol><li> Si se utiliza un lente de inmersión, coloque una gota de PBS entre el objetivo y la envoltura de plástico. </li></ol></li><li> Comenzando por encima de la arteriola principal (el recipiente más grande visible), la etapa de manipular en el plano XY para localizar el vaso de interés. <ol><li> Visualización pequeña arterioles con microscopía de luz reflejada requiere mayor contraste que proporciona la columna de glóbulos rojos. Usamos principalmente una corriente lateral de campo oscuro microscopio de imagen para mejorar el contraste microvascular, pero el contraste también se puede mejorar con un microscopio de luz reflejada fluorescente después de la inyección intravenosa de un alto peso molecular fluorescente dextrano. </li></ol></li><li> Después de la equilibración 30-min, capturar una imagen / vídeo del vaso de interés. </li><li> Estimular el músculo con ondas cuadradas de 200 microsegundos duración, amplitud 2 mA, entregado en 8 Hz, durante 90 segundos, como se describe anteriormente. </li><li> Capturar otra estimulación imagen / vídeo inmediatamente después y continuar para capturar cada minuto hasta buque ha vuelto al diámetro de reposo, ~ 10 min. </li><li> Repetir los pasos 6-18 utilizando el músculo contralateral. </li><li> El análisis de datos se puede realizar en tiempo real con pinzas de vídeo o fuera de línea con el software de análisis de imagen. </li><li> Sacrificar al ratón seguirING IACUC protocolo. </li></ol> 3. Cosecha de tejidos Spinotrapezius y fijación <ol><li> Anestesiar los ratones por inyección intraperitoneal, la formulación como en la etapa de ligación Spinotrapezius RSS Arteria 1. </li><li> Hacer una incisión de varios milímetros craneales a la prominencia ósea del omóplato del ratón usando tijeras iris y pinzas estándar del patrón. Expandir la incisión lateralmente y luego caudalmente en ambos lados. </li><li> Suelte la piel dorsal del torso suavemente reflejando la piel y cortar la fascia superficial. </li><li> Use disección roma para eliminar el tejido adiposo dorsal usando fórceps estándar y, a continuación reflejan el músculo y de manera similar diseccionar tejido adiposo ventral. </li><li> Retire la placa que cubre el músculo utilizando pinzas y tijeras de primavera. Este paso puede ser difícil y consumir mucho tiempo, pero es importante para mejorar la tinción de inmunofluorescencia y de imagen. Manteniendo el tejido hidratado puede facilitar la extracción de la fascia. </li><li> Localizarel borde lateral del músculo, y el uso de una disección roma para separar el músculo spinotrapezius de la almohadilla de grasa que se encuentra ventral a la misma. </li><li> Continuar la disección roma en una dirección craneal a caudal. Tenga en cuenta que varios vasos sanguíneos entrar y salir de esta superficie ventral del músculo; perfusión si es necesario, se debe realizar antes de seccionar estos vasos. Tenga en cuenta también que en la mitad caudal del músculo, sus insertos borde lateral en el músculo acostado ventral a la misma. Algunos de corte puede ser requerido a lo largo de esta frontera para definir completamente y liberar el borde. </li><li> Impuestos Especiales del músculo spinotrapezius. Para hacer esto: <ol><li> Libre el borde lateral del músculo como se ha descrito anteriormente. </li><li> Cortar transversalmente a través de medida más craneal del músculo. </li><li> Corte a lo largo del borde medial (a lo largo de la columna vertebral), en el plano sagital. </li></ol></li><li> Repita los pasos del procedimiento de 4-9 sobre el músculo contralateral, y luego sacrificar al mouse por un método aprobado IACUC. </li><li> Fijar los tejidos sobre portaobjetos de vidrio recubiertos de gelatina por inmersión en metanol frío (4 ° C) o en un 4% de paraformaldehído / solución de agua desionizada a temperatura ambiente durante 20 min. <ol><li> Alternativamente, la fijación de la perfusión puede ser empleado. Antes del paso 2, realizar una toracotomía, hacer una incisión en la aurícula derecha, y la vasculatura perfundir con 5 ml de 1 × Tris-solución salina tamponada con 0,1 mM CaCl 2 y 2% de heparina a través del ventrículo izquierdo, seguido por 5 ml de 4 % de paraformaldehído para la fijación recipiente, y, finalmente, 5 ml de 1 × Tris-solución salina tamponada con 0,1 mM de CaCl 2 7. </li></ol></li><li> Inmediatamente posterior a la fijación, se lava la muestra cuatro veces durante 20 minutos cada uno. 0,01 M usando tampón fosfato salino (PBS) con 0,1% de saponina </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.

