Modelo murino Spinotrapezius para evaluar el impacto de la ligadura arteriolar en la función microvascular y Remodelación

La enfermedad vascular periférica afecta aproximadamente al 12 al 14% de la población y es especialmente común entre los consumidores de tabaco y las personas con diabetes, obesidad, hipertensión, estadio avanzado o aterosclerosis. El objetivo de esta cirugía es producir un modelo para la isquemia del músculo esquelético mediante la ligadura de una de las tres arterias alimentadoras a la mitad mimada del músculo espinotrapecio en espejo. Esta animación muestra la ubicación generalizada de estas arterias e indica el sitio de ligadura previsto en respuesta a la isquemia.

El tejido vascular sufrirá cambios característicos de la agenesia arteriológica dependiendo de la cepa del ratón. Esto incluye la formación de colaterales puente o el aumento de la tortuosidad de los buques. También le mostraremos cómo realizar un procedimiento de vasodilatación funcional en el trapecio espinal utilizando microscopía intravital.

Esto implica exponer el músculo cuidadosamente, colocar los electrodos estimulantes con su fuente de energía y controlador, y luego configurar el dispositivo de imagen. Por último, mostraremos cómo extirpar el músculo y describiremos un proceso de fijación adecuado para la tinción inmunoquímica y la obtención de imágenes. Hola, mi nombre es Shane Pierce Kotler y soy profesor asociado en el Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Virginia en Charlottesville.

Hola, soy Kyle Martin. Soy estudiante de posgrado en el laboratorio de Shane y actuaré en el modelo de ligadura de trapecio espinal. Nuestro laboratorio estudia el crecimiento y la remodelación microvascular, particularmente en los entornos de la enfermedad isquémica, como la enfermedad cardíaca, la enfermedad arterial periférica y el accidente cerebrovascular.

Desarrollamos este modelo de ligadura de trapecio espinal en espejo para estudiar cómo la obstrucción localizada del flujo sanguíneo arterial genera adaptaciones estructurales en las redes microvasculares posteriores. Consideramos que este modelo es complementario al modelo de isquemia de las extremidades traseras, bien establecido y ampliamente utilizado, ya que ofrece una visión de toda la red de FFA de la arte, la neurogénesis y la angiogénesis en un músculo muy delgado que no requiere corte histológico para el análisis. Debido a que este músculo es tan delgado y debido a que la ligadura crea una reducción reproducible en el flujo sanguíneo, podemos visualizar los efectos de la ligadura arterial en todo el lecho microvascular y con un nivel de resolución de una sola célula.

Después de que Kyle nos guíe a través del procedimiento paso a paso para realizar el modelo de ligadura de trapecio espinoso, nuestros colaboradores de Cal Poly nos mostrarán cómo usan este modelo para estudiar la vasodilatación funcional. Una vez que veamos eso, lo llevaremos de regreso a la Universidad de Virginia y cosecharemos el trapecio de la columna vertebral, lo que debe hacerse antes de la obtención de imágenes y la tinción. Hola, mi nombre es Trevor Cardinal.

Soy profesor asistente en el Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad Estatal Cal Poly en San Luis Obispo, California, y mi nombre es Josh Cutz. Soy estudiante de maestría en ingeniería biomédica en Cal Poly en San Luis Obispo. El interés principal de nuestro laboratorio de investigación es comprender el impacto de la isquemia crónica tal como ocurre con la enfermedad periférica de AV en las capacidades funcionales de la vasculatura de resistencia.

Entonces, después de que se realice la cirugía de ligadura de la arteria de alimentación del trapecio espinal, Josh demostrará el procedimiento de vasodilatación funcional utilizado en nuestro laboratorio. En nuestro laboratorio, utilizamos el procedimiento de vasodilatación funcional para examinar el efecto de la oclusión arterial sobre la reactividad vascular y los instrumentos de control del flujo sanguíneo. Para prepararse de antemano, incluya una sutura de ubicación de 10 nudos, una sutura de cierre, un portaagujas, tijeras de iris, pinzas estándar, tijeras de resorte y una microsonda doblada.

