Name: Generación de una nueva vacuna de células dendríticas usando melanoma y células madre escamosas del cáncer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Aprende a generar una vacuna de células dendríticas basada en células madre cancerosas para inmunoterapia antitumoral. Este método demuestra mayor eficacia inmunitaria que las vacunas tradicionales.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Investigación Dotado Will y Jeanne Caldwell del Centro Oncológico Integral de la Universidad de Michigan y en parte por la subvención CA82529 de los NIH y la Fundación Gillson Longenbaugh.

1. Tinción de ALDEFLUOR
<ol><li>Preparación de muestras celulares: Prepare la suspensión unicelular de células tumorales, ya sea de células tumorales cultivadas o de muestras de tumor recién recolectadas. Cuente las células y ajuste la suspensión celular a una concentración de 1 x 106 células/ml en el tampón de ensayo ALDEFLUOR.</li>
	<li>Etiquete cuatro tubos de ensayo de poliestireno de 12 mm x 75 mm como tubos de control de la siguiente manera: #1: No manchados, #2: ALDEFLUOR, #3: ALDEFLUOR más DEAB, y #4: 7AAD.</li>
	<li>Para estos tubos de control, coloque la suspensión celular de 1 ml en #1 y #4, pero 2 ml en el tubo #2. Agregue 5 μl de DEAB (inhibidor de ALDH) en el tubo #3 y manténgalo en el hielo. A continuación, añadir 10 μl de sustrato ALDEFLUOR activado al tubo #2, mezclar y transferir inmediatamente 1 ml de la mezcla al tubo #3.</li>
	<li>Al mismo tiempo, añadir 2 μl de sustrato ALDEFLUOR activado por millón de células al resto de las células (tubos de muestra) también a 1 x 106 células/ml en el tampón de ensayo ALDEFLUOR.</li>
	<li>Incubar tanto los 4 tubos de control como los tubos de muestra durante 30 min en un baño de agua de 37 °C.</li>
	<li>Después de la incubación, agregue 5 μl 7AAD en el tubo de control #4, y 1 μl 7AAD 1 x 106 células al tubo de muestra. Incubar 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Centrifugar todos los tubos durante 5 min a 250 x g y retirar el sobrenadante.</li>
	<li>Células resuspend en el buffer del ensayo de ALDEFLUOR.</li>
	<li>Realice la clasificación citología-basada del flujo.</li>
	<li>Establezca las puertas de clasificación utilizando células teñidas de ALDEFLUOR tratadas con DEAB como control negativo y las células teñidas de yoduro de propidio (PI) 7AAD- para el control de viabilidad. Sobre la base de estos controles, se estableció una puerta para distinguir las células ALDEFLUOR+/ALDHde alto,D5 y SCC7. Estas puertas se utilizarán para clasificar todas las células de muestra preparadas anteriormente para las células ALDEFLUOR+/ALDHaltas D5 y SCC7.</li>
</ol>2. Preparación de la vacuna de células madre de células madre de células cancerosas de células dendríticas de pulso (CSC-TPDC)
<ol><li>Eutanasia de ratones (singenéticos B6 y C3H, respectivamente) usando CO2 y aislar los huesos del fémur y la tibia.</li>
	<li>Ponga los huesos en etanol al 75% durante 1 min a temperatura ambiente. Luego lave los huesos usando HBSS.</li>
	<li>Corte la cabeza de los huesos y use una aguja de 21 G y una jeringa de 10 ml para empujar las células en un plato.</li>
	<li>Aspirar y soplar las células usando la jeringa para hacer la suspensión unicelular.</li>
	<li>Después de la centrifugación en 1.500 rpm durante 5 min, deseche el sobrenadante. A continuación, añadir 5 ml de tampón de lisis RBC a la lisis del RBC durante 1 min en un baño de agua de 37 °C.</li>
	<li>Cuente el número de células y ajuste la suspensión celular a una concentración de 1 millón de células/ml en medio completo (CM) que contenga 10 ng/ml GM-CSF y 10 ng/ml IL-4.</li>
	<li>Cultíe las células y compense el cm más IL-4 y GM-CSF 3 días más adelante.</li>
	<li>Al5º día, coseche las células dendríticas inmaduras (DC) y prepare el medio de aislamiento de CC que contiene 4,2 ml de solución C más 1 ml de medio de gradiente de densidad OptiPrep.</li>
	<li>Suspenda los pellets celulares en 5 ml CM. Añadir la suspensión celular en el medio de aislamiento lentamente. Centrífuga a 2.000 rpm a temperatura ambiente.</li>
	<li>Recoja los controladores de dominio entre el CM y el medio de aislamiento. Cuente el número de células y ajuste la suspensión celular a una concentración de 1 millón de células/ml en un medio de cultivo que contenga 10 ng/ml GM-CSF y 10 ng/ml IL-4.</li>
	<li>Prepare los lisatos tumorales suspendiendo las células D5 o SCC7altas o no clasificadas de ALDH en medio de cultivo y sujetas a exposiciones rápidas de congelación-descongelación cuatro veces seguidas de espín a ∼100 x g durante 5 min para recolectar la porción de membrana de los lisatos.</li>
	<li>Para preparar CSC-TPDC, pulse ADC con el lysate de célulasaltas autólogas de ALDH. Para preparar H-TPDC, pulse los CONTROLADORES DE DOMINIO con el lisato heterogéneo no clasificado de células tumorales. La proporción de DC a la célula tumorallysate es la misma.</li>
</ol>3. Vacunación y evaluación de la eficacia
<ol><li>Vacunar ratones B6 normales respectivamente con 2.500 células tumorales D5 CSC-TPDC o D5 H-TPDC por vía subcutánea(s.c.). Vacunar animales normales de C3H s.c. con 5.000 células tumorales SCC7 CSC-TPDC o SCC7 H-TPDC, respectivamente.</li>
	<li>Después de la vacunación, desafíe a los ratones B6 con las células heterogéneas del tumor D5 i.v. Euthanize los ratones usando elCO2 20 días más adelante. Cosechar los pulmones y enumerar las metástasis pulmonares.</li>
	<li>En el modelo SCC7, desafíe a los ratones C3H con células tumorales SCC7 s.c sin clasificar en el lado opuesto de la vacuna DC. Controle el tamaño del tumor.</li>
	<li>Al final de los experimentos eutanasia los ratones B6 y C3H utilizando CO2. En el día 34 después de la primera vacuna, eutanasia ratones con CO2,y al mismo tiempo recoger los bazos de cada grupo con un procedimiento aséptico.</li>
	<li>Active las células T y/o B del bazo con los mAb inmovilizados anti-CD3 más los mAbs anti-CD28 en el cm que contiene hrIL-2 o los LPS más las ascitis anti-CD40 (FGK45) del mAb.</li>
	<li>Después de la activación, recoger sobrenadantes y utilizar para el ensayo ELISA.</li>
	<li>Para el ensayo ELISA, recubre placas con anticuerpos para IFNγ, GM-CSF e IgG a 4 °C O/N.</li>
	<li>Después de la aplicación del tampón de bloqueo, agregue muestras y estándares e incube a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave la placa y agregue anticuerpos de detección de HRP y sustrato de TMB para la incubación.</li>
	<li>Mida la absorbancia en un lector de placas ELISA a 450 nm dentro de los 30 minutos después de detener la reacción.</li>
</ol>