El modelo murino spinotrapezius ligadura aquí se presenta es un modelo efectivo de pequeños animales para estudiar las adaptaciones funcionales y estructurales que resultan de una oclusión arterial. Este modelo es complementario al modelo de isquemia ampliamente utilizado miembro posterior 4, en que proporciona una vista de músculo entero de redes microvasculares intactas con alta resolución espacial. Además, dado que este músculo se encuentra justo debajo de la piel dorsal, que es accesible para formación de imágenes en serie con microscopía intravital, y para administración local de fármacos a través de superfusión o implantación de película delgada 2. Estas características lo convierten en un modelo atractivo de pequeños animales para estudiar los efectos de las nuevas dianas terapéuticas en el remodelado vascular y vasodilatación funcional después de la oclusión arterial. Tenga en cuenta que se debe tener precaución cuando se comparan los datos obtenidos en el modelo de la ligadura spinotrapezius a los datos adquiridos en el modelo de la ligadura patas traseras debido a varios d claveL as diferencias. En primer lugar, los músculos spinotrapezius se están estabilizando los músculos, y se diferencian de los músculos de las piernas en términos de función y distribución del tipo de fibra. Nuestro grupo ha demostrado que la ligadura arteriolar en el músculo spinotrapezius crea hipoxia menor o insignificante en cepas con bien desarrolladas redes colaterales arteriolares, en comparación con la hipoxia observada en la pata trasera después de la ligadura de la arteria femoral en el modelo de extremidades traseras 1,8 - 10. También hemos demostrado que el modelo de ligadura spinotrapezius produce una respuesta diferente remodelación en ratones Balb / c en comparación con ratones C57BL / 6, con ratones Balb / c remodelación redes por colateralización capilar y remodelación C57bl / 6 por la ampliación de las actuales conexiones arteriolares 3. Hay un paralelo interesante entre estas observaciones y las realizadas en modelos de ligadura del miembro posterior, en el que ratones Balb / c experimentar una recuperación de la perfusión prolongada después de la ligadura en comparación con ratones C57BL / 6 9,11,12 &lt;/ Sup&gt;. En otros modelos de isquemia tisular, la edad del ratón género 13 14 y la presencia de la enfermedad 15 también afectar las respuestas de los tejidos a la oclusión arteriolar, aunque todavía no hemos probado estos predictores en el modelo de la ligadura spinotrapezius. En segundo lugar, el tamaño de la arteria que se ligó en el modelo spinotrapezius es sustancialmente menor que la arteria femoral, y por lo tanto, la ligadura impacta un volumen de tejido más pequeño que es más aguas abajo, es decir, a un nivel inferior del árbol circulatorio, en el spinotrapezius en comparación con la pata trasera 3. Por lo tanto, la diferencia anatómica en la ubicación de la ligadura en estos dos modelos se debe considerar cuando se comparan las respectivas respuestas fisiológicas (por ejemplo, la remodelación vascular) para esta intervención. En tercer lugar, la delgadez de las spinotrapezius puede permitir que el oxígeno alcance la porción unperfused del tejido de la vecinatejido, en comparación con la isquemia y la hipoxia combinada en el modelo de extremidades posteriores como se señaló anteriormente 3. En cuarto lugar, la recuperación del flujo a la porción de aguas abajo spinotrapezius de la ligadura es más rápido que en la ligadura de las extremidades traseras. El modelo de ligadura spinotrapezius es un modelo crónico único y no debe ser confundido con otros modelos de oclusión arterial transitoria o modelos de lesión por isquemia reperfusión. Consideramos que es posible la adaptación de este modelo para acomodar estos tipos de condiciones, pero esto está fuera del ámbito de aplicación de trabajo que se presenta en este documento. Por último, advertimos en contra de relación directa con las observaciones preclínicas en este modelo a las manifestaciones clínicas de la enfermedad isquémica en los seres humanos, especialmente cuando se utilizan joven y por lo demás ratones sanos y debido a las limitaciones inherentes fisiológicos como la frecuencia cardíaca superior 5. No obstante, consideramos que este nuevo modelo como una herramienta valiosa para el descubrimiento de los mecanismos básicos de las respuestas tisulares a la ligadura y la identificación del potencialpéuticas objetivos en un entorno en vivo. Además de las notas quirúrgicos proporcionados en el procedimiento de ligadura de la arteria de alimentación spinotrapezius (nota anatómica (6a), distinguiendo la arteria de la vena (9a), y el uso de una ligadura única (11a)), algunos otros aspectos de la prestación procedimiento desde discusión. En primer lugar, la incisión inicial realizada por la frontera almohadilla grasa dorsal (o varios mm caudal de la escápula, si la visualización transdérmico no es posible) está muy bien hecho tan pequeño como el cirujano se sienta cómodo, y se expandió durante el procedimiento si es necesario. Este método minimiza la sutura necesaria para cerrar la incisión, lo cual es conveniente para el cirujano, reduce el tiempo de procedimiento, y es también menos irritante para el animal durante la recuperación. Alternativamente, una incisión en