Después de preparar los instrumentos quirúrgicos anestesiar el ratón, aquí usamos la fórmula de visualización y la dosis. Confirme la anestesia con el dedo del pie, la prueba de reflejo de pellizco, luego aplique IGEL protector con la forma de una navaja de afeitar eléctrica, un gran parche de pelo de la espalda del animal. Aunque la ligadura del trapecio espinal solo requiere que se despeje una pequeña área cerca del omóplato, la recolección de tejido del trapecio espinal que se realizará dentro de unos pocos días requerirá una superficie despejada mucho más grande.

Retira el exceso de pelo y luego aplica la crema depilatoria siguiendo las instrucciones del fabricante. Lava la espalda con una esponja húmeda. A continuación, aplique tres juegos de toallitas Betadine con alcohol alterno que terminen con Betadine odine.

En buenas condiciones de iluminación, el mejor sitio de incisión se puede encontrar mediante la identificación transdérmica de la almohadilla de grasa dorsal. Dado que la arteria alimentadora atraviesa eventualmente el músculo trapecio espinal de manera abrupta, el borde de la almohadilla de grasa mimada cubre la piel en este lugar y trae tijeras de iris directamente desde arriba perpendicular a la dorsal del animal y corta para hacer una incisión lineal de tres a cinco milímetros. Si la iluminación o la pigmentación de la piel no permiten la identificación transdérmica.

Coloque la incisión a cinco milímetros de la prominencia ósea del omóplato, extienda la incisión a través de las capas de la piel y expándala lateralmente según sea necesario para encontrar el trapecio espinal. Diseccionar la fascia suprayacente para acceder al sitio de la ligadura. Si un vaso superficial está dañado y sangra como en este caso, deje que el sangrado se detenga y aplique presión si es necesario, use solución salina para evitar la desecación.

La arteria indicada se encuentra a lo largo de la cara dorsal del trapecio espinal y luego atraviesa el músculo y entra en la almohadilla de grasa ventral. Encuentra el borde lateral del trapecio espinal y refléjalo, elevándolo hasta casi invertirlo. Esto revela su aspecto ventral y el sitio transversal de la arteria disecciona la almohadilla de grasa ventral que oscurece el vaso.

Tenga cuidado con la presión de las pinzas para evitar lesiones por aplastamiento. En este caso, el cirujano indica la ligadura de la arteria trapezoidal espinal. Tenga en cuenta la presencia de pares de venas vasodilatadoras como la adenosina de acción más corta o la papina de acción más prolongada.

En este caso, la arteria se encuentra entre otros dos vasos, como lo indican las flechas. Uno es similar en tamaño a la arteria y se vería que se encuentra más lateralmente si el músculo no se reflejara, mientras que el otro es mucho más grande y se acostaría más inmediatamente. Los dos sitios de ligadura están marcados con ai.

La primera ligadura se coloca en la dirección aguas abajo en relación con la segunda. Esto asegura que el vaso aún esté lleno de sangre y visible durante la colocación de la segunda ligadura. A indica la región que se va a seccionar.

Observe la ubicación B, donde la arteria y su vena emparejada entraron en la almohadilla de grasa ventral delineada por C. Esto nos permite saber que el segundo vaso más pequeño es una vena. También tenga en cuenta el músculo trapecio del arte espinal descrito por D. En el protocolo de texto adjunto se proporcionan algunos consejos para discriminar la arteria de la vena. Pero brevemente, nuestro método preferido es obstruir el flujo sanguíneo mediante la aplicación de presión con una microsonda.

Si el vaso es una arteria, el flujo se obstruirá en la dirección descendente hacia el músculo reflejado que se aplica. La técnica aquí descarta el recipiente más grande. Si es necesario, use la microsonda doblada a 80 grados para separar la arteria de los otros vasos.

Esto se hace perforando a través del tejido conectivo debajo del vaso y haciendo movimientos laterales cortos para expandir un espacio. Hasta que la sonda pueda pasar fácilmente a través de la aguja de sutura, ahora se puede enhebrar más fácilmente debajo de la arteria. En este caso, se cortó una pequeña vena que causó una hemorragia menor.