<ol><li>Shafee, N., Smith, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+contribute+to+cisplatin+resistance+in+Brca1%2Fp53-mediated+mouse+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells contribute to cisplatin resistance in Brca1/p53-mediated mouse mammary tumors.</a> Cancer Res. 68, 3243-3250 (2008).</li>
<li>Nandi, S., Ulasov, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+radiation+enhances+survivin-mediated+virotherapy+against+malignant+glioma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Low-dose radiation enhances survivin-mediated virotherapy against malignant glioma stem cells.</a> Cancer Res. 68, 5778-5784 (2008).</li>
<li>Dallas, N. A., Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoresistant+colorectal+cancer+cells%2C+the+cancer+stem+cell+phenotype%2C+and+increased+sensitivity+to+insulin-like+growth+factor-I+receptor+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition.</a> Cancer Res. 69, 1951-1957 (2009).</li>
<li>Yamauchi, K., Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cancer+metastasis+by+cyclophosphamide+pretreatment+of+host+mice%3A+an+opposite+effect+of+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of cancer metastasis by cyclophosphamide pretreatment of host mice: an opposite effect of chemotherapy.</a> Cancer Res. 68, 516-520 (2008).</li>
<li>Chang, A. E., Redman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+trial+of+tumor+lysate-pulsed+dendritic+cells+in+the+treatment+of+advanced+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A phase I trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer.</a> Clin. Cancer Res. 8, 1021-1032 (2002).</li>
<li>Ito, F., Li, Q., Shreiner, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-CD137+monoclonal+antibody+administration+augments+the+antitumor+efficacy+of+dendritic+cell-based+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Anti-CD137 monoclonal antibody administration augments the antitumor efficacy of dendritic cell-based vaccines.</a> Cancer Res. 64, 8411-8419 (2004).</li>
<li>Kirk, C. J., Hartigan-O'Connor, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-dependent+antitumor+immunity+mediated+by+secondary+lymphoid+tissue+chemokine%3A+augmentation+of+dendritic+cell-based+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">T cell-dependent antitumor immunity mediated by secondary lymphoid tissue chemokine: augmentation of dendritic cell-based immunotherapy.</a> Cancer Res. 61, 2062-2070 (2001).</li>
<li>Ning, N., Pan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cell+vaccination+confers+significant+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cell vaccination confers significant antitumor immunity.</a> Cancer Res. 72, 1853-1864 (2012).</li>
<li>Ginestier, C., Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR1+blockade+selectively+targets+human+breast+cancer+stem+cells+in+vitro+and+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">CXCR1 blockade selectively targets human breast cancer stem cells in vitro and in xenografts.</a> J. Clin. Invest. 120, 485-497 (2010).</li>
<li>Carpentino, J. E., Hynes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase-expressing+colon+stem+cells+contribute+to+tumorigenesis+in+the+transition+from+colitis+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase-expressing colon stem cells contribute to tumorigenesis in the transition from colitis to cancer.</a> Cancer Res. 69, 8208-8215 (2009).</li>
<li>Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+cell+lines+contain+functional+cancer+stem+cells+with+metastatic+capacity+and+a+distinct+molecular+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature.</a> Cancer Res. 69, 1302-1313 (2009).</li>
</ol>