la piel más grande puede ser apropiado de acuerdo con las preferencias del cirujano, ya que el músculo puede ser más fácil de localizar con un campo expandido. En este caso, la incisión puedebeneficiarse de una forma de herradura con una cara medial abierta para permitir el plegado hacia la columna. Al hacer la incisión en la piel y que se extiende a través de las capas de la piel secundarias, si un buque de superficie está dañado y causa hemorragia, aplicar una ligera presión con una gasa estéril y proporcionar tiempo para la hemostasia. También de la nota, es importante para manejar el tejido con un mínimo de fuerza, y siempre que sea posible mantener con fórceps más cerca de borde lateral del músculo y lejos de la zona isquémica previsto. Esta práctica ayuda a evitar la lesión por aplastamiento, que puede conducir a otras respuestas tisulares inflamatorias mediadas que pueden confundir la respuesta de remodelado vascular provocada por la ligadura arterial. En conclusión, hemos demostrado el uso de la spinotrapezius músculo murino como un modelo quirúrgico para examinar las respuestas vasculares y el tejido de la ligadura de las arteriolas. Este modelo es adecuado para la evaluación intravital de cambios vasculares (porejemplo, la vasodilatación funcional), y para la evaluación ex vivo de los cambios vasculares (por ejemplo, formación de imágenes de inmunofluorescencia y la cuantificación de las redes vasculares). Ambos estudios preclínicos y clínicos han demostrado que la respuesta de un individuo a la obstrucción arteriolar (por ejemplo, a través de la ligadura en los ratones o de placas ateroscleróticas en los seres humanos) depende de su edad la presencia o ausencia de la enfermedad (por ejemplo, diabetes mellitus) el diámetro de la arteria obstruida , la composición genética del individuo, y la demanda metabólica del tejido 11-15. Los modelos murinos, como la que se presenta aquí, aprovechar el investigador de las diferencias cepa específica anatómicos y genéticos y fenotipos específicos de la enfermedad, lo que facilita la investigación en estas complejas relaciones.

Los modelos animales de isquemia crónica son herramientas valiosas para la investigación de la fisiopatología de las enfermedades isquémicas, tales como enfermedad arterial periférica, enfermedad de la arteria coronaria y enfermedad cerebrovascular. En los roedores, como en los seres humanos, la oclusión arterial conduce a la remodelación estructural de la red vascular, incluyendo la arteriogénesis y la angiogénesis. En pacientes sanos y jóvenes, esta remodelación puede ser suficiente para rescatar el tejido de la isquemia inducida por la lesión, pero comorbilidades tales como la diabetes puede comprometer gravemente la remodelación y la recuperación. La comprensión de los mecanismos subyacentes a los eventos vasculares remodelación es esencial para el desarrollo de terapias que estimulan estos procesos endógenos de revascularización. Actualmente, la ligadura de la arteria femoral o la resección en la extremidad posterior es la técnica estándar para el estudio crónica inducida por isquemia remodelación vascular en animales pequeños 4,5. Análisis del diámetro, la conectividad y la reactividad de loslos microvasos que forman aguas abajo de la red vascular de la arteria femoral ligada es difícil, sin embargo, debido al grosor de los músculos. Hemos desarrollado un modelo de ligadura arteriolar en el músculo de ratón spinotrapezius: ligadura unilateral de la arteria de alimentación lateral en este músculo dorsal estabilizador 1. Los spinotrapezius relativamente delgadas (60-200 micras) es susceptible de inmunotinción en face para la evaluación de la topología de toda la red con una sola célula de resolución, lo que permite un examen detallado de los acontecimientos de remodelación vascular a través de todo el tejido. El spinotrapezius es también superficial y accesible, y por lo tanto sus buques son fácilmente observables por microscopía intravital, para la caracterización eficiente de los efectos de la remodelación y la ligadura arteriolar en la reactividad vascular. En este reporte se describe en detalle y demostrar el ratón spinotrapezius modelo ligadura arteriolar. Tanto in vivo y ex vivo methods de la cirugía de evaluación siguiente se describen, incluyendo la medición de la vasodilatación funcional, que se ha demostrado que se deteriora bajo condiciones isquémicas 6, y las imágenes de inmunofluorescencia de redes microvasculares de músculo entero. También incluimos los resultados de dos estudios piloto por separado para demostrar la utilidad del modelo. En primer lugar, se utilizó el modelo de ligadura arterial para inducir un aumento estadísticamente significativo en la tortuosidad buque en C57BL / 6 ratones (Figura 2B). Aumenta la tortuosidad durante arteriogénesis colaterales en las arteriolas. En otras cepas de ratón, que son más vulnerables a la isquemia debido a la ausencia de las arteriolas colaterales (por ejemplo, Balb / c), se observa arterialización capilar 10. Arterialización capilar se detecta por el aumento de los diámetros y el desarrollo de α-actina de músculo liso reactividad. En segundo lugar, la estimulación eléctrica funcional del músculo conduce a la vasodilatación en las arteriolas terminales de la spinotrapezinosotros (Figura 3B).

