Generación de una nueva vacuna de células dendríticas usando melanoma y células madre escamosas del cáncer

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la inmunidad antitumoral de una vacuna basada en células dendríticas (DC) derivadas de células madre cancerosas o CSC en un huésped inmunocompetente. Esto se logra primero aislado CSCs ALDH positivas de alta actividad de aldehído deshidrogenasa o A LDH a partir de células tumorales heterogéneas. En el segundo paso, se aíslan las DC derivadas de CSC y luego se estimulan con lisado para la vacuna.

A continuación, se administra el lisado de CSC que activa la DC o la vacuna DC TP a huéspedes inmunocompetentes normales y singénicos. Luego, en la etapa final, se evalúa la eficacia protectora antitumoral de la vacuna C-S-C-T-P-D-C. Finalmente, se puede realizar un ELI SA para evaluar la inmunidad antilisado de CSC inducida por la vacuna C-S-C-T-P-D-C mediante linfocitos T y anticuerpos del huésped.

Este proyecto reúne dos de las áreas más destacadas de la investigación del cáncer: la de las células madre cancerosas y la de la inmunoterapia tumoral. Nuestro laboratorio fue uno de los primeros en descubrir células madre cancerosas en tumores sólidos. Estas son las semillas del cáncer que impulsan su crecimiento y también la metástasis.

Lo que verá hoy es un nuevo enfoque que utiliza inmunoterapia para atacar específicamente a estas células madre del cáncer. Utilizamos un marcador particular llamado aldehído deshidrogenasa, que puede detectarse mediante el ensayo Alde fluoro. Verá a los doctores Lin Liu y Huon Tau trabajando junto con el Dr. Chow Lee.

Esperamos que al dirigirnos a estas células madre cancerosas, podamos mejorar el resultado para los pacientes con muchos tipos de cáncer. Comience suspendiendo las células tumorales de interés en tampón de ensayo alor a una concentración de un por diez elevado a seis células por mililitro. Luego transfiera todo excepto tres mililitros de las células tumorales a cada uno de los tubos de muestra y etiquete cuatro tubos de ensayo de control de poliestireno de 12 por 75 milímetros como sigue: sin teñir alor, ALOR más DEAB y siete A A D. Dispense un mililitro de la suspensión celular en los tubos sin teñir y siete A A D, y dos mililitros en el tubo alde floor.

Luego, agregue cinco microlitros de DEAB al tubo de ALOR más DEAB. Coloque los tubos en hielo y luego mezcle 10 microlitros de sustrato alor activado en el tubo de alor. Transfiera inmediatamente un mililitro de la solución de sustrato al tubo de ALOR más DEAB, y luego agregue dos microlitros de sustrato alor activado por cada millón de células a cada uno de los tubos de muestra.

Incube todos los tubos en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 30 minutos, y luego agregue cinco microlitros de siete A a D al tubo de siete A a D y un microlitro de siete A a D por cada millón de células a cada tubo de muestra. Mantenga estos tubos a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Centrifugue todos los tubos durante cinco minutos a 250 veces G a temperatura ambiente y reconstituya los sedimentos en tampón de ensayo Alde Fluor para clasificación de células activada por fluorescencia.

Para establecer las compuertas de clasificación, utilice las células alde Fluor más DEAB como control negativo y las células marcadas con siete A a D como control de viabilidad. Con base en estos controles, establezca una compuerta para distinguir las células positivas para alor A LDH, D cinco alto y SCC siete. Luego utilice esto para clasificar las células de la muestra en poblaciones positivas para alor A LDH, D cinco alto y SCC siete.

Para generar las células dendríticas, primero aísle los huesos del fémur y la tibia de un ratón C57 black six y de un ratón C3H. Esterilice los huesos en etanol al 75 % durante un minuto a temperatura ambiente y luego lávelos en HBSS. A continuación, corte los extremos de los huesos y utilice una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja de calibre 21 para lavar la médula ósea hacia un plato de Petri, aspire y desprenda las células varias veces para crear una suspensión de células individuales y luego centrifugue las células.

Incubar el precipitado en cinco mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos durante un minuto en un baño de agua a 37 grados Celsius. Después de contar las células, ajustar el volumen a uno por 10 a la seis células por mililitro en medio de cultivo suplementado con G-M-C-S-F e IL cuatro. A continuación, cultivar las células a 37 grados Celsius y 5%CO2, renovando el medio y las citocinas después de tres días.

El día cinco, recolecte las células dendríticas inmaduras. Después de centrifugar las células, resuspenda los pellets en cinco mililitros de medio de cultivo y luego superponga lentamente la suspensión celular sobre medio de aislamiento recién preparado. Tras centrifugar las células nuevamente, recoja las células dendríticas ubicadas entre las capas de medio de cultivo y medio de aislamiento.