STEMCELL Technologies ha soportado las tarifas de publicación de Acceso Abierto.

Los huéspedes immunocompromised, tales como ratones de SCID, imposibilitar evaluaciones inmunológicas de CSCs debido a la carencia de la inmunidad adaptante dentro de los anfitriones. En este estudio, evaluamos el immunogenicity de CSCs en los anfitriones inmunocompetentes, que podrían mímico más de cerca ajustes pacientes. Los CSCs enriquecidos son inmunogénicos y podrían inducir una inmunidad protectora tumoral más efectiva cuando sus lisiados se cargan a los DCs como una vacuna en comparación con los CDC pulsados por lisiado de células tumorales no seleccionadas.  Mecánicamente, la protección fue conferida por la inducción selectiva de anticuerpos CSC-reactivos y de células T8 así como la producción de cytokine del tipo 1, e.g. IFNγ y GM-CSF.
La mayoría de las inmunoterapias actuales, incluidas las vacunas dendríticas basadas en células y la transferencia adoptiva de células T, están diseñadas para atacar antígenos diferenciados por tumores. CSCs, que puede no expresar estos antígenos distinguidos puede por lo tanto escapar de estas blancos inmunológicas. En cambio, la vacuna del CSC diseñada para apuntar específicamente a las células madres del cáncer puede destruir esta población especial de las células cancerosas, y mejorar así la eficacia terapéutica de la vacuna previniendo recaída y la metástasis del tumor.
En células cultivadas del tumor y tumores recientemente cosechados, identificamos a población CSC-enriquecida por el flujo cytometry basado en alta actividad de la deshidrogenasa del aldehído. Tales célulasaltas de ALDH podrían ser aisladas por la clasificación de flujo para ser utilizadas como una fuente de antígeno para pulsar DC para generar CSC-TPDC. Comparación utilizando célulasaltas de ALDH aisladas de células tumorales cultivadas vs de tumores recién cosechados no demostró ninguna diferencia significativa en el término de la inducción de la inmunidad anti-CSC8. Estos resultados revelaron el potencial para utilizar CSCs aislado de las células cultivadas del tumor o de los tumores recientemente cosechados para el uso clínico.
Para ser clínicamente relevante, una vacuna necesita ser examinada en un entorno terapéutico. Estos experimentos se están realizando ahora en nuestro laboratorio.

Las células madre cancerosas son relativamente resistentes a la quimioterapia y radioterapia convencionales1,2. Por otro lado, esta población de células podría ser la responsable de la recaída y progresión de los cánceres después de las terapias tradicionales contra el cáncer1-4. Debido a la falta de expresión de antígenos tumorales diferenciados en las células madre cancerosas, las células madre cancerosas pueden escapar de las intervenciones inmunológicas actuales de terapia para el cáncer, que están diseñadas principalmente para atacar los antígenos en las células tumorales diferenciadas. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas estrategias dirigidas específicamente y destruyendo las células madre cancerosas puede tener promesas para aumentar la eficacia terapéutica del tratamiento actual del cáncer. Con este fin, se aislaron células madre cancerosas (CSC)-poblaciones enriquecidas a partir de dos tumores animales (melanoma D5 y cáncer de células escamosas SCC7), y los utilizamos como fuente de antígeno para pulsar las células presentadoras de antígeno (células dendríticas, DC) para preparar la vacuna CSC-TPDC. A continuación, se evaluó la inmunidad antitumoral inducida por la vacuna CSC-TPDC en los huéspedes inmunocompetentes singenéticos, ratones B6 y ratones C3H, respectivamente. La eficacia antitumoral inducida por CSC-TPDC se comparó con la vacuna tradicional de DC pulsada con linsato de células tumorales heterogéneas no clasificadas (H-TPDC), que ha sido utilizada previamente por nuestro grupo5,6,así como por otros investigadores7 tanto en estudios preclínicos como en ensayos clínicos.