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Iris tijeras </td><td> FST </td><td> 14090-09 </td><td> Tipo: Tool </td></tr><tr><td> Tamaño 7 fórceps </td><td> FST </td><td> 11271-30 </td><td> Tipo: Tool </td></tr><tr><td> Tamaño 5 fórceps </td><td> FST </td><td> 11251-20 </td><td> Tipo: Tool </td></tr><tr><td> Tijeras de primavera </td><td> Roboz </td><td> RS5671 </td><td> Tipo: Tool </td></tr><tr><td> Microprobe </td><td> FST </td><td> 10140-03 </td><td> Tipo: Tool Puede estar sustituido con sonda recta </td></tr><tr><td> Soporte de la aguja </td><td> FST </td><td> 12500-12 </td><td> Tipo: Tool </td></tr><tr><td> Inducción cámara </td><td> JD Dist Médica. Co., Inc. </td><td> IC-1086 </td><td>Tipo: Equipamiento </td></tr><tr><td> Eye Gel </td><td> Dechra </td><td> NDC 17033-211-38 </td><td> Tipo: Reactivo </td></tr><tr><td> El calor pad </td><td> FST </td><td> 21060-01 </td><td> Tipo: Equipamiento </td></tr><tr><td> Sonda de temperatura rectal </td><td> FST </td><td> 21060-01 </td><td> Tipo: Equipamiento </td></tr><tr><td> Electrodos de estimulación </td><td> FHC </td><td> UEWSGCSE0N1M </td><td> Tipo: Equipamiento </td></tr><tr><td> Artesanos arcilla del polímero </td><td> Polyform </td><td> N / A </td><td> Tipo: Equipamiento </td></tr><tr><td> PowerLab sistema de adquisición de datos </td><td> ADInstruments </td><td> ML 845 </td><td> Tipo: Equipamiento </td></tr><tr><td> Estímulo aislador </td><td> ADInstruments </td><td> FE 180 </td><td> Tipo: Equipamiento </td></tr><tr><td> LabChart </td><td> ADInstruments </td><td> S060 ML / 7 </td><td> Tipo: Software </td></tr&gt; <tr><td> Luz reflejada microscopio de fluorescencia </td><td> Olimpo </td><td> BFXM </td><td> Tipo: Equipamiento </td></tr><tr><td> Alta MW dextrano fluorescente </td><td> Sigma </td><td> FD250S-100MG </td><td> Tipo: Reactivo </td></tr><tr><td> Pinzas Vídeo </td><td> Colorado Vídeo </td><td> 308 </td><td> Tipo: Equipamiento </td></tr><tr><td> Automatizado de Análisis vascular (AVA) </td><td> Microvision Medical </td><td></td><td> Tipo: Software </td></tr><tr><td> Lucha contra el αSMA fluoróforo conjugado </td><td> Sigma </td><td> 1A4-Cy3 </td><td> Tipo: Reactivo 1:100 clonal, </td></tr><tr><td> Microscopio de fluorescencia </td><td> Olimpo </td><td> BFXM </td><td> Tipo: Equipamiento </td></tr><tr><td> De alto peso molecular fluorescente dextrano </td><td> Sigma </td><td> FD250S-100MG </td><td> Tipo: Reactivo </td></tr></tbody></table>

modelo murino spinotrapezius para evaluar el impacto de la ligadura arteriolar en la función microvascular y remodelación

Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling

El spinotrapezius murino es un músculo delgado y superficial soporte del esqueleto que se extiende desde T3 a L4, y es fácilmente accesible a través de incisión en la piel dorsal. Su anatomía única hace que los spinotrapezius útil para la investigación de la lesión isquémica microvascular y la remodelación posterior. Este sentido, demostrar un modelo de la ligadura de las arteriolas en el músculo murino spinotrapezius que fue desarrollado por nuestro equipo de investigación y publicado previamente 1-3. Para ciertas cepas de ratón vulnerables, tales como el ratón Balb / c, esta cirugía de ligadura crea de forma fiable la isquemia del músculo esquelético y sirve como plataforma para la investigación de terapias que estimulan la revascularización. Métodos de evaluación también se ha demostrado, incluyendo el uso de la microscopía intravital y confocal. El spinotrapezius se adapta bien a los estudios de imagen tales debido a su accesibilidad (anatomía dorsal superficial) y delgadez relativa (60-200 micras). El músculo spinotrapezius se puede montar en face, facilitandoformación de imágenes de músculo entero redes microvasculares sin seccionar histológico. Se describe el uso de la microscopía intravital para adquirir siguientes mediciones un procedimiento vasodilatación funcional; específicamente, el aumento en el diámetro arterilar como resultado de la contracción muscular. También demuestran los procedimientos para la recolección y la fijación de los tejidos, un precursor necesario para la inmunotinción estudios y el uso de la microscopía confocal.

