La Citrobacter rodentium Mouse Modelo: Estudiar Contribuciones patógeno y del huésped a la colitis infecciosa

El objetivo general de este procedimiento es inducir colitis mediante la infección de ratones con el patógeno espejo gramnegativo, roedor citrobacter, lo que permite el estudio de las interacciones entre el patógeno y el huésped en el tracto gastrointestinal. Esto se logra primero inoculando, una cultura de cero redención de la noche a la mañana. En el segundo paso, los ratones se infectan por sonda oral con el inóculo nocturno.

A continuación, en el séptimo día después de la infección, el ciego del colon y el contenido luminal se recogen durante el paso final. Los tejidos se platean, las colonias bacterianas se cuentan y los tejidos se inmunotinción para las proteínas del huésped de interés. En última instancia, la carga de patógenos, la función de barrera, el daño histológico y los cambios en la respuesta del huésped se pueden evaluar a través de la inmunohistoquímica.

Aunque este método ofrece un modelo robusto de colitis infecciosa, que permite el estudio de las interacciones entre el huésped y el patógeno y las respuestas inmunitarias, también se puede adaptar para examinar los efectos de la infección bacteriana en el riesgo de cáncer de colon. Por lo general, en los individuos nuevos en este método, naturalmente lucharían con la infección bacteriana de los ratones, con o con, o calibre. Comience usando un asa de inoculación estéril para rayar la redención de C viable de un stock de glicerol congelado en una galvanoplastia LB.

Después de la incubación durante la noche a 37 grados centígrados, use un circuito de inoculación para transferir las colonias de la placa LB a tres mililitros de caldo lb estéril. A continuación, incube el cultivo ERO Dunum aeróbicamente en un agitador de incubación de sobremesa a 200 RPM durante la noche a 37 grados centígrados. A la mañana siguiente, el caldo de libras inoculado debe aparecer turbio.

Agite suavemente el cultivo para distribuir uniformemente el cultivo de células bacterianas y luego cargue una jeringa de un mililitro con caldo y conéctela a una aguja de sonda gástrica. Seleccione un ratón para la sonda nasogástrica agarrando firmemente la piel suelta sobre su cuello y espalda con fem y dedos. A continuación, tire hacia atrás de la cabeza del animal con el dedo índice para inmovilizar la cabeza del animal y enderezar el esófago para la inserción.

Manteniendo el ratón en posición vertical, dirija la punta del bulbo de la aguja de sonda gástrica a lo largo del costado de la boca del animal y sobre su lengua. Pase suavemente la aguja a lo largo del paladar del animal y avance la aguja por el esófago. Finalmente, use la jeringa para inyectar lentamente 100 microlitros del inóculo bacteriano y luego retire suavemente la aguja de sonda nasogástrica.

Controle la frecuencia respiratoria y el comportamiento del ratón después de devolverlo a su jaula el día del ensayo, frote el pescuezo del ratón como se acaba de demostrar y luego administre al animal 150 microlitros de dextrina fitzy recién preparada. Retirar la comida de la jaula en este momento, cuatro horas después de la sonda nasogástrica, y luego la sedación del animal. Utilice la punción cardíaca para recolectar la mayor cantidad de sangre posible del animal anestesiado.

Agregue la sangre a una concentración final de citrato ácido dextrosa al 3% en un tubo de microcentrífuga para disuadir la coagulación. A continuación, centrifuga las muestras de sangre durante 12 minutos a 1000 grados de queso y cuatro grados centígrados. A continuación, recoja el suero y dúcelo de uno a 10 y de uno a 100 en PBS a 100 microlitros de cada muestra.

En estos dos diluciones a una placa de 96 pocillos por duplicado. Para preparar la curva estándar, diluya muestras de 100 microlitros de los 80 miligramos por mililitro originales. Fitz Dextrin solía perforar a los ratones en PBS en tubos oscuros de microcentrífuga.

A continuación, añada las muestras estándar a una placa de 96 pocillos por triplicado. A continuación, utilice un fluorímetro para cuantificar la fluorescencia de cada muestra y para determinar la concentración de dextrina FXI mediante técnica aséptica, comience este paso añadiendo un mililitro de PBS estéril y una perla metálica de autoclave para redondear el fondo a tubos de centrífuga de dos mililitros. A continuación, pesa cada tubo.

A continuación, después de quitar el seum y los dos puntos del ratón, separe el seum de los dos puntos y córtelos longitudinalmente. Recoja el contenido luminal con pinzas y agregue el contenido a un tubo de PBS. Lave la secuela y los tejidos colónicos con PBS estéril antes de colocarlos en tubos separados.

Ahora pesa los tubos de tejido y homogeneiza las muestras con un batidor de cuentas durante seis minutos. A 30 hercios, agregue 180 microlitros de PBS estéril por pocillo a una placa de 96 pocillos. A continuación, añada 20 microlitros de cada muestra homogeneizada al primer pocillo de cada fila y mezcle bien.