<table><tbody><tr><td>ALDHEFLOUR KIT</td><td>Stemcell Technologies</td><td>1700</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL-4</td><td>Pepro Tech</td><td>214-14</td><td></td></tr><tr><td>Murine GM-CSF</td><td>Pepro Tech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>Ratón GM-CSF ELISA KIT</td><td>BD Biosciences</td><td>555167</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Medio de gradiente de densidad</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>BD OptEIA TMB Reactivo Sustrato Conjunto</td> de equipos de <td>555214</td><td></td><td>BD Biosciences</td></tr><tr><td>BD</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Aria Clasificador de células</td><td>BD Biosciences</td><td>336834</td><td></td></tr><tr><td>Kcjunior</td><td>Bio-Tek Instruments</td><td>176058</td><td></td></tr></tbody></table>

generación de una nueva vacuna de células dendríticas usando melanoma y células madre escamosas del cáncer

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Identificamos la célula madre del cáncer (CSC) - poblaciones enriquecidas del melanoma murine D5 syngeneic a los ratones C57BL/6 y el cáncer squamous SCC7 syngeneic a los ratones de C3H usando ALDEFLUOR/ALDH como marcador, y probamos su inmunogenicidad usando el lysate de la célula como fuente de antígenos a las células dendríticas del pulso (DCs). Los DCs pulsados conlos altos lysates del CSC de ALDH indujeron inmunidad antitumores protectora perceptiblemente más alta que los DCs pulsados con los lysates de los lysates enteros unsorted de la célula del tumor en ambos modelos y en un ajuste de la metástasis del pulmón y un s.c. Ajuste del crecimiento del tumor, respectivamente. Este fenómeno era debido a las respuestas anti-CSC vacuna-inducidas y celulares del anti-CSC del CSC. En particular, los esplenocitos aislados del huésped sometido a la vacuna CSC-DC produjeron una cantidad significativamente mayor de IFNγ y GM-CSF que los esplenocitos aislados del huésped sometidos a la vacuna de lysate de células tumorales no clasificadas de CC pulsada. Estos resultados apoyan los esfuerzos para desarrollar una vacuna terapéutica CSC-basada autóloga para el uso clínico en un ajuste ayudante.