Luego, tras contar las células, ajuste el volumen a una concentración de un por diez a la seis células por mililitro en medio de cultivo, suplementado con G-M-C-S-F e IL-4. Ahora, cree los lisados tumorales sometiendo las células ordenadas a cuatro ciclos de congelación y descongelación rápida, seguidos de centrifugación para recoger la fracción de membrana de los lisados. A continuación, pulse las DC con el lisado proveniente de las células autólogas A LDH alta ordenadas. Para preparar las CSC TPC.

Para preparar el pulso H-T-P-D-C, vacunar subcutáneamente a los animales receptores experimentales con cdc cargadas con lisado de células tumorales heterogéneas no clasificadas, inyectando una vez 1 × 10⁶ células pulsadas, suspendidas en 100 µL de PBS, en el flanco izquierdo de cada ratón. Tras la vacunación, administrar intravenosamente 1 × 10⁵ células tumorales D5 heterogéneas en 100 µL de PBS para desafiar a los ratones receptores C57BL/6. Para el modelo SCC7, desafiar subcutáneamente a los ratones receptores C3H con 1 × 10⁶ células tumorales SCC7 no clasificadas en 100 µL de PBS en el lado opuesto a la vacuna de cdc.

Crear una suspensión de células individuales a partir de los bazo de los ratones receptores C3H. Luego activar las células T y B esplénicas con anticuerpos monoclonales inmovilizados anti-CD3 y anti-CD28 en medio de cultivo suplementado con el estímulo adecuado. Tras cuatro días, recoger los sobrenadantes y recubrir placas de ELISA con anticuerpos contra interferón gamma, GM-CSF o IgG a cuatro grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, bloquear la unión no específica, añadir los estándares y los sobrenadantes recién recolectados, e incubar las placas a temperatura ambiente. Después de lavar, añadir el anticuerpo de detección conjugado con HRP durante una hora y luego agregar el sustrato TMB.

Finalmente, mida la absorbancia en un lector de placas ELISA a 450 nanómetros dentro de los 30 minutos posteriores a detener la reacción. Alor se ha utilizado como marcador para aislar células madre en múltiples malignidades, incluyendo las dos poblaciones enriquecidas en células madre cancerosas D cinco y SCC siete, específicamente como se demuestra en estos gráficos de puntos; las células positivas para Alor contribuyen aproximadamente al 0,5 % y al 5,2 % de las líneas celulares tumorales cultivadas D cinco y SCC siete, respectivamente. También se ha determinado que las células tumorales recién aisladas contienen un 2,5 % y un 4,2 % de células positivas para Alor provenientes de tumores D cinco y SCC siete establecidos in vivo, respectivamente.

Se utilizaron células tumorales tratadas con el inhibidor específico A de LDH D-E-A-B-A como control negativo. La inmunogenicidad de las células madre cancerosas se evaluó examinando la inmunidad protectora contra el tumor inducida por las CSC TPC mediante el modelo de vacunación recién demostrado. Como se muestra en esta tabla, los ratones tratados con las H TPC presentaron menos metástasis pulmonares que los ratones tratados únicamente con PBS.

Es importante destacar que los ratones tratados con PC de CSC-T tuvieron aún menos metástasis pulmonares que los animales tratados con H-T-P-D-C o PBS solamente. En el modelo SCC siete, los animales C3H normales fueron vacunados como se acaba de demostrar, en comparación con el grupo control. Las H-TPC indujeron una inmunidad antitumoral moderada, mientras que las CSC-TPC indujeron una inhibición significativa del crecimiento tumoral. Estos resultados indican que las CSC podrían utilizarse como una fuente de antígenos más eficaz para cargar las DC que las células tumorales tradicionales no clasificadas, con el fin de inducir inmunidad protectora frente al reto de células tumorales.

Para comprender mejor los mecanismos subyacentes a la inmunidad anti-tumoral protectora inducida por las CSC, se activaron citoles procedentes de animales vacunados con DC y se midió su producción de citocinas mediante ELISA. Como se acaba de demostrar, hubo una producción significativamente mayor de citocinas por parte de los citoles obtenidos de animales vacunados con D cinco CSC TPC o S CCC siete CSC PC, en comparación con aquellos obtenidos de animales vacunados con D cinco H TPC o SCC siete HTC. Hoy has visto cómo utilizar el ensayo Alor para aislar células madre cancerosas.

Estas células madre cancerosas luego pueden utilizarse para desarrollar inmunoterapias que empleen células dendríticas. Es nuestra esperanza que estas inmunoterapias, ya sea utilizadas por sí solas o en combinación con terapias existentes, mejoren el pronóstico para pacientes con muchos tipos de cáncer.