Una vista quirúrgica de la arteria principal que alimenta el músculo spinotrapezius que sufre de ligación se muestra en la Figura 1, con etiquetas que indiquen las áreas de interés. Una imagen confocal ejemplo de la región recogieron y se inmunotiñeron de músculo situado directamente aguas abajo de la arteria se ligó una semana después de la ligadura se muestra en la Figura 2A. Agrandamiento de las arteriolas colaterales que contienen músculo liso alfa-actina de músculo liso de las células que expresan (rojo) muestran tortuosidad característica después de la ligadura. Tortuosidad buque, informa como la proporción entre la longitud del recipiente de ruta y la distancia de cable (es decir, la línea que se extiende a través de los extremos de los vasos mismo camino), en el músculo ligado (derecha) se ha mejorado con respecto a músculo contralateral no ligado (Figura 2B, n = 8) . Figura 3 muestra los resultados de un estudio piloto en el que se midió la terminal de vasodilatación arteriolar funcional mediante microscopía intravital. Como era de esperar, arteriolar di<html> ámetro aumenta significativamente después de la contracción muscular eléctrica estimulación inducida. <img src="/files/ftp_upload/50218/50218fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50218/50218fig1highres.jpg"/> Figura 1. Campo quirúrgico de músculo refleja spinotrapezius y la arteria de alimentación. La arteria de alimentación se ligó en los dos lugares indicados por A0. Entre estas ligaduras y después de la obstrucción de flujo de sangre, la arteria se secciona en el sitio indicado por A. El segmento objetivo de las transiciones de la arteria ventral de la almohadilla de grasa, se indica por C, en el músculo spinotrapezius, esbozado por D, en el lugar indicado con la flecha de dirección de flujo B. se indica con trazos flecha E. ghres.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Imagen confocal de red spinotrapezius microvascular del músculo para estudio piloto de tortuosidad. (A) recogidos y músculo entero montado se inmunotiñó para músculo liso alfa-actina y formado la imagen mediante microscopía confocal. El campo de visión se muestra la región del músculo que se encuentra directamente ligado aguas abajo de la arteriola 1 semana después de la ligadura. Vasos tortuosos son evidentes en el músculo como resultado de la unión (B) los resultados del estudio piloto muestran significativamente mayor (p = 0,035; 1 Estudiante de cola de la t-test). Tortuosidad exhibido por microvasos en el músculo ligado medida por la eslora del barco camino a relación de la distancia para un cable de prueba de ratones C57BL / 6 (n = 8) en comparación con el control contralateral. <img src="/files/ftp_upload/50218/50218fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50218/50218fig3highres.jpg"/> Figure 3. Imagen de microscopía intravital de la vasodilatación funcional en las arteriolas spinotrapezius, in vivo. (A) microfotografías representativas de las arteriolas terminales spinotrapezius en reposo (izquierda) e inmediatamente después del cese de la contracción muscular 8 Hz (derecha). (B) Terminal diámetro arteriolar en reposo ( 8,5 ± 0,5 m, a la izquierda) e inmediatamente después (11 ± 1 m, centro) 90 seg de la contracción muscular, lo que aumenta significativamente diámetro arteriolar (p = 0,032; 1-cola prueba t pareada) en ratones Balb / C (n = 6). Variación porcentual indicado (derecha).

Demostramos un nuevo modelo ligadura arterial en el músculo spinotrapezius murino, incluyendo un procedimiento paso a paso y la descripción de la instrumentación requerida. Se describe la cirugía y las medidas de resultado relevantes relacionados con la remodelación de la red vascular y vasodilatación funcional utilizando microscopía intravital y confocal.

Modelo murino Spinotrapezius para evaluar el impacto de la ligadura arteriolar en la función microvascular y Remodelación

The murine spinotrapezius is a thin, superficial skeletal support muscle that extends from T3 to L4, and is easily accessible via dorsal skin incision. ...