ALDEFLUOR/ALDH se ha utilizado como un solo marcador para aislar células madre en múltiples neoplasias malignas8-11. Identificamos poblaciones célula-enriquecidas madre del cáncer en dos modelos D5 y SCC7 del tumor usando ALDEFLUOR como marcador. Detectamos las células de ALDEFLUOR+ en el melanoma murine B16-D5 y el cáncer de célula squamous SCC7. Encontramos que las células ALDEFLUOR+ contribuyen aproximadamente 0,5% y 5,2% en líneas celulares tumorales D5 y SCC7 cultivadas, respectivamente (Figura 1). Las células tumorales recién cosechadas de tumores establecidos se han analizado para confirmar la existencia de células ALDEFLUOR+. Como también se muestra en la Figura 1,hubo 2,5% y 4,2% de las células ALDEFLUOR+ de tumores D5 y SCC7 establecidos in vivo, respectivamente. La tumorigenicidad y la capacidad de auto-renovación de estasaltas poblaciones clasificadas de D5 y SCC7 ALDEFLUOR+/ALDH fueron evaluadas en el huésped inmunocompetente singeneico, los ratones C57BL/6 y C3H, respectivamente8.
Se ha utilizado el lisato heterogéneo de células tumorales no clasificadas para pulsos de CDs (H-TPDC) tanto en estudios con animales como en ensayos clínicos5,6. Para examinar la inmunogenicidad de las CSCs, se aisló ALDHalto CSC y pulsado DC con el lisiado de las CSCs a CSC-TPDC generado(Figura 2)y se utilizó H-TPDC como un control convencional de la vacuna contra el cáncer para probar si CSC-TPDC tiene algún efecto beneficioso en la prevención del crecimiento tumoral.
Evaluamos la inmunogenicidad de CSCs examinando la inmunidad antitumores protectora inducida por CSC-TPDC. En el modelo D5, los ratones inmunocompetentes ingenuos fueron vacunados s.c con CSC-TPDC o H-TPDC (en el mismo lisato: cociente de LA C.C.). Los grupos control recibieron solución salina (PBS). Una semana después de la vacuna pasada, desafiaron a los ratones con las células sin clasificar del tumor D5 intravenoso (i.v.),y los pulmones fueron cosechados 3 semanas más adelante para enumerar metástasis del pulmón. Como se muestra en la Tabla 1,en comparación con el grupo PBS, los ratones tratados con el H-TPDC desarrollaron menos metástasis pulmonares. Es importante destacar que los ratones tratados con CSC-TPDC tenían significativamente menos metástasis pulmonares que el grupo de vacunas H-TPDC en ambos experimentos realizados. En el modelo SCC7, los animales normales de C3H fueron vacunados s.c con SCC7 CSC-TPDC o H-TPDC respectivamente en el flanco derecho, seguido por desafiando con las células sin clasificar s.c del tumor SCC7 en el flanco izquierdo. Comparado con el grupo de PBS, H-TPDC indujo inmunidad antitumores modesta contra crecimiento del tumor. Sin embargo, hubo una inhibición significativa del crecimiento tumoral en ratones que fueron tratados con CSC-TPDC en comparación con el grupo control y el grupo H-TPDC (p<0,05, Figura 3). Estos resultados indican que CSCs se podría utilizar como fuente más eficaz del antígeno para cargar DCs que las células sin clasificar tradicionales del tumor en la inducción de inmunidad protectora contra el desafío de las células del tumor.
Para entender más lejos los mecanismos que son la base de la inmunidad antitumores protectora CSC-inducida observada, cosechamos los bazos de los animales sujetados a las vacunas de la C.C. en el final de los experimentos. Las células del bazo entonces fueron activadas por anti-CD3/CD28/IL-2 o anti-CD3/CD28/IL-2 + LPS/anti-CD40. A continuación se recogieron los sobrenadantes de cultivo para detectar la expresión de citoquinas y anticuerpos.  Hubo producciones significativamente mayores de IFNγ y GM-CSF por parte de las células del bazo de los animales vacunados con D5 CSC-TPDC o SCC7 CSC-TPDC(Figura 4). Además, había perceptiblemente (p<0,05) una producción más alta de IgG por las células activadas LPS/anti-CD40 del bazo recogidas de los animales vacunados con D5 CSC-TPDC o SCC7 CSC-TPDC comparado con D5 H-TPDC o SCC7 H-TPDC. Estos anticuerpos fueron encontrados para atar a D5 y a SCC7 CSCs respectivamente, y tal atascamiento podría dar lugar a la lisis del CSC en presencia del complemento8.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1.jpg"> Figura 1. Lasaltas poblaciones de ALDHFLUOR+/ALDH fueron detectadas en tumores murine frescos cultivados así como nuevamente cosechados del melanoma D5 y de la célula squamous SCC7. Las células del tumor tratadas con 50 mmol/L DEAB, un inhibidor específico de ALDH, fueron utilizadas como el control negativo.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> 
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2.jpg"> Figura 2. Generación de vacunas de células madre cancerosas basadas en células dendríticas. Para la preparación de CSC-TPDC y de H-TPDC, las células dendríticas médula-derivadas fueron pulsadas con los lysatesaltos o unsorted de la célula del tumor de ALDH, respectivamente.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> 
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3.jpg"> Figura 3. La vacuna de DC pulsada con lysate CSC (CSC-TPDC) podría inducir una inmunidad antitumoral protectora más efectiva en el s.c. Modelo tumoral SCC7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> 

<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4.jpg"> Figura 4. Respuestas celulares sistémicas más potentes en el huésped inmunocompetente vacunado con CSC-TPDC.  Los esplenocitos fueron cosechados de los animales sometidos a la vacunación H-TPDC o CSC-TPDC, y se activaron según lo indicado. Los sobrenadantes de la cultura entonces fueron recogidos para la detección del cytokine usando ELISA.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a>

Evaluada en huéspedes inmunocompetentes singenéticos, la vacuna de células dendríticas (DC) basada en células madre cancerosas (CSC) demostró una inmunidad antitumoral significativamente mayor que las vacunas tradicionales de DC pulsadas con células tumorales a granel heterogéneas.