Este vaso se encuentra lo suficientemente lejos de la zona isquémica como para que el impacto sea mínimo. En el procedimiento, haga un nudo de un solo cirujano y prepare la siguiente sutura. De nuevo, pasando a través del hueco prefabricado y atando el nudo de otro cirujano unos milímetros aguas arriba de la ligadura anterior.

Tenga en cuenta que el músculo se refleja y la dirección del flujo puede ser opuesta a la esperada. Después de haber colocado ambas ligaduras, busque evidencia de una columna de glóbulos rojos obstruida. Si no se ha detenido el flujo, se necesita otra ligadura.

De lo contrario, seccione el vaso entre las ligaduras, anotando si se produce algún sangrado, en este caso la ligadura fue exitosa y no se observa hemorragia arterial. Un método alternativo emplea una sola ligadura y transección en la dirección aguas abajo. Consulte la bibliografía adjunta para saber cuándo se prefiere este método.

Restaurar el músculo a su orientación original, reposicionar el tejido adiposo desplazado y la fascia y cerrar con sutura no reabsorbible adot. Finalmente, coloque al ratón en una jaula de recuperación calentada bajo observación y analgésico para microscopía intravital spinotrapezius. El ratón se anestesia primero con flúor en una cámara de inducción y luego se conecta a un flujo continuo de flúor a través de un cono nasal.

Inserte la sonda de temperatura rectal y ajuste el controlador térmico a 35 grados C, los instrumentos para prepararse de antemano incluyen tijeras de iris, pinzas estándar, tijeras de resorte y un hisopo PBS humedecido. Haga una incisión en la piel en el extremo del trapecio espinal con unas tijeras de iris y unas pinzas de patente estándar. Extienda la incisión craneal hasta la almohadilla de grasa, creando una incisión en herradura y cubra el colgajo de piel con una envoltura de plástico para evitar la desecación roma, diseccione el tejido conectivo subcutáneo con pinzas finas para maximizar la visibilidad.

Coloque los electrodos estimulantes, manteniéndolos lo más juntos posible para minimizar el tamaño del campo de corriente, colóquelos en el extremo del músculo expuesto, justo al lado de la columna vertebral. Anclar con arcilla. Realice una prueba de estimulación para confirmar la colocación del electrodo utilizando un sistema de adquisición de datos de laboratorio de potencia, un estímulo, un aislador y un software de gráficos de laboratorio configurado para ondas cuadradas de 200 microsegundos de duración, dos miliamperios de amplitud y entregado a un hercio.

Cubra el músculo expuesto con una envoltura de plástico nuevamente. Para evitar la desecación, espere 30 minutos por diámetro de recipiente para equilibrar y luego capture su imagen o video. Coloque el microscopio intravital sobre el músculo trapecio espinal para ver la arquitectura de la vasculatura.

Si usa una lente de inmersión, coloque una gota de PBS entre el objetivo y la envoltura de plástico comenzando por encima de la arteria principal, que es el vaso más grande visible. Manipule el escenario en el plano XY para localizar el buque de interés. Estimular el músculo con ondas cuadradas de la duración y amplitud anteriores, pero administradas a ocho hercios y durante 90 segundos inmediatamente después de la estimulación.

Tome una imagen del recipiente y continúe haciéndolo cada minuto hasta que haya vuelto al diámetro de reposo. El análisis de datos se puede realizar en tiempo real con calibradores de video o fuera de línea con software de análisis de imágenes. Repita el procedimiento desde la incisión inicial hasta la toma de imágenes utilizando el músculo contralateral.

Cuando termine. Eutanasia del ratón siguiendo el protocolo estándar A CUC para la recolección de tejido de trapecio espinal. Necesitaremos tijeras de iris, pinzas estándar y tijeras de resorte.

Anestesia al ratón como se ha descrito anteriormente. Comience haciendo una incisión de unos milímetros craneales en el omóplato del ratón. Expanda la incisión lateralmente y luego cubra por ambos lados.