La enfermedad vascular periférica afecta aproximadamente al 12-14 % de la población y es especialmente común entre los consumidores de tabaco y las personas con diabetes, obesidad, hipertensión, etapa avanzada o aterosclerosis. El objetivo de esta cirugía es producir un modelo de isquemia muscular esquelética mediante la ligadura de una de las tres arterias que irrigan la mitad caudal del músculo espino trapecio contralateral. Esta animación muestra la ubicación general de estas arterias e indica el sitio previsto para la ligadura en respuesta a la isquemia.El tejido vascular sufrirá cambios característicos de la arteriogénesis dependiendo de la cepa de ratón. Esto incluye la formación de colaterales de puenteo o el aumento de la tortuosidad vascular. También le mostraremos cómo realizar un procedimiento funcional de vasodilatación en el trapecio espinal utilizando microscopía intravital.Esto implica exponer cuidadosamente el músculo, colocar los electrodos estimulantes junto con su fuente de alimentación y controlador, y luego configurar el dispositivo de imagen. Por último, mostraremos cómo extirpar el músculo y describiremos un proceso de fijación adecuado para la tinción inmunoquímica y el análisis por imagen. Hola, mi nombre es Shane Pierce Kotler y soy profesor asociado en el Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Virginia en Charlottesville.Hola, soy Kyle Martin. Soy estudiante de posgrado en el laboratorio de Shane y realizaré el modelo de ligadura del trapecio espinal. Nuestro laboratorio estudia el crecimiento y remodelación microvascular, particularmente en condiciones de enfermedad isquémica como enfermedad cardíaca, enfermedad arterial periférica y accidente cerebrovascular.Desarrollamos este modelo de ligadura del trapecio espinal bilateral para estudiar cómo la obstrucción localizada del flujo sanguíneo arterial genera adaptaciones estructurales en las redes microvasculares aguas abajo. Consideramos que este modelo es complementario al modelo bien establecido y ampliamente utilizado de isquemia de extremidad trasera, ya que ofrece una vista completa de toda la red de arterias, neurogénesis y angiogénesis en un músculo muy delgado que no requiere seccionado histológico para su análisis. Debido a que este músculo es muy delgado y a que la ligadura provoca una reducción reproducible del flujo sanguíneo, podemos visualizar los efectos de la ligadura arterial en toda la cama microvascular y con resolución a nivel de célula individual.Después de que Kyle nos guíe a través del procedimiento paso a paso para realizar el modelo de ligadura del espino trapecio, nuestros colaboradores de Cal Poly nos mostrarán cómo utilizan este modelo para estudiar la vasodilatación funcional. Una vez que veamos eso, los llevaremos de regreso a la Universidad de Virginia para extraer el espino trapecio, lo cual debe hacerse antes del análisis por imágenes y tinción. Hola, mi nombre es Trevor Cardinal.Soy profesor asistente en el Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad Estatal Cal Poly en San Luis Obispo, California, y mi nombre es Josh Cutz. Soy estudiante de maestría en ingeniería biomédica en Cal Poly en San Luis Obispo. El interés principal de nuestro laboratorio de investigación consiste en comprender el impacto de la isquemia crónica, tal como ocurre con la enfermedad arterial periférica, sobre las capacidades funcionales de la vasculatura de resistencia.Después de realizar la cirugía de ligadura de la arteria nutricia espinal del trapecio, Josh demostrará el procedimiento de vasodilatación funcional utilizado en nuestro laboratorio. En nuestro laboratorio, utilizamos el procedimiento de vasodilatación funcional para examinar el efecto de la oclusión arterial sobre la reactividad vascular y el control del flujo sanguíneo. Los instrumentos necesarios para prepararse incluyen una sutura de nudo 10, una sutura de cierre, un portaagujas, tijeras de iris, pinzas estándar, tijeras de resorte y una sonda micro curva.Después de preparar los instrumentos quirúrgicos, anestesie al ratón; aquí utilizamos la fórmula y dosis indicadas. Confirme la anestesia mediante la prueba del reflejo de pellizco en el dedo del pie, luego aplique el protector IGEL utilizando una afeitadora eléctrica para afeitar una amplia zona de pelo de la espalda del animal. Aunque la ligadura del trapecio espinal requiere solo una pequeña área despejada cerca de la escápula, la extracción del tejido del trapecio espinal que se realizará en unos días necesitará una superficie despejada mucho más grande.Retire rápidamente el exceso de pelo, luego aplique crema depilatoria siguiendo las instrucciones del fabricante. Lave la espalda con una esponja húmeda. A continuación, aplique tres series alternas de toallitas con alcohol y Betadine, terminando con Betadine.Bajo condiciones adecuadas de iluminación, el mejor sitio para la incisión puede encontrarse mediante la identificación transdérmica de la almohadilla grasa dorsal. Dado que la arteria nutricia atraviesa finalmente el músculo trapecio espinal de forma abrupta, el borde de la almohadilla grasa sobresale y tiende la piel en este lugar; coloque las tijeras de iris directamente desde arriba, perpendicularmente al dorso del animal, y corte para realizar una incisión lineal de tres a cinco milímetros. Si la iluminación o la pigmentación de la piel no permiten la identificación transdérmica.Realice la incisión a cinco