Generación de una nueva vacuna de células dendríticas usando melanoma y células madre escamosas del cáncer

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la inmunidad antitumoral de una vacuna basada en células dendríticas (DC) derivadas de células madre cancerosas o CSC en un huésped inmunocompetente. Esto se logra primero aislado CSCs ALDH positivas de alta actividad de aldehído deshidrogenasa o A LDH a partir de células tumorales heterogéneas. En el segundo paso, se aíslan las DC derivadas de CSC y luego se estimulan con lisado para la vacuna.A continuación, se administra el lisado de CSC que activa la DC o la vacuna DC TP a huéspedes inmunocompetentes normales y singénicos. Luego, en la etapa final, se evalúa la eficacia protectora antitumoral de la vacuna C-S-C-T-P-D-C. Finalmente, se puede realizar un ELI SA para evaluar la inmunidad antilisado de CSC inducida por la vacuna C-S-C-T-P-D-C mediante linfocitos T y anticuerpos del huésped.Este proyecto reúne dos de las áreas más destacadas de la investigación del cáncer: la de las células madre cancerosas y la de la inmunoterapia tumoral. Nuestro laboratorio fue uno de los primeros en descubrir células madre cancerosas en tumores sólidos. Estas son las semillas del cáncer que impulsan su crecimiento y también la metástasis.Lo que verá hoy es un nuevo enfoque que utiliza inmunoterapia para atacar específicamente a estas células madre del cáncer. Utilizamos un marcador particular llamado aldehído deshidrogenasa, que puede detectarse mediante el ensayo Alde fluoro. Verá a los doctores Lin Liu y Huon Tau trabajando junto con el Dr. Chow Lee.Esperamos que al dirigirnos a estas células madre cancerosas, podamos mejorar el resultado para los pacientes con muchos tipos de cáncer. Comience suspendiendo las células tumorales de interés en tampón de ensayo alor a una concentración de un por diez elevado a seis células por mililitro. Luego transfiera todo excepto tres mililitros de las células tumorales a cada uno de los tubos de muestra y etiquete cuatro tubos de ensayo de control de poliestireno de 12 por 75 milímetros como sigue: sin teñir alor, ALOR más DEAB y siete A A D. Dispense un mililitro de la suspensión celular en los tubos sin teñir y siete A A D, y dos mililitros en el tubo alde floor.Luego, agregue cinco microlitros de DEAB al tubo de ALOR más DEAB. Coloque los tubos en hielo y luego mezcle 10 microlitros de sustrato alor activado en el tubo de alor. Transfiera inmediatamente un mililitro de la solución de sustrato al tubo de ALOR más DEAB, y luego agregue dos microlitros de sustrato alor activado por cada millón de células a cada uno de los tubos de muestra.Incube todos los tubos en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 30 minutos, y luego agregue cinco microlitros de siete A a D al tubo de siete A a D y un microlitro de siete A a D por cada millón de células a cada tubo de muestra. Mantenga estos tubos a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Centrifugue todos los tubos durante cinco minutos a 250 veces G a temperatura ambiente y reconstituya los sedimentos en tampón de ensayo Alde Fluor para clasificación de células activada por fluorescencia.Para establecer las compuertas de clasificación, utilice las células alde Fluor más DEAB como control negativo y las células marcadas con siete A a D como control de viabilidad. Con base en estos controles, establezca una compuerta para distinguir las células positivas para alor A LDH, D cinco alto y SCC siete. Luego utilice esto para clasificar las células de la muestra en poblaciones positivas para alor A LDH, D cinco alto y SCC siete.Para generar las células dendríticas, primero aísle los huesos del fémur y la tibia de un ratón C57 black six y de un ratón C3H. Esterilice los huesos en etanol al 75 % durante un minuto a temperatura ambiente y luego lávelos en HBSS. A continuación, corte los extremos de los huesos y utilice una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja de calibre 21 para lavar la médula ósea hacia un plato de Petri, aspire y desprenda las células varias veces para crear una suspensión de células individuales y luego centrifugue las células.Incubar el precipitado en cinco mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos durante un minuto en un baño de agua a 37 grados Celsius. Después de contar las células, ajustar el volumen a uno por 10 a la seis células por mililitro en medio de cultivo suplementado con G-M-C-S-F e IL cuatro. A continuación, cultivar las células a 37 grados Celsius y 5%CO2, renovando el medio y las citocinas después de tres días.El día cinco, recolecte las células dendríticas inmaduras. Después de centrifugar las células, resuspenda los pellets en cinco mililitros de medio de cultivo y luego superponga lentamente la suspensión celular sobre