El objetivo es exponer el músculo trapecio espinal, que se extiende desde la T tres hasta la L cuatro después de hacer la incisión. La piel se puede separar de la espalda mediante un tirón suave o un corte cuidadoso del tejido conectivo, manteniéndolo en su lugar, súper fusionado con solución salina para evitar la desecación y ayudar con el manejo del tejido. Use la disección roma para eliminar el tejido adiposo dorsal y exponer el músculo trapecio espinal.

Del mismo modo, extirpar el tejido adiposo ventral. Después de reflejar el músculo, aquí se identifica el trapecio espinal del lado derecho del animal. A continuación, retire la mayor cantidad posible de fascia suprayacente.

Esta parte del procedimiento puede ser tediosa, pero igual de importante para evitar artefactos durante la microscopía. Una vez que se ha extirpado el tejido conectivo, se extirpa el tejido como se muestra cortando primero el borde lateral aproximadamente paralelo al dorso y moviéndolo en una dirección craneal a mimada. A continuación, corte transversalmente a través de la extensión más craneal y, finalmente, a lo largo del borde medial, más cerca de la columna vertebral para recoger el músculo contralateral.

Siga el mismo procedimiento. Primero eliminando el tejido adiposo dorsal, luego el tejido adiposo ventral y, finalmente, la fascia suprayacente durante el corte. Es posible que le resulte más fácil cambiar de instrumento a la mano menos dominante.

El tejido extirpado puede fijarse y lavarse siguiendo el procedimiento descrito aquí después de que el animal haya sido sacrificado. De acuerdo con un protocolo A CUC mejorado. Consulte la bibliografía adjunta para obtener detalles sobre un procedimiento alternativo de fijación de perfusión.

Aquí mostramos un diagrama etiquetado del músculo trapecio espinal reflejado. Después de exponer la arteria de alimentación, las letras indican regiones como antes. Ten en cuenta que cada animal tiene una anatomía única.

Este ratón en particular se considera bastante difícil para este procedimiento debido a la proximidad de los otros dos vasos. Aquí se muestra un animal más típico. Obsérvese la separación relativamente grande de la arteria indicada de la vena para, justo encima de ella, y la ausencia de un tercer vaso.

Aquí vemos un montaje de microscopio confocal de un músculo trapecio espinal del lado derecho ligado que ha sido teñido para obtener alfa actina de músculo liso. En condiciones isquémicas, ha habido remodelación en la región indicada aguas abajo del sitio de ligadura. Estos cambios se pueden cuantificar con un software de análisis de imágenes, que utilizamos aquí para medir la tortuosidad como la longitud de la ruta de la arteria a la distancia del núcleo.

Algunos datos de muestra que se muestran aquí indican un resultado estadísticamente significativo para el aumento de la tortuosidad de los vasos en comparación con el control contralateral. También demostramos mediciones funcionales de la reactividad de los vasos utilizando el software médico MicroVision a VA en un microscopio de campo oscuro fuera de línea. Los diámetros de los vasos de video se miden antes y después de la estimulación y luego se comparan entre sí como un cambio porcentual.

Los datos de muestra que se muestran aquí indican un resultado estadísticamente significativo para el aumento del diámetro de los vasos en las arterias terminales después de la estimulación. Hola, soy Alexander Ell y soy el estudiante del laboratorio de Pierce Scholer que editó este video. Juntos, acabamos de mostrarle cómo crear un modelo para la isquemia del músculo esquelético en el músculo trapecio de espín en espejo.

A continuación, demostramos un procedimiento de vasodilatación funcional adecuado para medir la reactividad vascular y el control del flujo sanguíneo. Por último, mostramos cómo extirpar el músculo para prepararlo para la fijación adecuada para la tinción inmunoquímica y la obtención de imágenes. En nombre de mis colaboradores en San Luis Obispo y aquí en Charlottesville, me gustaría agradecerles por vernos y desearles adiós y buena suerte en sus esfuerzos de investigación.