milímetros de distancia del reborde óseo del omóplato, extienda la incisión a través de las capas de la piel y amplíela lateralmente según sea necesario para localizar el trapecio espinal. Diseque la fascia sobreyacente para acceder al sitio de ligadura. Si un vaso superficial se daña y sangra, como en este caso, permita un tiempo para que cese la hemorragia y aplique presión si es necesario, use solución salina para prevenir la desecación.La arteria indicada discurre a lo largo de la cara dorsal del trapecio espinal y luego atraviesa el músculo y penetra en el tejido adiposo ventral. Localice el borde lateral del trapecio espinal y refleje el músculo, levantándolo de manera que quede casi invertido. Esto expone su cara ventral y el sitio transversal de la arteria; diseca el tejido adiposo ventral que oculta el vaso.Tenga cuidado con la presión de la pinza para evitar lesiones por aplastamiento. Aquí el cirujano indica la arteria espina trapeciana que debe ser ligada. Observe la presencia de pares venosos; un vasodilatador como la adenosina de acción más corta, o la papaverina de acción más prolongada, puede aplicarse.En este caso, la arteria se encuentra entre dos vasos adicionales, como indican las flechas. Uno es similar en tamaño a la arteria y se observaría más lateralmente si el músculo no estuviera reflejado, mientras que el otro es mucho más grande y se ubicaría más inmediatamente. Los dos sitios de ligadura están marcados por ai.La primera ligadura se coloca en dirección distal con respecto a la segunda. Esto asegura que el vaso sanguíneo aún esté lleno de sangre y sea visible durante la colocación de la segunda ligadura. A indica la región que se va a seccionar.Observe la ubicación B, donde la arteria y su vena pareada entraron en la almohadilla grasa ventral delimitada por C. Esto nos indica que el segundo vaso más pequeño es una vena. También tenga en cuenta el músculo espinal trapezio mismo delimitado por D. Se proporcionan algunos criterios para diferenciar la arteria de la vena en el protocolo de texto adjunto. Pero brevemente, nuestro método preferido consiste en obstruir el flujo sanguíneo aplicando presión con una sonda microscópica.Si el vaso es una arteria, el flujo será obstruido en la dirección aguas abajo hacia el músculo reflejado aplicado. Esta técnica excluye el vaso más grande. Si es necesario, utilice la sonda microscópica con ángulo de 80 grados para separar la arteria de los otros vasos.Esto se realiza perforando el tejido conectivo debajo del vaso y realizando movimientos laterales breves para ampliar un espacio. Hasta que la sonda pueda pasar fácilmente, ahora puede enhebrarse con mayor facilidad bajo la arteria. En este caso, se hirió una vena pequeña, lo que provocó una hemorragia menor.Este vaso se encuentra lo suficientemente alejado de la zona isquémica como para tener un impacto mínimo. En el procedimiento, haga un nudo quirúrgico simple y prepare la siguiente sutura. Nuevamente, pase a través del espacio previamente creado y ate otro nudo quirúrgico unos milímetros aguas arriba de la ligadura anterior.Tenga en cuenta que el músculo está reflejado y la dirección del flujo puede ser opuesta a la esperada. Después de colocar ambas ligaduras, busque evidencia de una columna de glóbulos rojos obstruida. Si el flujo no se ha detenido, se necesita otra ligadura.De lo contrario, seccione el vaso entre las ligaduras, observando si ocurre algún sangrado; en ese caso, la ligadura fue exitosa y no se observa hemorragia arterial. Un método alternativo emplea una sola ligadura y sección en dirección aguas abajo. Consulte la literatura adjunta para saber cuándo se prefiere este método.Restaure el músculo a su orientación original, reposicione el tejido adiposo y la fascia desplazados y cierre con una sutura no reabsorbible adot. Finalmente, coloque al ratón en una jaula de recuperación calentada bajo observación y analgesia para microscopía intravital del trapecio espinal. Primero se anestesia al ratón con isoflurano en una cámara de inducción y luego se conecta a un flujo continuo de isoflurano a través de un cono nasal.Inserte la sonda de temperatura rectal y configure el controlador térmico a 35 grados C. Los instrumentos que deben prepararse previamente incluyen tijeras de iris, pinzas estándar, tijeras de resorte y una torunda de PBS humedecida. Realice una incisión en la piel en el extremo caudal del trapecio espinal utilizando tijeras de iris y pinzas estándar. Extienda la incisión en dirección craneal hasta el cojín adiposo, creando una incisión en forma de herradura, y cubra el colgajo de piel con envoltura plástica para prevenir la desecación. Diseque cuidadosamente el tejido conectivo subcutáneo con pinzas finas para maximizar la visibilidad.Coloque los electrodos estimulantes, manteniéndolos lo más cercanos posible para minimizar el tamaño del campo de corriente; colóquelos en el extremo proximal del músculo expuesto, justo lateral a la columna vertebral. Fíjelos con arcilla. Realice una estimulación de prueba para confirmar la colocación de los electrodos utilizando un sistema de adquisición de datos PowerLab, un estimulador, un aislador y el software LabChart configurado con ondas cuadradas de 200 microsegundos de duración, amplitud de dos miliamperios y entregadas a un hercio.Cubra nuevamente el músculo expuesto con una envoltura de plástico. Para evitar la desecación, permita 30 minutos por diámetro de vaso para que