medio de aislamiento recién preparado. Tras centrifugar las células nuevamente, recoja las células dendríticas ubicadas entre las capas de medio de cultivo y medio de aislamiento.Luego, tras contar las células, ajuste el volumen a una concentración de un por diez a la seis células por mililitro en medio de cultivo, suplementado con G-M-C-S-F e IL-4. Ahora, cree los lisados tumorales sometiendo las células ordenadas a cuatro ciclos de congelación y descongelación rápida, seguidos de centrifugación para recoger la fracción de membrana de los lisados. A continuación, pulse las DC con el lisado proveniente de las células autólogas A LDH alta ordenadas. Para preparar las CSC TPC.Para preparar el pulso H-T-P-D-C, vacunar subcutáneamente a los animales receptores experimentales con cdc cargadas con lisado de células tumorales heterogéneas no clasificadas, inyectando una vez 1 × 10⁶ células pulsadas, suspendidas en 100 µL de PBS, en el flanco izquierdo de cada ratón. Tras la vacunación, administrar intravenosamente 1 × 10⁵ células tumorales D5 heterogéneas en 100 µL de PBS para desafiar a los ratones receptores C57BL/6. Para el modelo SCC7, desafiar subcutáneamente a los ratones receptores C3H con 1 × 10⁶ células tumorales SCC7 no clasificadas en 100 µL de PBS en el lado opuesto a la vacuna de cdc.Crear una suspensión de células individuales a partir de los bazo de los ratones receptores C3H. Luego activar las células T y B esplénicas con anticuerpos monoclonales inmovilizados anti-CD3 y anti-CD28 en medio de cultivo suplementado con el estímulo adecuado. Tras cuatro días, recoger los sobrenadantes y recubrir placas de ELISA con anticuerpos contra interferón gamma, GM-CSF o IgG a cuatro grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, bloquear la unión no específica, añadir los estándares y los sobrenadantes recién recolectados, e incubar las placas a temperatura ambiente. Después de lavar, añadir el anticuerpo de detección conjugado con HRP durante una hora y luego agregar el sustrato TMB.Finalmente, mida la absorbancia en un lector de placas ELISA a 450 nanómetros dentro de los 30 minutos posteriores a detener la reacción. Alor se ha utilizado como marcador para aislar células madre en múltiples malignidades, incluyendo las dos poblaciones enriquecidas en células madre cancerosas D cinco y SCC siete, específicamente como se demuestra en estos gráficos de puntos; las células positivas para Alor contribuyen aproximadamente al 0,5 % y al 5,2 % de las líneas celulares tumorales cultivadas D cinco y SCC siete, respectivamente. También se ha determinado que las células tumorales recién aisladas contienen un 2,5 % y un 4,2 % de células positivas para Alor provenientes de tumores D cinco y SCC siete establecidos in vivo, respectivamente.Se utilizaron células tumorales tratadas con el inhibidor específico A de LDH D-E-A-B-A como control negativo. La inmunogenicidad de las células madre cancerosas se evaluó examinando la inmunidad protectora contra el tumor inducida por las CSC TPC mediante el modelo de vacunación recién demostrado. Como se muestra en esta tabla, los ratones tratados con las H TPC presentaron menos metástasis pulmonares que los ratones tratados únicamente con PBS.Es importante destacar que los ratones tratados con PC de CSC-T tuvieron aún menos metástasis pulmonares que los animales tratados con H-T-P-D-C o PBS solamente. En el modelo SCC siete, los animales C3H normales fueron vacunados como se acaba de demostrar, en comparación con el grupo control. Las H-TPC indujeron una inmunidad antitumoral moderada, mientras que las CSC-TPC indujeron una inhibición significativa del crecimiento tumoral. Estos resultados indican que las CSC podrían utilizarse como una fuente de antígenos más eficaz para cargar las DC que las células tumorales tradicionales no clasificadas, con el fin de inducir inmunidad protectora frente al reto de células tumorales.Para comprender mejor los mecanismos subyacentes a la inmunidad anti-tumoral protectora inducida por las CSC, se activaron citoles procedentes de animales vacunados con DC y se midió su producción de citocinas mediante ELISA. Como se acaba de demostrar, hubo una producción significativamente mayor de citocinas por parte de los citoles obtenidos de animales vacunados con D cinco CSC TPC o S CCC siete CSC PC, en comparación con aquellos obtenidos de animales vacunados con D cinco H TPC o SCC siete HTC. Hoy has visto cómo utilizar el ensayo Alor para aislar células madre cancerosas.Estas células madre cancerosas luego pueden utilizarse para desarrollar inmunoterapias que empleen células dendríticas. Es nuestra esperanza que estas inmunoterapias, ya sea utilizadas por sí solas o en combinación con terapias existentes, mejoren el pronóstico para pacientes con muchos tipos de cáncer.