Diluir en serie las muestras añadiendo 20 microlitros de cada pocillo anterior para obtener una dilución de 10 a menos uno en el primer pocillo hasta 10 a menos seis. A continuación, coloque 10 microlitros de cada dilución de cada muestra por triplicado en una placa LB de fondo cuadrado con una rejilla después de la incubación nocturna a 37 grados centígrados. Cuente las unidades formadoras de colonias en un plato.

Promedie los triplicados de cada muestra y, a continuación, registre la dilución a la que se contó cada muestra. Multiplique el promedio de UFC por 50 y por el factor de dilución con el que se contó la muestra, lo que da como resultado UFC por mililitro. Finalmente, dividir por el peso del tejido para determinar las UFC por gramo después de la noche, la formalización y fijación del colon de 0,5 centímetros previamente guardado y la sección de seguridad.

A la mañana siguiente, lavar los tejidos con etanol al 70% y colocarlos en un casete para enviarlos a un centro de histología para que los incorporen en parafina y los tiñan con hematina y eosina para separar los tejidos. Coloque los portaobjetos en un frasco de tinción coplan en un baño de agua a 65 grados centígrados durante 10 minutos. Ahora, coloque los portaobjetos en xileno durante cuatro lavados de dos minutos.

Cada uno rehidrata los portaobjetos con dos lavados de cinco minutos y etanol al 100%, seguidos de un lavado de cinco minutos en cada uno de los siguientes: 95% de etanol, 75% de etanol y agua destilada. Coloque los portaobjetos lavados en un frasco coplan con tampón de citrato de sodio precalentado, y luego coloque el frasco en una vaporera durante 30 minutos después de dejar reposar el frasco a temperatura ambiente durante otros 30 minutos, lave los portaobjetos tres veces con PBS Zied durante cinco minutos.

Cuando los portaobjetos estén secos, marque el área alrededor del pañuelo con un bolígrafo para papanicolaou. A continuación, bloquee el tejido con un tampón de bloqueo en una cámara de humedad inmunotinción a temperatura ambiente. Después de una hora, vierta el tampón de bloqueo e incube los tejidos en 50 a 100 microlitros de anticuerpo primario a cuatro grados centígrados durante la noche.

Después del período de incubación, lave los tejidos tres veces con PBS Azi durante cinco minutos. Luego incube los portaobjetos en 50 a 100 microlitros del anticuerpo secundario en la oscuridad a temperatura ambiente después de una hora, lave los portaobjetos tres veces con agua destilada durante cinco minutos. Finalmente, deshidratar los tejidos, cubrir los portaobjetos con dpi, medio de montaje de oro prolongado, y luego aplicar un cubreobjetos visto los portaobjetos bajo un microscopio de fluorescencia.

Esta primera figura muestra la dextrina Fitz medida en el suero de ratones C 57 black six, así como en ratones knock-like receptor a ratones knockout, que previamente se ha encontrado que exhiben una integridad de la barrera epitelial deteriorada durante la infección en presencia de una barrera epitelial intestinal intacta. La dextrina ZI es poco permeable a través de esta capa. Por lo tanto, el aumento de los niveles de dextrina Fitz en el suero sugiere un deterioro de la integridad de la barrera epitelial intestinal durante la infección, lo que permite que esta molécula se filtre como control de los niveles séricos en ratones no infectados.

También se presentan sonda nasogástrica con dextrina de Fitz. El asentimiento es un patógeno luminal que puede adherirse íntimamente a las células epiteliales intestinales. Las cargas bacterianas en el contenido luminal, la secuela y los tejidos colónicos pueden estar en el día siete. Post-infección.

Se ha encontrado que las cargas bacterianas en el colon alcanzan un máximo de alrededor de 10 a la novena UFC por gramo. La mayor parte de la patología observada durante la infección por C. DUM en ratones C 57 PL seis ocurre en los dos centímetros distales del colon macroscópicamente al séptimo día después de la infección. Un engrosamiento de la mucosa colónica, así como un acortamiento y longitud del colon se observa normalmente durante la infección.

C 57 PL seis ratones sufren solo una inflamación moderada y una patología caracterizada histológicamente por la infiltración de células inmunitarias, el alargamiento de las criptas colónicas y el agotamiento de las células de coit. Para caracterizar aún más las respuestas del huésped durante la infección con redención cero, la tinción inmunofluorescente se puede utilizar para examinar los cambios en las proteínas de interés, como los marcadores de proliferación, o para examinar aspectos de la respuesta bacteriana, como su localización dentro del tejido infectado. En esta figura se ilustra un ejemplo de esta técnica de tinción, examinando la proteína del huésped KI 67, un marcador de proliferación celular que aparece en rojo y el desgarro de la proteína cero, que aparece en verde para examinar la localización bacteriana en el día 12 después de la infección.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en minutos si se hace correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante que la técnica de medición se realice correctamente para garantizar que los ratones estén infectados y que la salud del animal se controle durante todo el curso de la infección. Durante los últimos 10 a 15 años, el modelo de roedor citrobacter se ha convertido en el estándar de oro para el estudio de la adhesión a patógenos bacterianos como el epec.

Además, se ha convertido en un modelo bien reconocido para el estudio de las respuestas inmunitarias de la mucosa a las bacterias, como el desarrollo de respuestas TH 17 dentro del intestino.