se equilibre y luego capture su imagen o video. Coloque el microscopio intravital sobre el músculo trapecio espinal para observar la arquitectura de la vasculatura.Si se utiliza una lente de inmersión, coloque una gota de PBS entre el objetivo y el envoltorio de plástico, comenzando por encima de la arteria principal, que es el vaso más grande visible. Manipule el portaobjetos en el plano XY para localizar el vaso de interés. Estimule el músculo con ondas cuadradas de la misma duración y amplitud anteriores, pero aplicadas a ocho hercios y durante 90 segundos inmediatamente después de la estimulación.Imagene el vaso y continúe haciéndolo cada minuto hasta que haya regresado al diámetro en reposo. El análisis de datos puede realizarse en tiempo real con calibradores de video o fuera de línea con software de análisis de imágenes. Repita el procedimiento desde la incisión inicial hasta la obtención de imágenes utilizando el músculo contralateral.Una vez finalizado, sacrificar al ratón siguiendo el protocolo estándar de la A CUC para la extracción del tejido espina trapecio. Necesitaremos tijeras de iris, pinzas estándar y tijeras de resorte.Seduce al ratón según lo descrito anteriormente. Comience realizando una incisión unos milímetros craneales al omóplato del ratón. Amplíe la incisión lateralmente y luego cureteé ambos lados.El objetivo es exponer el músculo trapecio espinal, que se extiende desde T tres hasta L cuatro tras realizar la incisión. La piel puede separarse de la espalda mediante tracción suave o corte cuidadoso del tejido conectivo, manteniéndola en su lugar, sobrefundida con solución salina para prevenir la desecación y facilitar el manejo del tejido. Utilice disección roma para eliminar el tejido adiposo dorsal y exponer el músculo trapecio espinal.De manera similar, retire el tejido adiposo ventral. Después de reflejar el músculo, aquí se identifica el trapecio espinal derecho del animal. A continuación, retire tanto de la fascia sobreyacente como sea posible.Esta parte del procedimiento puede ser tediosa, pero es importante para prevenir artefactos durante la microscopía. Una vez que se ha eliminado el tejido conectivo, extirpe el tejido como se muestra, cortando primero el borde lateral aproximadamente paralelo al dorso y avanzando en dirección craneal a caudal. Luego, corte transversalmente a través de la extensión más craneal y finalmente a lo largo del borde medial, más cercano a la columna vertebral, para recolectar el músculo contralateral.Siga el mismo procedimiento. Primero retire el tejido adiposo dorsal, luego el tejido adiposo ventral y finalmente la fascia superficial mientras corta. Puede resultarle más fácil cambiar los instrumentos a la mano menos dominante.El tejido extirpado puede fijarse y lavarse siguiendo el procedimiento descrito aquí después de que el animal haya sido sacrificado. De acuerdo con un protocolo mejorado de A CUC. Consulte la literatura adjunta para obtener detalles sobre un procedimiento alternativo de fijación por perfusión.Aquí mostramos un diagrama etiquetado del músculo trapecio espinal reflejado. Después de exponer la arteria de aporte, las letras indican regiones como anteriormente. Tenga en cuenta que cada animal tiene una anatomía única.Este ratón en particular se considera bastante difícil para este procedimiento debido a la proximidad de los otros dos vasos. Aquí se muestra un animal más típico. Observe la separación relativamente amplia de la arteria indicada respecto a la vena para ubicada justo encima y la ausencia de un tercer vaso.Aquí observamos un mosaico de microscopía confocal de un músculo trapecio espinal derecho ligado, teñido para alfa-actina de músculo liso. Bajo condiciones isquémicas, ha ocurrido un remodelado en la región indicada aguas abajo del sitio de ligadura. Estos cambios pueden cuantificarse mediante software de análisis de imágenes, que utilizamos aquí para medir la tortuosidad como la relación entre la longitud del trayecto arterial y la distancia al núcleo.Algunos datos de muestra mostrados aquí indican un resultado estadísticamente significativo de mayor tortuosidad vascular en comparación con el control contralateral. También demostramos mediciones funcionales de la reactividad vascular utilizando el software médico MicroVision en un microscopio de campo oscuro fuera de línea. Los diámetros vasculares en video se miden antes y después de la estimulación, y luego se comparan entre sí como un cambio porcentual.Los datos de muestra mostrados aquí indican un resultado estadísticamente significativo para el aumento del diámetro vascular en arterias terminales tras la estimulación. Hola, soy Alexander Ell y soy el estudiante de pregrado en el laboratorio de Pierce Scholer que editó este video. Juntos, acaban de mostrarles cómo crear un modelo de isquemia muscular esquelética en el músculo trapecio espinal simétrico.Luego demostramos un procedimiento funcional de vasodilatación adecuado para medir la reactividad vascular y el control del flujo sanguíneo. Finalmente, mostramos cómo excisar el músculo para prepararlo para la fijación adecuada para tinción inmunoquímica e imagenología. En nombre de mis colaboradores en San Luis Obispo y aquí en Charlottesville, me gustaría agradecerles por ver este video y desearles suerte y éxito en sus esfuerzos de investigación.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

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