generation-novel-dendritic-cell-vaccine-using-melanoma-squamous

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra un ensayo de vacunación tumoral basado en células. Un ratón, inyectado por vía intradérmica con células de melanoma B16-F10 para la formación de tumores, es vacunado con células B16-F10 que secretan citocina Flt3L cerca del tumor desarrollado. El Flt3L secretado por la vacuna promueve la maduración y proliferación de las células dendríticas que luego presentan antígenos tumorales a las células T en los ganglios linfáticos, desencadenando una respuesta inmunitaria antitumoral...

Implantación tumoral e inyección de una vacuna tumoral en un modelo de ratón

El método más comúnmente utilizado para la generación de un gran número de células dendríticas autólogas (DC) para su uso en inmunoterapia tumoral se describe. El método utiliza la IL-4 y GM-CSF para diferenciar países en desarrollo a partir de monocitos. Las CD inmaduras son estimuladas para maduro y luego se cargan con antígenos antes de que se inyectan de nuevo en el paciente.

Preparación de las células dendríticas maduras cargadas con antígeno del tumor para inmunoterapia

En este artículo se describe la preparación de tejido de melanoma recién obtenido en cultivos de células primarias, y cómo eliminar contaminaciones de los eritrocitos y los fibroblastos de las células tumorales. Por último, se describe cómo...

Paciente celulares derivadas Cultura y aislamiento de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putativos células madre del cáncer de melanoma

El objetivo de este protocolo es mostrar el protocolo para reprogramar linfocitos infiltrantes de tumores de melanoma en células madre pluripotentes inducidas.

Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de melanoma humano linfocitos infiltrantes de tumores,

Este artículo describe un método novedoso para generar antígenos tumorales inducidos por células madre pluripotentes inducidas por antígenos timáticos (iTE) por un sistema de cultivo timico tridimensional (3D). iTE son un subconjunto homogéneo de células T estrechamente relacionadas con células T ingenuas con la capacidad de proliferación, formación de la memoria y supresión tumoral.

Un sistema de cultivo timático tridimensional para generar emigrantes timémicos específicos de células madre pluripotentes inducidos por la murino

El dispositivo o placa de transimmunización (TI) y los protocolos relacionados se han desarrollado para replicar las características clave de la fotoquimioterapia extracorpórea (ECP), en un entorno experimental, lo que permite la producción de células (DCs) para la inmunoterapia oncológica.

Nuevo protocolo para la generación de células dendríticas inmunogénicas fisiológicas

En este artículo se describe un método para generar un método para generar un antígeno tumoral funcional específico de antígeno pluripotente derivado de células madreCD8- + células T positivas únicas utilizando el sistema de cocultivo OP9/DLL1.

Uso de células madre pluripotentes inducidas por el hombre para la generación de células T específicas de antígenos tumorales

Aquí se presenta un protocolo para la supresión efectiva de la replicación del virus de la hepatitis B (VHB) en ratones mediante la utilización de la transferencia de células adoptivas (ACT) de linfocitos T específicos de antígeno viral derivado de células madre (Ag). Este procedimiento puede adaptarse para una posible inmunoterapia basada en ACT de infección por VHB.

Linfocitos T virales derivados de células madre suprimen la replicación del VHB en ratones

El protocolo presenta un modelo de inmunoterapia contra el cáncer utilizando la vacunación tumoral basada en células con melanoma B16-F10 que expresa Flt3L. Este protocolo demuestra los procedimientos, incluida la preparación de células tumorales cultivadas, la implantación del tumor, la irradiación celular, la medición del crecimiento tumoral, el aislamiento de las células inmunitarias intratumorales y el análisis de citometría de flujo.

Modelo experimental de inmunoterapia de melanoma utilizando vacunación tumoral con una citocina hematopoyética

Se presenta un protocolo único y completo para generar células dendríticas derivadas de monocitos humanos desialiladas (mo-DC) a partir de células mononucleares aisladas de sangre periférica (PBMC) utilizando un tratamiento con siaridasa. Además, se describen métodos para evaluar la caracterización fenotípica y funcional de las mo-DC y evaluar cómo el tratamiento con sialidasa mejora el nivel de maduración de las mo-DC.

Generación de células dendríticas derivadas de monocitos con diferentes fenotipos sialilados

Este protocolo describe la reprogramación in vivo de células cancerosas de ratón en células dendríticas tipo 1 dentro del microambiente tumoral a través de la expresión forzada de los factores de transcripción PU.1, IRF8 y BATF3.

Reprogramación intratable in vivo de células tumorales a células dendríticas convencionales tipo 1

Aprende a generar una vacuna de células dendríticas basada en células madre cancerosas para inmunoterapia antitumoral. Este método demuestra mayor eficacia inmunitaria que las vacunas tradicionales.

Generación de una nueva vacuna de células dendríticas usando melanoma y células madre escamosas del cáncer

Explorar más videos